4.1. Khao sát hoạt tính sinh hoc của các chủng xa khuẩn hiếm
4.1.1. Hoạt hóa
Các chủng xạ khuẩn hiếm được hoạt hóa trên môi trường ISP2. Sau 7 ngay tạo ra các khuẩn lạc đơn đặc trưng. Đĩa hoạt hóa thuần không bị tạp nhiễm.
Hình 4.1. Các chủng xạ khuẩn hiểm được hoạt hóa trên môi trường ISP2.
1. Chung xạ khuan hiếm VI; 2. Chung xạ khuẩn C1; 3. Chung xạ khuân AI.
4.1.2. Tăng sinh
Sau khi hoạt hóa các chủng, lấy khuẩn lạc đặc trưng cho vào bình chứa Gause I, lắc ở tốc độ 120 rpm. Sau 3 ngày, nhận thấy dịch tăng sinh lần lượt có màu cam nhẹ, sinh khối mịn (C1), màu vàng, sinh khối mịn (VI) và trắng đục, sinh khối mịn (A1).
Mục đích của việc tăng sinh là giúp xạ khuẩn tăng sinh tốt. Vì thé khi chuyển sang môi trường lên men thì sẽ phát triển nhanh. Nhờ đó tạo điều kiện cho việc sinh ra các hợp chất thứ cấp.
18
4.1.3. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học
Bảng 4.1. Bảng phân hạng đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn hiếm đối với các VSV kiểm định
Neo Phy Fus Can VỊb E.co Sta Cl 4,83°+0,28 - - 576° 40.68 4,23°+068 - :
AI 3/13+032 - : : : - - Số liệu đường kính vòng kháng khuẩn là giá trị trung bình cia ba lan lặp lại. Trong
cùng một cột, các giá trị có ký tự theo sau (chữ cải in thường) các chữ cái khác nhau
thể hiện sự sai khác biệt về ý nghĩa thông kê ở độ tin cậy 95% theo kiểm định Turkey
(P = 0,05).
Kết quả khảo sát hoạt tính cho thay, xạ khuẩn hiếm C1 có kha năng kháng với nam Neo và Can so với V1 và A1, kháng yếu với vi khuẩn Vib và không kháng với vi khuẩn Eco va Sta. Từ ba chủng xạ khuẩn hiếm, khảo sát hoạt tính kháng với các vi sinh vật thì xạ khuẩn hiếm C1 thé hiện hoạt tính kháng tốt nhất so với hai chủng còn lại là Al và V1. Khi được tăng sinh trong môi trường Gause I với nguồn carbon là tinh bột, chủng xạ khuẩn hiếm Cl thể hiện hoạt tính kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nhóm vi khuân gram âm, ky khí tùy nghi). Theo Wagman và Weinstein (1980), hai nhóm xạ khuẩn Micromonospora purpurea NRRL 2953 và
Micromonospora echinospora NRRL 2985 đã tạo ra kháng sinh gentamicin thuộc nhóm khang sinh aminoglycoside đã được chú ý từ năm 1963. Gentamicin có khả
năng kháng khuân bằng cách ức chế giai đoạn đầu trong quá trình tổng hợp protein của vi khuân. Gentamicin có hoạt tính diệt vi khuẩn gram âm và gram dương.
Do đó sẽ chon chủng xạ khuẩn hiếm C1 để thực hiện khảo sát các loại môi
trường lên men ở nội dung 2.
4.2. Khảo sát môi trường lên men tối ưu cho chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng
4.2.1. Khảo sát tốc độ lắc và môi trường lên men ảnh hưởng tới quá trình tạo hợp chất thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm C1
Dịch tăng sinh sẽ được sẽ hút qua các bình chứa môi trường khác nhau và lên
men ở các tốc độ lắc khác nhau như trong Bảng 3.2. Sau 10 ngày thì các hình thái của
dịch lên men sẽ được ghi nhận như trong Bảng 4.2 và Hình 4.3.
19
Bảng 4.2. Bảng mô tả đặc điểm dịch lên men ở các nghiệm thức khảo sát Môi trường Tốc độ lắc Màu sắc dịch Sinh khôi
(cpm)
Pm43 120 Cam nâu Có hạt li tt 150 Cam Có hat li ti 120 Mau vang Min
Faas? 150 Vang nau Min
Pm4 120 Nau sam Co hat li ti
150 Cam Dac
Bang 4.3. Bang so sánh thành phan các loại môi trường lên men xạ khuẩn hiếm Môi trường Thành phần môi trường
Nguồn Cacbon Nguồn Nitơ Khoáng
Pm4 Epes fp Bot dau nanh Trace elementrix ]
D-manitol
Pm39 TH Pepin all a a
: Cao malt Zn”', Mg”' Cao malt
Glucose Cao malt
Pm43 Cao malt Trace elementrix 1 k Cao nam men
Cao nam men
Đặc điểm hình thái của dich lên men chủng xạ khuẩn hiếm C1 ở các môi trường Pm4, Pm43, Pm39 có sự khác biệt được quan sát cảm quan. Ở môi trường Pm4, dịch có màu vàng sam chuyên sang màu nau sam, có hạt li ti, không đặc và không nhớt.
Môi trường Pm43 từ dịch màu vàng chuyển sang màu cam, cam nâu, có hạt li ti, không đặc. Trong khi đó thì môi trường Pm39 từ dịch màu trắng chuyền sang màu vàng, có sinh khối mịn. Có sự khác biệt như trên là do các môi trường có thành phần nguồn cacbon, nguồn nito và khoáng chất khác nhau, nên có thé xạ khuẩn hiểm sử dụng con đường chuyên hóa khác nhau và tạo ra sản phẩm khác nhau.
20
Hình 4.3. Bình lên men xạ khuẩn hiếm C1 ở các nghiệm thức khảo sát
sau 10 ngày lên men.
1.Pm4_150; 2.Pm4_120; 3.Pm39_150; 4.Pm39_120; 5.Pm43_150; 6.Pm43_120.
4.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tinh sinh học của xạ khuẩn hiếm C1 sau khi lên men Dịch lên men thu được sau khi lên men ở các điều kiện khác nhau. Kết quả sẽ thu được 18 dịch lên men tương đương với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Các dịch này sẽ được sử dụng để thử hoạt tính kháng nắm gồm Neo, Fus, Phy, Can và hoạt tính kháng khuân bao gồm các vi sinh vật kiểm định: Vib, Eco, Sta theo phương pháp khuếch tán dịch nuôi. Kết quả thử hoạt tính của các nghiệm thức được ghi nhận la đường kính vòng kháng khuẩn (trong đó đường kính của lỗ thạch là 6 mm) và được thể hiện ở Bảng 4.4, phụ lục 3 và phụ lục 4. Tiêu chí chọn điều kiện lên men là dựa vào nghiệm thức có kết quả kháng tốt nhất.
21
Bảng 4.4. Bảng phân hạng đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nam của các nghiệm thức đối với các VSV
Neo Fus Phy Can Vib Eco _ Sta Pend 120 - sa 5,467 +0,55 7,03°+0,25 7,967 + 0,25 + -
150 - - - 5,73” + 0,25 # - -
ia x : : : ‡ : : Pm43 150 - - _ _ : - ơ
120 - - - -
Pm39 lạo - : - 6,03° + 0,25 : : -
Số liệu đường kính vòng kháng khuẩn là giá trị trung bình cua ba lan lặp lại. Trong
cùng một cột, các giá trị có ký tự theo sau (chữ cải in thường) các chữ cái khác nhau
thể hiện sự sai khác biệt về ý nghĩa thông kê ở độ tin cậy 95% theo kiểm định Turkey
(P= 0,05).
Kết qua thử hoạt tinh cho thấy chủng C1 khi lên men ở môi trường Pm4 ở 2 tốc độ lắc 120 rpm cho hiệu suất kháng tốt hơn các nghiệm thức còn lại. Ở hai tốc độ lắc khác nhau, có thấy sự khác biệt về kha năng kháng. Điều này thé hiện ở đường kính
vòng kháng, nghiệm thức Pm4 120 sẽ có đường kính kháng lớn hơn 2 mm so
Pm4 150 ở VSV kiểm định là nam C. albicans. Đồng thời ở tốc độ lắc 150 rpm dich lên men sẽ không có hoạt tính kháng nắm và kháng khuẩn nhiều như ở tốc độ lắc 120 rpm. Trong môi trường Pm4, nguồn cacbon và nitơ đều từ bột đậu nành - đây là thành phần được sử dụng trong việc lên men thu nhận hợp chất có khả năng kháng từ xạ khuẩn bởi bột đậu nành được chuyền hóa chậm, làm tăng khả năng tạo hợp chất thứ cấp. Như vay, chủng xạ khuân hiếm C1 đã sử dụng tốt nguồn dinh dưỡng này dé tạo ra hợp chất có khả năng kháng.
Đối với môi trường Pm43, dịch lên men ở các nghiệm thức không cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nam. Điều này cho thấy, môi trường Pm43 không phải là môi trường thích hợp dé kích thích sự tạo hợp chất có khả năng kháng của chủng xạ khuân hiếm Cl.
Trong môi trường Pm39, chủng xạ khuẩn hiếm C1 cho hoạt tính kháng nam tương đối với C. albicans và không kháng đối với các VSV kiểm định còn lại. Trường hợp lên men chủng C1 trong môi trường Pm39 cũng cho thấy sự khác biệt hoạt tính kháng ở hai tốc độ lắc khác nhau. Nghiệm thức Pm39_ 150 cho vòng kháng khuẩn tốt hon ở nghiệm thức Pm39_120. Như vậy, khi thành phan môi trường lên men thay đổi, nguồn nitơ không phải từ bột đậu nành mà từ peptone, cao malt và nguồn cacbon là
22
glucose thì có thé chủng xạ khuẩn C1 đã sử dụng các con đường chuyển hóa khác nhau để tạo hợp chất có hoạt tính sinh học. Vì thế nhu cầu sử dụng oxi cũng khác nhau Với kết quả trên, cho thấy chủng xạ khuẩn hiếm C1 sử dụng tốt nguồn nitrogen là bột đậu nành và nguồn carbon là D - manitol. Môi trường Pm4 với tốc độ lắc 120 rpm là điều kiện phù hợp nhất trong các nghiệm thức dé chủng xạ khuẩn hiếm C1 tạo hợp chất có hoạt tính kháng. Do đó nghiệm thức Pm4_120 được chọn để tiến hành thực hiện cho nội dung tiếp theo.
Nguồn carbon có ảnh hưởng rất lớn đến việc xạ khuẩn hiếm tạo ra hoạt chất thứ cấp. Hoskisson (2003) từng nghiên cứu về việc hấp thụ nguồn cacbon trong việc tạo ra hợp chất thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm Micromonospora echinospora bị ảnh hưởng khi có sự xuất hiện của amino acid. Nghiên cứu này đã cho thấy rằng sự hấp thụ glucose, một nguồn cacbon chính cho nhiều quá trình lên men kháng sinh, bị giảm đáng kể khi có sự xuất hiện của amino acid. Thực tế này cho thấy tầm quan trọng trong việc lựa chọn các nguồn cacbon và nito cho quá trình lên men sinh các hợp chất thứ cấp.
4.3. Thu nhận hợp chat có khả năng kháng khuẩn va nắm bệnh
Hình 4.4. Cao chiết sau khi cô quay.
1 Cao chiết của PE; 2 Cao chiết của EA; 3 Cao chiết của MC.
Dịch lên men của nghiệm thức Pm4_ 120 sau khi được xử lí theo quy trình tách
chiết (Hình 3.1). Ly tâm dich lên men, tách riêng phan sinh khối và dich lỏng. Dich lỏng sau khi được lắc với dung môi ethyl acetate, các chat có tính phân cực được tách thành lớp nằm ở phía trên và lớp dưới là pha tan trong nước (chủ yếu là môi trường lên men). Tách lấy phần dịch phía trên có màu cam được thu được cao chiết EA. Ethyl acetate được coi là một trong những dung môi hữu cơ tương đối ít độc hại, đễ loại bỏ do có nồng độ bay hơi cao và là dung môi được dùng phô biến trong tách chiết nhiều chất hóa học. Ngoài ra thì ethyl acetate hiện đang được sử dụng trong nhiều nghành công nhiệp trong đó có cả công nghiệp thực phẩm (làm bánh kẹo).
23
Sinh khối sau khi được phá tế bào bằng sóng siêu âm, lắc trong methanol và đem đi ly tâm dé loại bỏ cặn, giữ lại các hợp chat có trong nội bảo. Tiến hành lắc với petrolium ether, tạo thành hai lớp. Lớp phía trên là các chất không phân cực, có màu vàng nhạt. Dung môi petrolium ether là dung môi không tan trong nước rất đễ bay hơi, đóng vai trò là dung môi không phân cực cho dầu, chất béo, sáp. Khi lắc với petrolium thì các chất không phân cực sẽ tan trong dung môi không phân cực, được kéo lên và tạo thành lớp ở phía trên. Lớp dưới là dung môi methanol, đóng vai trò là chất phân cực mạnh, hòa tan các hợp chất có tính phân cực và phân cực mạnh. Lớp bên dưới có
mau vang nâu.
Các cao chiết sau cô quay có nồng độ lần lượt là 40 000 ppm (MC), 20 000 ppm (PE) và 80 000 ppm (EA) sẽ được pha loãng với nước cất 10 lần và tiến hành cho
đôi kháng với các v1 sinh vật kiêm định.
18
E 16
= 14
fo)]
=
Ww 12
bơm pg
m 10
5 MEA
> 8
£ . m@ MC
4 mPE
2 4
ce}
5
@ 2
0
Vib Eco Sta Can Neo Phy Fus
Vi sinh vật kiểm định
Hình 4.5. Biéu đồ biểu diễn vòng kháng của các cao chiết sau khi cô quay.
Kết quả thử hoạt tính thé hiện ở Hình 4.5 và phụ lục 5, phụ lục 6 cho thấy cao chiết chiết với dung môi ethyl acetate kháng mạnh với vi khuẩn S. aureus. Zang va ctv phân lập từ một loài Micromonospora sp. được 2 hợp chat là Micromonohalimanes A và B có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureusn kháng methicilin.
Cao chiết chiết với dung môi ethyl acetate có hoạt tính kháng với nam C. albican, kháng tương đối với vi khuẩn #. coli và V. parahaemolyticus. Trong đó thì kết quả kháng với nam C. albican và vi khuẩn V. parahaemolyticus tương quan với kết quả
24
thử hoạt tính của môi trường lên Pm4_ 120 trong thí nghiệm khảo sát điều kiện lên men của xạ khuẩn hiếm Cl.
Cao chiết với dung môi methanol kháng tương đối với nam C. albicans va vi khuẩn S. aureus, kháng rất yếu với vi khuân V. parahaemolyticus. Các hợp chat ở cao chiết PE hầu như sẽ không kháng với các VSV. Cả ba cao chiết của xạ khuẩn hiếm Cl chiết với các dung môi khác nhau đều không có hoạt tính kháng với các loại nam N.
dimiatum, Phytophthora sp. và F. oxysporum.