Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của liều chiếu xạ gamma tới khả năng sinh enzyme protease của vi khuẩn Bacillus sp

Protease có tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực nên thu hút được nhiều mối quan tâm của nhiều nhàkhoa học và các công ty hóa dược trên thế giới.. Protease cũng được ứng dụng t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHAO SÁT ANH HUONG CUA LIEU CHIEU XA GAMMA

TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE

CUA VI KHUAN Bacillus sp.

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : NGUYÊN THỊ THU TRANG

Mã số sinh viên : 19126195

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 8/2023

BỘ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT ANH HUONG CUA LIEU CHIEU XA GAMMA

TỚI KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE

CUA VI KHUAN Bacillus sp.

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

ThS Võ Thị Thúy Huệ Nguyễn Thị Thu Trang

KS Nguyễn Minh Quang

TP Thủ Đức, 08/2023

2

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian làm dé tài tốt nghiệp tại phòng Nam ăn và Nam Dược liệu,

Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, em đã hoàn thành khóa luận

tốt nghiệp không chỉ dựa vào sự cố gang của bản thân ma còn nhờ vào sự giúp đỡ,

hỗ trợ tận tình của mọi người xung quanh.

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường Ban chủ nhiệm KhoaKhoa học Sinh học Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ

em hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Võ Thị Thúy Huệ và KS NguyễnMinh Quang đã tận tình chỉ bảo, động viên, giúp đỡ và dành nhiều thời gian, côngsức hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu vàNano — Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiệngiúp đỡ em trong quá trình thực hiện chiếu xạ

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Phan Hữu Tín cùng các anh, các chị, các bạn,các em phòng Nam ăn va Nam Dược liệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh đã hết lòng giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã ủng hộ và là chỗ dựa tinh thầntrong khoảng thời gian qua.

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn đến tất cả mọi người

Tp Thủ Đức, tháng 8 năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Trang

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Thị Thu Trang, MSSV: 19126195, Lớp: DH19SM thuộc

Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin camđoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các nội dungnghiên cứu, kết quả trong khóa luận này là trung thực và khách quan Nếu có bất kì

sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình

Tp Thu Dic, thang 8 năm 2023

Sinh vién

Nguyễn Thị Thu Trang

TÓM TẮT

Protease là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng, được ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống Vi sinh vật, đặc biệt là Bacillus là

nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất protease quy mô lớn nhờ việc nuôi cấy

đơn giản và thu sản phẩm dé dàng Nghiên cứu nay được thực hiện nhằm mục tiêu

sàng lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh tông hợp protease cao bằng chiếu xạgamma Sau chiếu xa, ty lệ sống sót, dải liều tối ưu tạo đột biến sinh protease cao vàliều chiếu tạo đột biến sinh protease cao ở 2 chủng Bacillus được xác định Hoạttính enzyme của chủng thuần và chủng sau đột biến được xác định bằng phươngpháp cấy điểm trên đĩa thạch chứa cơ chất casein Kết quả cho thấy cả 4 chủngBacillus thuần chủng đều có khả năng sinh protease, cao nhất là 2 chủng Bacillusvelezensis (BS1) và Bacillus licheniformis (BL4) với đường kính vòng phân giải lầnlượt là 19,75 mm và 27,15 mm Sau chiếu xạ, khả năng sống sót của 2 chủngBacillus bị ảnh hưởng nhiều bởi bức xạ gamma, tỷ lệ sống sót của vi khuẩn giảmdần khi liều bức xạ tăng Tan số đột biến dường như cao hơn ở khoảng liều 1 - 1,25kGy và cao nhất tại liều 1 kGy, lặp lại ở cả 2 chủng Ö velezensis (BS1) và B.licheniformis (BLA) lần lượt là 36,67 % va 40 % Bốn khuẩn lạc từ 2 chủng BS1 vàBL4 sau chiếu xạ sang lọc được có kha năng sinh protease vượt trội và ồn định ítnhất sau 3 thé hệ Như vậy, xử lý chiếu xạ gamma là phương pháp gây đột biến hiệuquả trong nâng cao khả năng sinh protease cua Bacillus.

Từ khóa: Bacillus sp., casein, protease, bức xa gamma.

Protease is one of the important industrial enzymes, applied in many areas

of production and life Microorganisms, especially Bacillus, are suitable sources of raw materials for large-scale protease production thanks to simple breeding and

easy product harvesting This study was conducted with the aim of screening

Bacillus strains with high protease production by gamma irradiation treatment After irradiation, the survival rate, the optimal dose range for protease-producing mutants and high-protease-producing mutant doses in 2 Bacillus strains were determined The enzyme activity of initial strains and post-radiation strains was determined by point implantation method on the casein-containing discs The results showed that all four original Bacillus strains were capable of protating, with the highest two strains of Bacillus velezensis (BS1) and Bacillus licheniformis (BL4) with a clear zone diameter of 19,75 mm and 27,15 mm, respectively The

viability of Bacillus strains was much affected by gamma radiation and the survival

rate of bacteria decreased with the increasing dose The rate of high producing mutation in two kinds of Bacillus strains seems to be greater at the dose range of 1 — 1,25 kGy and the highest at the dosage of 1 kGy, recurring in both B velezensis (BS1) and B licheniformis (BL4) strains was 36,67% and 40%, respectively Four bacteria from the two strains BS1 and BL4 following screening radiation were able to produce superior and stable proteases after at least three generations Thus, gamma radiation treatment is an effective mutant method in

protease-enhancing the protease bioactivity of Bacillus.

Keywords: Bacillus sp., casein, protease, gamma radiation.

MỤC LỤC

Kết SDIEEoseiieosdbiordbseostzsopsitEbolbrsi8oiodkorStc3gg5)695805080g0g1015i08200084p0a605/0 xe iXÁC NHAN VA CAM DOAN u sssssssssessessessessessessessessessvssessessessesseeseseessssseeseeseeeees ii(| iii

TAN Biot WAN Gd Nee Meee rear eee ere me eer te er ere err cei 1V

IIATIE; BE CHẾT WEE 1T,1TTssesosssetezsooratigcondgpbeessoĐSkeogtgD0n0s29g80xe13006xsidgltcogeimol vii

ES ee viiiSCR! 5# i0 TP NG TỶ cc a ere ix

ee |L2 Ni tiêu của để TAL sec se dà nh c4 41H ts thanvexssavesesavnsnecastssavessustuvevesamistestutuvts 21.3 [0001615704811 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-22 2£ 22E22EE+EE22EE2EE22EE+EEzzeee 3

2.1 Giới thiệu chung về enzyme prOfease - 22 2+S22E‡SE2E2E2EE2EE2E222222222222222e 3Del id EZ VEINS PEO CCAS PS ốốốố ốc 3 2.1.2.Phan loai enzyme protease 0 32.1.3 Ngu6n thu enzyme prof€ase -¿- 2: ©2¿22222E22E22EE22E2221221222122121122121 2e 52.1.4.Ứng dụng của enzyme protease ccccccessessessessessessecsecsessecsessessecsessecseeseeses 62.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Sp cc.ccccsesssessesssessesssessesssssessesssessecstsssesseesses §2.2.1.Lịch sử phát hiện và phân loạI - 2 5-5222 * 22132 22E£+EESEE+EEsrrrsrersrrsrrrrers 82.2.2 Đặc điểm các chủng Bacillus c.ccccccsessessessessssssssesessesrsersssssnseseeresreenesnseneesee §2.2.3.Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy - 2-52 522xc2x22xczxecxee 102.2.4.Các yếu tô ảnh hưởng tới sinh tổng hop protease ở 8acilÏws - 112.3 Ứng dung bức xa ion hóa trong gây đột biến ở vi sinh vật 2: 13CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU l63.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22-©222222+222+222E+222E2EExrrrrrerrrree 163.2 Vật liệu và thiết Di ecccccccccceccecsessessessessessessessessessessessessessessesseseeseetsesseesess l6

Suda oN uyên VỆ HỆ -sseissssbssrtiogiiotditsSTDESEENGGEES-2SGS093038000801GH83355059018/Q0HN/S83709/000100363898 16

3.2.3.Thiết ị - - 5 5 2 2 15212112121121121111211211121121111111111211211112112111 21211 rêu 163-3: Phuong: phapmehien CU Wsscsas:sssess axeeaseenssecisee ese EES 173.3.1.Bảo quản và giữ 216109 cece cccccceccsccssessessessesssesseesueesessesssesieesuseeesstesseseeeees 173.3.2.Khảo sát khả năng sinh enzyme protease bằng phương pháp cấy chấm điểm

trên đĩa thạch NA có chứa cơ chất caseim ¿2 + +E+Ex+E2E£EEEEEEEEEEEEEeExerrrei 17

kkcicP9.(0i 09010 88 á.44 183.3.4.Xác định số lượng tế bào vi sinh vật - 2-22 ©22222222222E2222zvzrxrrxrerree 183.3.5.Sang lọc các khuẩn lạc sinh protease cao từ 2 chủng Bacillus bằng xử lý chiếu

BE -“'etSlsftltineodotoeSloiontisltLooliEnkinfoligl2EcoiSOWERAGEGBĐSSESOSDBSSARUMGEREHISSMMoSMEVEAIVASMGUEEOMODSRESBDIONEBEASSJ-ỂDNSSLEE 193.3.6.Xử lý số liệu -¿- 2¿©22222222222122112212711211221211211211211221211211 21211 cv 19

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 2 2+2E2222EE22E2£Ezzxzzxerxee 20

4.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh protease cao làm nguyên

Nenchi6y sca ĐT Hb1xesotietiseiuentGEBERIGGRIDISHISRDIRGHSIHINRIGBIISGNSNSSEINGSEDENOgpsubag 20

4.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót và khả năng sinh tổng hợpprotease tới hai chủng vi khuẩn Öa€i]Ïuis -52- 55 52522S+22E22E22Ec2Ezzxzzxzzxczxcree 214.2.1 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xa tới khả năng sống sót của vi khuẩn Bacillus 214.2.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh tông hợp protease của haichủng vi khuẩn Ö4iÏÏuus -©22©2252222222S222+2EE22E222122312212712221221 22122122 czxe 244.2.3 Đánh giá sự ôn định khả năng sinh enzyme protease của các khuẩn lạc tiềmnang sau ba thé II ‹‹“-+ŒÀ Ẽ 26

EEITDRIGS ESE cll TA TIẾT NET ennensnnasnnsenonruointnnontonttnisiistintgtirdrntsgmgi 30

5.1 Kết luận + 2-52 s21 E12522121121271211111121121110111111211122 212102211211 errey 30

5.2 DG ghd ooo 30

TAI LIEU THAM KHAO 2 00.ccccccccccscescssessesecseseesecsesecsessessesscsesscsesesseseseeseseesseseeeeees 31PED) Cá ss eseesmesxsrsuespaoncons nn uses ns ssmc-sanct sinus ss sti acini eas eS aR SUNS DSN ERAD 33

vi

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

NA : Nutrient Agar

NB : Nutrient Broth

MR : Metyl Red

VP : Voges Proskauer

TSA : Trypticase Soy Agar

TSB : Trypticase Soy Broth

EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Sp : Species

CFU : Colony Form Units

DNA : Deoxyribonucleoic Acid

vii

DANH SÁCH BANG

Bang 2.1 Phản ứng sinh hóa của vi khuân ÖaeilÏus -5-22-552552552255z55522 10Bảng 3.1 Các chủng Bacillius có khả năng sinh tông hợp protease - 16Bang 4.1 Kích thước vòng phân giải casein của 04 chủng vi khuan Bacillus 20Bang 4.2 Kết quả khảo sát khả năng sống sót 2 chủng vi khuẩn Bacillus tại cácliều chiếu sau 24 giờ nuôi cấy 2-22 2+2 +22122E222122112212212231221211221 21 22xe2 22Bảng 4.3 Tan số đột biến sinh protease cao của 2 chủng vi khuẩn Bacillus tại

các liều chiẾU Xạ - 2 2+S2+SSS2E£EE921223221211712111111111111111111111111 11 c0 24Bảng 4.4 Kích thước vòng phân giải của 5 khuẩn lạc có khả năng sinh proteaselớn nhất của 2 chủng vi khuẩn Öaciluus À 2:22 252©5222<c2xSEerxerreerxerrerrree 27Bảng 4.5 Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme protease của 5 khuẩn lạc vượttrội từ hai chủng Bacillus ở thé hệ thứ hai - 2-52 5222S22E£EE£EE22E22E2E 2xx crxcrev PaBang 4.6 Kích thước vòng phân giải casein của các khuẩn lạc tiềm năng từ chủng

ví khuẩn BSI sau 5 thể DB osscsccesscecsessovessesecsesussserveaveswssiavesavsionusveseuvenneseevsveevevevswesens 29Bảng 4.7 Kích thước vòng phân giải casein của các khuẩn lạc tiềm năng từ chủng

vi khuẩn BL4 sau 3 thế hệ 2-22 +2+SS+S+E£EE£EE2EE2122125212212112122121121112121 1 XE 29

viii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Protease thủy phân protein thành các amino acid . .ŸHình 2.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus quan sát đưới kính hiển vi 10Hình 4.1 Vòng phân giải casein của 04 chủng vi khuẩn Bacillus sau 48 giờ nuôipee ie ela eae Cae: nuengnurnrggienehongiaosgtoicboy6iSx6ee8E06880000080056101G00G0/019380) 20Hình 4.2 Các ống nghiệm chứa huyền dịch tế bảo của 2 chủng vi khuan BacillusSCRE OPT E3 RA 21Hình 4.3 Mật số vi khuẩn sau chiếu xạ của 2 chủng vi khuẩn Bacillus sau 24 giờ 23Hình 4.4 Vong phân giải casein của các khuẩn lạc sinh protease cao nhất 27

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

để tạo thành peptide ngắn hơn và các amino acid Protease có tiềm năng ứng dụng

to lớn trong nhiều lĩnh vực nên thu hút được nhiều mối quan tâm của nhiều nhàkhoa học và các công ty hóa dược trên thế giới Protease cũng được ứng dụng trong

việc xử lý môi trường, giúp phân giải protein có trong các loại rác thải sinh hoạt,

rác thải được thải ra từ các khu chợ như các loại phụ, phế phẩm cả cá tra, v.v

Các enzyme phân giải protein xuất hiện phô biến được tìm thấy trong tat cảcác sinh vật sóng và rat cần thiết cho sự phát triển của tế bao Các protease ngoạibào các giá trị thương mại và có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệpkhác nhau.

Mặc dù nguồn vi sinh vật dé sản xuất protease có rất nhiều nhưng chỉ một số

it được công nhận dé sản xuất protease ở quy mô công nghiệp (Gupta và ctv, 2002)

Trong đó, Bacillus nhw Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, Bacillus licheniformis,

Bacillus megaterum, chiêm ưu thé trong lĩnh vực công nghiệp, là nguyên liệu thíchhợp để sản xuất protease ở quy mô lớn nhờ việc thu nhận sản phẩm dé dàng, điềukiện nuôi cấy đơn giản và có tính 6n định ở điều kiện pH và nhiệt độ cao Tuynhiên, trong tự nhiên năng suất sinh enzyme protease của Bacillus không cao vi vậyviệc tạo ra các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease cao bằng xử lý chiếu xạgamma là một lựa chọn thích hợp (Olajuyigbe và Ajele, 2005).

Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinhvật và nằm trong khoảng từ 10''9° đến 10° Tỉ lệ nay có thé tăng một cách rõ rệtbằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thé lên đến

10° đến 10 (Davati và ctv, 2013) Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biến

ngẫu nhiên và đột biến định hướng Đột biến ngẫu nhiên thường được tạo ra bằngcác phương pháp vật lý và hóa học (Malik, 1997) Các tác nhân vật lý như: các tia

X, tia y, a, B, neutron có bước sóng ngăn nên có kha năng ion hóa va khả nang

xuyên sâu cao Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA,thay đôi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chat có hoạt tính không 6n địnhlàm biến đổi DNA Bức xạ ion hóa có thé tạo ra đột biến tại những vị trí xác địnhnhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vat (Awan, 2011) Trong nghiên cứu năm 1999,Yoon ki-Hong và ctv đã chiếu xạ chủng Bacillus sp 79 - 23 bằng bức xạ gammatrên nguồn Co-60 với dai liều từ 0,5 đến 5 kGy Kết quả 7 chủng đột biến có khảnăng sinh CMCase đã được lựa chọn sau chiếu xạ Hoạt tính enzyme CMCase củanhững chủng đột biến thu được thường cao hơn chủng thuần từ 1,5 đến 2 lần.

Như vậy, việc xử lý chiếu xạ có thé giúp tăng khả năng sinh tổng hop

enzyme protease cao hơn so với chủng thuần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực

tiễn của nghiên cứu vì lý do đó, mà tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnhhưởng của liều chiếu xạ gamma tới khả năng sinh enzyme protease của vikhuẩn Bacillus sp.”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Sang lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme proteasecao bằng chiếu xạ gamma

1.3 Nội dung thực hiện

Sang lọc một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính sinh enzyme protease

Đánh giá hiệu quả của xử lý chiếu xạ tới Bacillus và khả năng sinh tổng hợp

enzyme protease.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về enzyme protease

2.1.1 Enzyme protease

Protease là enzyme thủy phan liên kết peptide giữa các amino acid của phân

tử protein tạo thành peptide mạch ngắn hơn và amino acid (Hình 2.1) Protease đãđược nghiên cứu và ứng dụng sớm và rất nhiều trên thế giới, trong đó sớm nhất làprotein tiêu hóa Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học người Pháp, Reaumur đã bắt đầunghiên cứu khả năng tiêu hóa thịt trong dạ dày và sau đó Schwann đã gọi chất này

là pepsin, sau đó loại protease thứ hai được tìm thấy trong dịch tụy là trysin

Hinh 2.1 Protease thuy phan protein thanh cac amino acid.

2.1.2 Phan loai enzyme protease

Protease đã được chia thành hai loại: endopeptidase va exopeptidase (López-Otín và Matrisian, 2007).

Exopeptidase: Dựa vào vi trí tác động trên mach polypeptide được chia thành hai loại:

Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do củachuỗi polypeptide đề phóng ra các amino acid đơn lẻ, dipeptide hoặc tripeptide

Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu cacboxyl của

chuỗi polypeptide và giải phóng ra các amino acid đơn lẻ hoặc dipeptide.

Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase được

chia thành 5 nhóm:

Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động

là -OH của serine Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase(Lopez-Otin và Matrisian, 2007) Nhóm subtilisin gồm hai loại enzyme là subtilisin

Carlsberg và subtilisin BPN Các serine protease thường hoạt động mạnh ở pH 9 —

11 và có tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động làcysteine Nhóm này bao gồm protease thực vật như papayin, bromelin, một vài

protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín và Matrisian, 2007) Các

cysteine protease thường hoạt động ở pH trung tính, có đặc hiệu co chất rộng

Aspartic protease: Hầu hết thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các

enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathesin, rennin (Lopez-Otin và Matrisian,

2007) Các aspartic protein thường có hai gốc aspartic acid bảo thủ tham gia xúc tácnằm trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH axit

Threonine protease: Cac threonine protease tương tự như serine protease

nhưng chúng chứa gốc xúc tac là amino acid threonine trong trung tâm hoạt động

Cơ chế phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với protein

thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động tạo ra các amino

acid đơn lẻ hoặc dipeptide (Lopez-Otin và Matrisian, 2007).

Metallo protease: Là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuan, nam mốc

cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Phân biệt với các enzyme khác, metallo

protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên

là zinc metallo protease Số it protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay

vì kẽm khi tham gia phản ứng xúc tác Metallo protease hoạt động ở pH trung tính

và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (Fox và ctv, 1991).

Ngoài ra, protease còn được phân loại thành ba nhóm:

Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2 — 4; chúng có nhiều ở tế

bào động vật, nắm men, nhưng it thấy ở vi khuẩn (Fox và ctv, 1991)

Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7 — 8 như papain từ du đủ,

bromelain từ dứa, va hau hét protease có nguôn gôc động vat.

Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9 — 11 như alkaline protease,serine protease, protease ở Bacillus spp (Lopez-Otin và Matrisian, 2007).

2.1.3 Nguồn thu enzyme protease

Protease được thu từ nhiều nguồn khác nhau, va xuất hiện trên nhiều đối

tượng từ động vật, thực vật tới vi sinh vật.

Ở động vat, protease thường có ở hệ tiêu hóa như tuyến tụy, niêm mặc da

dày, niêm mạc ruột non (Shafee và ctv, 2005) Pepsin từ niêm mac dạ dày và dịch vicủa động vật có vú, chim, ba sát, lưỡng cư thường sử dụng dé hỗ trợ tiêu hóa

Ở thực vật, protease có thể được thu từ phần thân, lá và đặc biệt trong quả,tuy nhiên do nồng độ enzyme có trong mô thực vật còn thấp nên sử dụng nguồnnguyên liệu thực vật rất lớn đề có thé thu được protease

Có nhiều loại vi khuẩn, xạ khuẩn và sợi nắm có khả năng tông hợp protease.Protease vi sinh vật có thể có trong tế bào hoặc tiết ra môi trường nuôi cấy Các vikhuẩn được sử dụng để tổng hop protease là B sutilis, B cereus, B brevis, B.licheniformis,, B velezensis sinh ra protease trung tính B thermophilus tônghop protease chịu nhiệt, các loài xạ khuẩn tổng hop protease gồm S griseus, s.rimous, Nam sợi tong hợp protease gồm có A oryzae, A awamori, A niger, một số loài Penicilium và Zhyzopus (N Jisha va ctv, 2013)

Vi sinh vật được xem là đối tượng thích hợp nhất dé sản xuất protease ở quy

mô lớn nhờ các ưu điêm sau:

Chủ động được quá trình sản xuất enzyme do quá trình sinh trưởng, phát triển

và sinh tong hợp enzyme của vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện biên ngoài

Vi sinh vật có thé tổng hợp được nhiều loại enzyme khác nhau và enzymethu được thường có hoạt tính cao Quá trình sinh trưởng ngắn do đó có thể tăng

năng suất thu hồi sản phẩm

Có thé điều khiển được quá trình sinh tổng hợp enzyme

Giá thành rẻ nhờ quá trình nuôi cấy đơn giản, dé tổ chức nuôi cấy

2.1.4 Ứng dụng của enzyme protease

Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp nôngnghiệp, y tế, môi trường,

2.1.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Trong sản xuất bia, thường dùng các enzyme a- amylase, B- amylase, cácprotease, pentosanase và B- glucanase, các enzyme này có vai trò chuyển hóa cá

polysaccharide đại mạch, các hợp chất đạm khó tan đảm bảo cho hoạt động sống

bình thường của nắm men Các chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc

làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng

dé thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn (Lê Ngọc Tú

và ctv, 2011).

Trong công nghiệp thịt, có thé sử dụng các chế phẩm protease dé làm mềmthịt Chế phẩm enzyme dé làm mềm thịt thường chứa papain hay hỗn hợp papain

VỚI protease của vi sinh vật Kết quả là chất lượng thị được tăng cao, có thể chuyền

thịt loại thấp thành thịt có phâm chat cao (Lê Ngọc Tú va ctv, 2011)

Trong công nghiệp thuộc da, protease của vi sinh vật cũng có tầm quan trọngtrên hai quá trình: làm mềm và tách lông (Lê Ngọc Tú vả ctv, 2011) Protease có

khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần của da, chủ yếu là collagen, giúp da

thu được có độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da, tính chất này lại đượccủng cô thêm (Lê Ngọc Tú và ctv, 2011)

Hiện nay, việc đưa các protease tach từ vi khuân (B mesenterieus, B.subtilis), nam mốc (Aspergillus oryzae, A flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc

da đã đem lại nhiều kết quả và dần chiếm vị trí quan trọng (Ogino va ctv, 2008)

Công nghiệp sản xuất chất tây rửa: Protease là thành phần không thẻ thiếutrong một số sản phẩm như: nước lau kính, răng giả, kem đánh răng và trong bộtgiặt Gần đây, protease được bố sung vào các chất tay rửa trên thị trường đều làserine protease, được sản xuất từ Bacillus sp và chủ yếu là Bacillus subtilis Trênthé giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tayrửa (Gupta va ctv, 2002).

2.1.4.2 Ung dung trong dược phẩm y tế

Trong công nghiệp y hoc, các chế phẩm protease cũng được sử dung dé sảnxuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôi cấy vi khuẩn và vi

sinh vật khác như môi trường nuôi cấy vi khuẩn sản xuất ra các kháng sinh, chất

kháng độc, v.v Ngoài ra các chế phẩm protease còn được dùng để cô đặc và tinhchế các huyết thanh kháng độc đề chữa bệnh (Lê Ngọc Tú và ctv, 2011)

2.1.4.3 Ung dụng trong nông nghiệp

Enzyme protease có khả năng thủy phân protein rất mạnh tạo ra dịch đạmsinh học làm phân bón lá cho cây trồng cực kỳ hiệu quả Có thé sử dụng enzymecông nghiệp hoặc enzyme protease từ vị sinh vật Trong 2 loại này nên sử dụng loại

từ vi sinh vật bởi vi sinh vật sẽ sản sinh ra số lượng rất lớn theo sự phát triển củachúng.

Một số ứng dụng tiêu biểu của enzyme protease ủ phân bón cây như: ủ phân

cá, phân đậu tương, phân bánh dau, dich trùn qué là đạm sinh học bón cây, cảitạo đất Ngoài ra enzyme protease còn được ứng dụng trong chăn nuôi: ủ thức ăncho vật nuôi, xử lý nước thải chăn nuôi, khử mùi hôi chuồng trại và ủ phân chuồng.2.1.4.4 Ứng dụng trong xử ly ô nhiễm môi trường

Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất cácdung dich đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị đinh đưỡng cho cá, vật nuôi Proteasethủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụlên các chất rắn, sau đó cắt các chuỗi polypeptide nhờ đó thể tận dụng nguồnprotein này, giảm thiêu tác nhân gây ô nhiễm môi trường (Whiteley và Lee, 2006)

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus sp.

2.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg.Bacillus sau đó đã được sửa đôi bởi Ferdinand Cohn

Bacillus là một chi vi khuan gram dương có kích thước lớn, hiếu khí, hình

que, được tìm thấy rộng rãi trong đất, nước và không khí Các thành viên của

chi Bacillus có khả năng thích nghỉ cao, nhờ kha năng hình thành nội bao tử - cấutrúc bảo vệ chúng khỏi một loạt các môi trường tiêu cực Bao gồm nhiệt độ rất cao,rất thấp, cực khô, bức xạ và hóa chất độc hai Bacillus có thé ngưng hoạt động trongnhiều năm và kích hoạt trở lại khi gặp trúng điều kiện thuận lợi Ngoài nội bảo tử,những vi khuẩn đáng kinh ngạc này có một loạt các khả năng sinh lý giúp chúngthích nghỉ với các môi trường khác nhau và chịu đựng nhiều điều kiện có thé gây tửvong cho nhiều sinh vật khác Điều quan trọng là bạn phải biết sự khác biệt giữachi, loài và chủng khi chọn chế phẩm sinh học

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales

và thuộc họ Bacillaceae Hiện nay chi Bacillus có 267 loài có mat ở khắp moi noi.

2.2.2 Đặc điểm các chủng Bacillus

Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiểu khí hay ky khí tùy nghi.Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt mau tim Gram (+), kích thước0,5 — 0,8 pm x 1,5 — 3 pm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng diđộng, có 8 — 12 tiêm mao, sinh bao tử hình bầu dục nhỏ hon nằm giữa hoặc lệchtâm tế bào, kích thước từ 0,8 — 1,8 pm Bào tử phát triển bang cách nảy mầm do sựnứt của bào tử Chúng phân bồ hau hết trong môi trường tự nhiên, phan lớn cư trú

trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất

trồng có khoảng 10°— 10’ CFU/g Dat nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoangthì sự hiện diện của chúng rất hiếm Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyênliệu sản xuất như bột, bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao

Bacillus licheniformis là một vi khuân Gram dương, sinh bao tử, ky khí tùynghi, hình que B licheniformis có nhiều hình thái khuẩn lạc khác nhau Các khuẩnlạc “dạng địa y” xù xi tạo nên tên gọi của chúng Các khuân lạc có màu kem, nhưng

sẽ chuyển màu đỏ khi môi trường có chứa sat Bacillus licheniformis được tìm thaytrong nhiều loại môi trường, nhưng đặc biệt trong đất và trong lông của các loàichim (Logan và Vos, 2015) B licheniformis được sử dụng như một loại vi khuẩn cólợi trong thức ăn chăn nuôi Một số chủng phân lập cũng đã được phát hiện là cókhả năng sinh học ở người Ngoài ra, B licheniformis còn có khả năng tiết proteaseserine kiềm cao đã làm cho B licheniformis trở thành một trong những vi khuẩnquan trọng nhất trong sản xuất enzyme công nghiệp.

Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn hình que, Gram dương, chủ yếuhiếu khí, hình thành bào tử được tim thấy trong môi trường sống đa dạng rộng rãi

Nó có chiều dài tế bào lên tới 4 um và đường kính 1,5 pm, khá lớn đối với vikhuẩn Các tế bào thường xuất hiện theo cặp và chuỗi, trong đó các tế bào được liênkết với nhau bằng polysaccharid trên thành tế bào B megaterium có mặt khắp nơitrong môi trường, nó có thể được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm (bao gồm

cả mật ong và phan ong, trong đó hầu hết các vi sinh vật không phát triển) và trênnhiều bề mặt, bao gồm các mẫu bệnh phẩm, da, giấy, đá, v.v Bacillus megaterium

cũng đã được phân lập từ phân gia súc, sâu bướm hoàng dé và phân bướm sáp lớnhơn B megaterium đã là một sinh vật công nghiệp quan trọng trong nhiều thập

kỷ Nó tạo ra penicillin amidase được sử dụng để tạo ra penicillin tong hop va một

số enzyme, chang hạn như amylase được sử dụng trong công nghiệp làm bánh

va glucose dehydrogenase được sử dụng trong các xét nghiệm glucose trongmáu Nó cũng tao ra các enzyme dé điều chỉnh corticosteroid và một số axit amindehydrogenase Hơn nữa, nó được sử dung để sản xuất pyruvate, vitamin B12

và các phân tử có đặc tính diệt nam va khang virus (Vary va ctv, 2007)

Bacillus velezensis là một loại vi khuân hiéu khí, gram dương, hình thành nộibào tử, thúc đây sự phát triển của thực vật Nhiều chủng của loài này đã được báocáo là ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, bao gồm vi khuẩn, nam vàtuyến trùng Dựa trên phân tích phát sinh loài gần đây, một số loài Bacillus đã được

phân loại lại thành B velezensis Tuy nhiên, thông tin này vẫn chưa được tích hop

vào một nguồn tai nguyên được tô chức tốt Phân tích bộ gen đã tiết lộ rằng

B velezensis sở hữu các cụm gen đặc trưng cho chủng liên quan đên quá trình sinh

tổng hợp các chất chuyên hóa thứ cấp, đóng vai trò quan trọng trong cả việc ức chếmam bệnh và thúc day tăng trưởng thực vật (Fazle Rabbee va ctv, 2019).

2.2.3 Đặc điềm sinh hóa và đặc điểm nuôi cay

Đặc điêm sinh hóa của vi khuân Bacillus

Bang 2.1 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus

Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

Hoạt tính catalase + Urease

-Sinh indol - Glycerol +

MR (Metyl red) + D - Glucose +

Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Bacillus phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuynhiên van phát triển được trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu là 37°C, pHthích hợp khoảng 7,0 — 7,4.

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một sốnguyên t6 vi lượng khác Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủnguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone)

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp protease ở Bacillus

2.2.4.1 Anh hưởng của thành phan môi trường dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng của môi trường có ảnh hưởng lớn tới khả năng sinhtong hop protease ở vi sinh vật nói chung và Bacillus nói riêng Dé tăng lượngprotease trong môi trường can lựa chọn các nguồn dinh dưỡng như carbon, nitrogen,

muối khoáng với tỷ lệ thích hợp và cơ chất cảm ứng cần được lựa chọn kỹ lưỡng.

Nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là monosaccharide,disacchride va polysaccharide (tinh bột) Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong nuôicây vi sinh vật là bột mì, bột đậu nành, cám hoặc nước chiết của các nguyên liệu này.

Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp proteasetrong đó có Bacillus Bacillus có kha năng sinh tổng hợp protease khi môi trườngchứa lượng tinh bột lớn hơn 8% Glucose, saccharose, maltose, fructose và sorbitol

đều là nguồn carbon tốt cho sự tổng hợp protease ở vi khuan này (Nguyễn Đức

Lượng, 2002) Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinhprotease của Bacillus bằng cách bé sung các thành phần khác nhau như tinh bột hòatan, maltose, lactose, saccharose va dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trường cơbản (thịt-peptone), đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiễn hành nuôi cấy thuenzyme thô, xác định hoạt tính enzyme Trong nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy vàTrần Thị Xô (2004) nhận thấy tinh bột hòa tan là nguồn carbon giúp B subtilis sinhtong hợp protease tốt nhất và cho rang tinh bột trong môi trường đã kích thíchchủng này sinh amylase Chính amylase này là chất cảm ứng sinh protease Tuynhiên, khi khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của mộtching Bacillus sp., Mehrotra và ctv (1999) lại công bố rang tinh bột không có vai trò

11

kích thích Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng vi khuân này.

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cay có thé là các chất hữu co (protein vàcác sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nito (amoni, nitrat).Nguồn nito hữu cơ thường thúc day quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus vì

chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitơ hữu cơthường dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tương Trong số đó, peptone ở

nồng độ thấp thường là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease.Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lượng protease được tổng hợp nhất

là khi casein ở nồng độ cao Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thường là(NH¿)zSO¿ Các muối clorua, sulphate, nitrate amon thường có ảnh hưởng không tốtđến quá trình sinh tổng hop protease Đối với B subtilis việc sử dụng phối hợp

nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng ké quá trình tổng hợp protease của

chúng (Trần Ngọc Hùng, 2010)

Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vậtnói chung và Bacillus nói riêng vì chúng làm thay đổi trang thái hoá keo của tế bảochất Trong đó, phospho và lưu huỳnh có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinhtổng hợp protease Các photphate vô cơ có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh tổnghợp protease Tuy nhiên, KH2PO, thường thúc đây đến quá trình sinh tổng hợpprotease đo tính chất đệm của nó Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau, giữ vai trò

điều hòa quá trình tổng hop protease của vi sinh vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Các vi sinh vật có thể lấy một số các chất khoáng khác như magiê, natri, sắt thông qua một số dạng muối khoáng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy hoặc có

sẵn trong nguyên liệu pha môi trường.

Kha năng sinh tổng hop protease của Bacillus thường được cảm ứng bởi cácchất giàu đạm như bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừnghoặc lông vũ Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzymecũng thể hiện không giống nhau Do đó, trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật cóthể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lượng lớn protease cần thiết

một cách nhanh chóng và khoa học (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

12

2.2.4.2 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy

Ngoài nguồn dinh dưỡng và yếu tố môi trường thì phương pháp nuôi cấy

cũng ảnh hưởng đáng ké tới sinh tổng hợp protease ở Bacillus Dé thu nhận chế

phẩm enzyme có thé dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt(phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm) (Nguyễn ĐứcLượng, 2004).

Protease từ Bacillus sp sản xuất du theo phương pháp nuôi cấy bề mặt hay

phương pháp bề sâu đều có pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu tương tự nhau, tuy

nhiên việc nuôi cấy bề mặt cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn sovới nuôi cây bê sâu (Nascimento va Martin, 2004).

2.3 Ứng dụng bức xa ion hóa trong gây đột biến ở vi sinh vật

Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinhvật và nằm trong khoảng từ 10°!° đến 105 Tỉ lệ này có thé tăng một cách rõ rệtbằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến10° đến 10 (Davati va ctv, 2013) Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biếnngẫu nhiên và đột biến định hướng Đột biến ngẫu nhiên thường được tạo ra bằngcác phương pháp vật lý và hóa học (Malik, 1997) Các tác nhân vật lý như: các tia

X, tia y, a, B, neutron có bước sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năngxuyên sâu cao Các tia phóng xạ có thé gây đột biến bang cách làm đứt gãy DNA,thay đối cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không 6n địnhlàm biến đổi DNA Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác địnhnhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vat (Awan, 2011)

Các vi sinh vật nói chung có khả năng kháng với các đột biến cao hơn so với

động vật và thực vật Điều này có thể được giải thích bởi kích thước cùng nhân tế

bào nhỏ bé của vi sinh vật khó bị tác động bởi quá trình chiếu xạ Các đột biến ở visinh vật thường phức tạp hơn các sinh vật khác Hơn thế, vi sinh vật có khả năng tựbảo vệ và sửa chữa phân tử DNA khi bị chiếu xạ Phân tử DNA của vi sinh vật đượcbảo vệ nhờ quá trình hình thành bào tử và khả năng sử dụng các chất “bắt” gốc tự

do như catalase, superoxide dismutase, va carotenoid (Hoe va ctv, 2016) Một sốloài hình thành bao tử như Bacillus sp va Clostridium sp là các vi khuẩn kháng xạ

13