3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian dự kiến từ tháng 03/2023 đến tháng 09/2023.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ Lên men và phòng thí nghiệm Nắm ăn và Nam dược liệu, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vat liệu và thiết bị
3.2.1. Nguyên vật liệu
Các chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protease được lưu trữ tại
phòng thí nghiệm Công nghệ Lên men — Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học va Môi trường được liệt kê trong Bảng 3.1.
Bang 3.1. Các chủng Bacillius có khả năng sinh tổng hop protease
STT Tên chủng Kí hiệu 1 Bacillus velezensis BSI 2 Bacillus subtilis BS2 3 Bacillus megaterium BS3 4 Bacillus licheniformis BL4
3.2.2. Hóa chat
Hóa chất: cồn 90° (CAS: 64-17-5, Agar, Peptone (CAS: 73049-73-7), Sodium chloride (NaCl) (CAS:7647-14-5), Cao nam men (Yeast Extract Power
RM027-500G), HM peptone (RM003-500g), Casein (CAS:9000-07-1).
Môi trường nuôi cay vi sinh vat: NB gồm: Peptone, NaCl, Yeast extract, HM peptone, nước cất. NA gồm: Peptone, NaCl, Yeast extract, HM peptone, Agar,
nước cat.
Hóa chat nhuộm khảo sát vòng phân giải: Amido black (CAS:1064-48-8),
Acetic acid (CAS-64-19-7).
3.2.3. Thiét bi
Thiét bi gamma Co-60 (GC-5000) — Trung tam Céng nghé Sinh hoc
TP.HCM.
16
Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hấp khử trùng Autoclae, cân điện tử, tủ lạnh, máy nuôi cấy lắc, lò vi sóng ... Và các thiết bị cơ bản trong phòng thí nghiệm.
Dụng cụ: đĩa petri, Ống nghiệm, đèn cồn, các loại que cấy, micropipette (100 ul, 1000 yl), pipette thủy tinh, céc thuy tinh, binh erlen, chai thuy tinh, ống đong, túi nilon, màng bọc thực phẩm, bút ghi mẫu, giấy lọc và một số dụng cụ cơ bản của
phòng thí nghiệm.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Bảo quản và giữ giống
Các chủng Bacillus thuần chủng được bảo quản theo phương pháp cấy truyền trên ống thạch nghiêng chứa môi trường NA. Sau khi cấy truyền trên ống thạch, vi khuẩn được nuôi ở 37°C trong 2 - 3 ngày, sau đó bảo quản ở 4°C.
3.3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch NA có chứa cơ chất casein.
3.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp cấy điểm
Chuẩn bị: Môi trường chứa cơ chất casein 0,1% trên đĩa thạch gồm Peptone 5 g, NaCl 5 g, yeast extract 1,5 g, HM peptone 1,5 g, agar 15 g, casein 1 g, nước cất vừa đủ 1 lít, được hấp khử trùng va tiến hành dé đĩa, các đĩa có đường kính bằng nhau được đồ cùng một thẻ tích (25 ml/1 đĩa $9) để đảm bảo độ dày của lớp thạch casein là như nhau ở tất cả các đĩa thí nghiệm.
Chuẩn bị thuốc nhuộm amido black 0,1%: Pha dung dịch acetic acid 10%
làm dung môi cho thuốc nhuộm và dung dich rửa sau nhuộm. Bồ sung 0,1 g amido black vào 100 ml dung dich actic acid 10%, khuấy đều cho tan hết, lọc qua giấy lọc
và bảo quản tránh ánh sáng.
Tiến hành thử hoạt tính của enzyme: Các chủng Bacillus được cung cấp sẽ được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường NB và cấy ria trên đĩa thạch chứa môi trường NA. Sau đó, dùng que cấy lấy các khuẩn lạc riêng rẽ đưa vào đĩa thạch - casein, mỗi dia cấy 1 điểm. Ủ trong 48 giờ ở 37°C. Sau khi ủ tiến hành nhuộm các đĩa thạch bằng amido black 0,1% trong 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân
giải casein. Các chủng có vòng phân giải casein lớn là chủng có khả năng sinh protease cao.
17
Kích thước vòng phân giải casein được tính theo công thức:
A=D-d
Trong do: A: kích thước vòng phân giải (mm) D: đường kính vòng phân giải (mm)
d: đường kính khuẩn lạc (mm)
Từ đó, chon ra hai chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protease cao nhất.
3.3.3. Xử lý chiếu xạ
3.3.3.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào
Dùng que cấy chuyên các khuẩn lạc riêng rẽ của 2 chủng Bacillus vào bình tam giác chứa 100ml môi trường NB, nuôi cấy lắc 120 vòng/ phút, ở 37°C trong 24 giờ dé thu huyền dịch tế bao sơ cấp.
Sau khi nuôi cấy sơ cấp, chuyển 100 ul huyền dịch tế bao vào các ống nghiệm chứa môi trường NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc 120 vòng/
phút ở 37°C trong 24 giờ.
Các ống nghiệm sau khi nuôi cấy thứ cấp được dán nhãn (ghi liều chiếu xạ dự kiến) và được xử lý chiếu xạ trên thiết bị gamma Co-60 tại Trung tâm Công
nghệ Sinh học TP.HCM.
3.3.3.2. Chiếu xa dung dịch nuôi cấy
Các ống nghiệm chứa huyền dịch tế bao vi khuẩn được đem xử lý chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60 dải liều 0 - 1,25 kGy được chia làm Š liều chiếu (0,25:
0,5; 0,75; 1,0 và 1,25 kGy) và 1 liều đối chứng (0 kGy) , lặp lại 3 ống nghiệm cho mỗi liều chiếu.
3.3.4. Xác định số lượng tế bào vi sinh vật
Số lượng tế bào vi khuẩn của 2 chủng vi khuẩn Bacillus trước và sau chiếu xạ được xác định thông qua đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường NA.
Dịch nuôi cấy vi khuẩn (trước và sau xử lý chiếu xạ) được pha loãng với nồng độ 105, 105, 10”. Sau đó chuyển 100 ul dich nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng vào đĩa petri chứa môi trường NA. Ba đĩa petri cho mỗi nồng độ pha loãng.
18
Sử dụng que cấy trang dàn đều dịch nuôi cấy trên bề mặt thạch. Số khuẩn lạc được đếm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C và từ đó tính ra số lượng tế bao trong 1 ml mẫu theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di là nồng độ pha loãng
V là thể tích huyền dịch tế bao cấy vào mỗi dia (ml).
3.3.5. Sang lọc các khuẩn lạc sinh protease cao từ 2 chủng Bacillus bằng xử lý chiếu xạ
Huyền dịch tế bao sau nuôi cay thứ cấp được xử lý chiếu xa dải liều 0 - 1,25 kGy.
Tiến hành pha loãng dung dịch sau chiếu xạ tới nồng độ thích hợp và cấy trang trên dia petri chứa môi trường NA sao cho mỗi đĩa chứa khoảng 50 - 200 khuẩn lạc đơn,
ủ đĩa trong 24 giờ.
Lựa chọn 30 khuẩn lạc đơn ở mỗi liều chiếu dé tiến hành kiểm tra khả năng sinh enzyme protease bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch - casein.
So sánh vòng phân giải, những khuẩn lạc có kích thước vòng phân giải lớn 10% so với chủng thuần được coi là các đột biến sinh protease cao. Tần số đột biến sinh protease cao ở mỗi liều chiếu xạ được tính theo công thức:
Tần số đột biến (%) = (Số khuẩn lạc đột biến / Số khuẩn lạc khảo sát) x 100 3.3.6. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ, tính giá trị trung bình và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel 2019, phân tích ANOVA một nhân tổ các chỉ tiêu khảo sát bằng phần mềm Minitab 16.
19