Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát sự phát sinh cụm chồi và nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân – cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào lớp mỏng cây phú quý (Aglaonema sp.)

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảosát chất điều hòa sinh trưởng BA với các nồng độ khác nhau ảnh hưởng đến quá trìnhphát sinh chôi và nhân nhanh cụm chi từ đốt thân cũng như ảnh hưở

; BỘ GIÁO DỤC VADAO TAO _ ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HOC

KHAO SAT SU PHAT SINH CUM CHOI VA NHAN

NHANH CUM CHOI TỪ MAU DOT THAN - CAM UNG,

PHAT SINH PHOI TU TE BAO LOP MONG

CAY PHU QUÝ (Aglaonema sp.)

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _ ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

KHAO SAT SU PHAT SINH CUM CHOI VA NHAN NHANH

CUM CHOI TU MAU DOT THAN - CAM UNG, PHAT SINH

PHOI TU TE BAO LOP MONG CAY PHU QUY

(Aglaonema sp.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TÔ THỊ NHÃ TRÀM TRAN THỊ THANH QUYEN

KS HUYNH TAN PHÁT

TP Thủ Đức, 8/2023

LỜI CẢM ƠNCon đường nghiên cứu khoa học của một sinh viên nắm cuối néu đi một mình thìkhó có thể thành công Trong suốt hành trình này, tôi xin cảm ơn tất cả những người

đã đồng hành và truyền cảm hứng cho tôi từ khi hình thành cho đến khi hoàn thành

luận án.

Trước hết em xin cảm ơn Cô Tô Thị Nhã Trầm đã hướng dẫn kiến thức chuyênmôn cho em và giúp em giải quyết những khó khăn tôi gặp phải, giúp em hoàn thànhluận án này Cảm ơn anh Huỳnh Tan Phát và Công ty Cổ phan Công nghệ Sinh họcTPECO đã tạo điều kiện để em thực hiện luận án của mình

Em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Phúc Hải Đăng đã luôn nhiệt tình chỉ dạycho em các thao tác và kinh nghiệm trong quá trình viết luận văn

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình của mình đã tin tưởng, động viên

và giúp đỡ em sông với niêm đam mê của mình.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Trần Thị Thanh Quyên, MSSV: 18126138, Lớp: DH18SHB thuộc ngành Côngnghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày tháng năm 2023

Người viet cam đoan

ii

TÓM TAT

Cây Phú Quý (Aglaonema sp.) là một trong những loài cây được biết đến bởi màusắc lá rat đẹp cũng như dé chăm sóc do đó nó càng ngày càng phô biến trên thị trườngnhư một loài cây cảnh có tán lá tuyệt vời Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảosát chất điều hòa sinh trưởng BA với các nồng độ khác nhau ảnh hưởng đến quá trìnhphát sinh chôi và nhân nhanh cụm chi từ đốt thân cũng như ảnh hưởng của chất điềuhòa sinh trưởng 2,4-D với các nồng độ khác nhau đến tỉ lệ cảm ứng, phát sinh phôi từ tếbào lớp mỏng cây phú quý Kết quả nghiên cứu cho thay, trong quá trình phát triển chồi

từ đốt thân thì nồng độ 2,00 mg/1 BA kết hợp với 0,5 mg/1 IBA là nồng độ có kết quả tốtnhất với tỉ lệ mau tạo chdi là 81,48%, 7,33 chỗồi và chiều cao chồi trung bình là 0,95 emsau 6 tuần nuôi cấy Sau 8 tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu cảm ứng cao nhất 51,85% và tỉ lệ mẫuphát sinh phôi cao nhất 37,04% thu được trên môi trường MS có bé sung 1,4 mg/l2,4-D kết hợp với 1 mg/l IBA Trong khi đó môi trường có bổ sung 2,00 mg/1 BA kếthợp với 0,2 mg/l kinetin đạt được kết quả tốt nhất trong quá trình nhân nhanh cụm chỗivới 2,78 chồi

Từ khóa: Aglaonema sp., cụm chôi, tế bào lớp mỏng, BA, 2,4-D

ili

Aglaonema sp is one of those plants known for its beautiful leaf color and ease of care,

so it is increasingly popular in the market as an ornamental plant with excellent foliage This study was conducted to investigate the effect of growth regulator BA with different concentrations on the process of shoot proliferation and rapid multiplication of shoot clusters from the shoot as well as the effects of growth regulator 2,4 -D with different concentrations to the rate of induction, embryogenesis from the thin cell layer of the precious tree The results showed that, in the process of developing shoots from shoots, the concentration of 2.00 mg/l BA combined with 0.5 mg/l IBA was the concentration with the best results with the rate of shoots was 81.48%, 7.33 shoots and average shoot height was 0.95 cm after 6 weeks of culture After 8 weeks of culture, the highest rate

of induced samples 51.85% and the highest rate of embryogenesis 37.04% were obtained on MS medium supplemented with 1.4 mg/l 2,4-D combined with 1 mg/l IBA Meanwhile, the medium supplemented with 2.00 mg/l BA combined with 0.2 mg/l kinetin achieved the best results in the rapid multiplication of shoot clusters with 2.78 shoots.

Keywords: Aglaonema sp., bulds, thin cell layer, BA, 2,4-D.

iv

DANH SÁCH CAC CHU VIET TAT o cc.cssccsscssesssessesssessesseseseeseseiessessessseeseseseseeeeee vii

TH 1 eeeeendieesetosesnotesnarooosaogerorgoerteonasgorene viiiDANH SÁCH CÁC HINH.0o s.csccsscssssssessssssessesssessessvsesetsvesseesesssstsessesssessessnsssesseeseeeees ixCHƯƠNG 1 MO DAU ooo cco cscs ccscsssessesssessessnessessuesvtssesieesstsneeieesesieesessessecsuseseeseeeseeeee |1.1 Đặt vấn đề 2+ s+s+2s2232521221211212112112111211111121111112112111211212212112 21 ca |(eee —— |

1.8 161:d0nø ther Mt Sites sec sen gc1innn91ffhGi3nSgESPvdondigSia-j2SEiStS0oj2ssốrtöblSgiĐ5921Lo02835P0100u882EE8d3H21E22 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -2- 2522222E22EE2EEzEEzEzrxzrserssrssrssrxerxee.3

2.1 Cây Phú Quý -2-©22+22+222E1221221122121121127112112112112111112112112112111121221 1e 3

2.1.1 Nguén 0/000 -3+1 32.1.2 Đặc điểm cây Phú Quý 5-05 c2

FT 1 a a: 32.2.1 Các kĩ thuật được sử dụng trong nuôi cấy mô 2¿2¿52¿+222E22E2E2zzxzzez 42.2.1.1 NUGi J0 42.2.1.2 Nuôi cây mô và cơ quan tách rời -2- 22©2+++++E+++2+++rxrzrxrrrxrrrrrrrree 45:7.1,ÿ, Nhỗi gây ruõ pin SEH en 42.2.1.4 Nuôi cấy bao phắn 2: 2S2+22221221211221221122122112112111211211211211211 2122 e6 42.2.1.5 Nuôi cấy tế bào đơn -2-©2¿+22222222211221122112211221122112111211211211211 21 xe 5

22,1), Phatsinh phối SOM ecsscscnssnessscseasssecemuenesa ar esmnasnemeninnen sarees eeeceneees 5

2.2.1.8 Phát sinh chỗồi cơ quan - 2-2222 ©2++E+++EEESEEESEEESEEEEESrErtrxrrrkrrrrrrrree 62.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng - 2 22222222EE2EESEE2EE2EE2EE22EESEESEErrrrerrres 6

° 5 nh 5 6 2.2.2.2 Cytokinin 8 ốố ố ốẻ 6e 7

2.2.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô - 2 2¿22222222E2EE2EE22212232251221211221 2222222222 72.3 Một số nghiên cứu về cây Phú Quý 2 2 22222E22E22EE22E22222212212221221222222 e2 8

2„3 „ Các WE HISD: CU ALONR TU OC acs scones se ansoreameaaneups cena ae eruna veep SENET 8

2.3.1.1 Các nghiên cứu về gÏ40fi@ï4 2-©22©22©222222E22SE22ES22E22EE222222222322222xce §2.3.2.2 Các nghiên cứu liên quan đến kĩ thuật -2222222222++2z+22++£xzzzzzzzex 8

2.4.5 Các TENISH CUTS OAL MUO «css; sesssncsanassannanessanans cannes 3608633384548 164.135-446338561803)48859546.3035 9

5.1.1.1 Các hiến otha về A elrarte rte cre cxcssccscscnccssourccesesssieronriveanciecaeemeneseceeegive 924.2.2, Các nghiên cứu liên quan đến kĩ thuật sieu 10CHƯƠNG3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -.2 2222522: ll3.1 Thời gian và địa điểm nghiên Oe ceceececcecseccecseceeeseeeseeseeeeeseseeeseesteeeeeeeees 11

32 V at GU MTS 600 öcnnurdndiiiottbiNGEGESSASIG1405RSE8SESRENRSEISSBIGSAISSISSEBSSSSOESGISNSHĐIIESSESSHSWSEĐSGH8R lãi

3.2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu -22 22©252©cxc2zxcczxerrxerrreee 113.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2 2222+S22E2EE2EE2E1211212221211211221221 22.222 123.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy - 2-22 ©2222+22E222+22E2222EE22E222E 22c 123.2.4 Điều kiện nuôi cấy - 2 2+ +2S2E22E22E223225121121121121121121121121121121121121121 222 13

3.3 Phirơneg Pháp ñnghiÊn GỨU:‹sessesceeossesiiEn 01001102 5004645381151406548431503161454080385846548318 13

3.3.1 Ảnh hưởng của BA đến quá trình phát triển chỗồi từ đốt thân 133.3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D đến cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào lớpmỏng 143.3.3 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh cụm chồi - 153.4 Phương pháp xử lý số liệu -2- 22 22+22++EE+2EE+2EE+2EE+2EEEEEEEErEExrrrrrrrrrrrrres 16CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN +2 2+22E+EE2E2E2EE2EE2EcExcExrrees 174.1 Ảnh hưởng của BA đến phát triển chồi -2- 2-2 2+2S£2E2EE22E22E222E2Ez22xcrxee T74.2 Sự phát sinh phôi của 2,4-D từ tế bào lớp mỏng 22 2 2222222z2zzzzzzsc2 224.3 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh cụm chồÌi -2-52552 25CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ 22-©22222222E222E222E22EE222E2Exzrrcee 3051T Iểlbsueaeaeeerenroragrotryototogberdtoyt00Y0010001 00009770000 00/00000Hif0900vi2nt nsrcnstong 30

ae 30TAI LIEU THAM KHẢO - 2 2 2S2+S22E2EE£EE2EEEE2E12123221211211121121112111111 2121 xe

PHU LỤC -2-22-222222E22EE222122212221122121121121122112211221122112211211121112112211211 11c.

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

TIBA : 2,3,5-triiodbenzoic acid

IAA : 3-indol-acetic acid

IBA : 1H-indol-3-butyric acid

MS : Murashige and Skoog medium, 1962

DHST : Điều hòa sinh trưởng

LLL : lần lặp lại

vii

Bảng 3.1.

DANH SÁCH CÁC BANG

Thành phan môi trường MS - 2 222©2++22++£2+2£E++£E+zzxrsrxrsrer 13Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát triển chéi từ mẫu đốt thân 14Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến sự quá trình cảm ứng, phát sinh phôi từ tế

Dão lð cel) (tence ce 15

Bang 3.4 Anh hưởng của nồng độ BA đến kha năng nhân nhanh cụm chdi 15Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chéi, chiều cao chồi sau 2 tuần -5¿ 17Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu tạo chéi, số chồi, chiều cao chéi sau 4 tuần - 19Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu tạo chéi, số chồi, chiều cao chéi sau 6 tuần -5- 20Bảng 4.4 Tỉ lệ mẫu cảm ứng sau 4 tuần - 2-2222 2222222E222225225222223222222222222xe2 22Bảng 4.5 Tỉ lệ mẫu cảm ứng, tỉ lệ mẫu phát sinh phôi sau 8 tuần - - 24Bang 4.6 Số chồi trung bình sau 4 tuần nuôi cấy - 2 2 2225222222z2zzz22zz2 26Bang 4.7 Số chồi trung bình sau 8 tuần nuôi cấy 2- 2-52 22222222222zzzzzcze2 28

viii

mi chữi sau /4-tnầM THuổÏ gu eee .kdsenhhH han HọchH2X023000012210000.00g60.g a7Cụm chồi sau 8 tuần nuôi CAY oo cececccececsesssesssessessseessesseessesssessseesseesseeseees 28

ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện tay cùng với chất lượng cuộc sông đi lên, nhu cầu của con người càng tăngthì nhu cầu cây xanh càng nhiều, góp phần cải thiện khí hậu, giải quyết vấn đề kỹ thuậtmôi sinh Cây Phú Quý là loại cây tán lá trang trí nội thất do tán lá hấp dẫn, dễ phát triển

và khả năng chịu được độ âm tương đối thấp và điều kiện ánh sáng yếu (Henny, 2000;

Chen, 2005) nên được ưa chuộng hiện nay.

Tuy nhiên, việc sản xuất Aglaonema thương mại hầu như đều nhân giống truyềnthông, nhưng nhân giống truyền thống bằng cách giâm cành có thể truyền mầm bệnh từcây gốc sang cành giâm (DM Yeh và cộng tác viên, 2007) Nguyên nhân có thé bởi vimột số giống Aglaonema có thé chứa mầm bệnh nội sinh trong cây (Chase, 1997) Trongnhững thí nghiệm tiếp theo đã có một số nghiên cứu nhân giống nuôi cấy mô nhưngkhông thành công vì khó khăn trong việc thiết lập và duy trì môi trường nuôi cấy vôtrùng (Chen và Yeh, 2007) và thiếu thông tin kỹ thuật chỉ tiết về quy trình nhân giống

in vitro (Mariani và cộng tác viên, 2011).

Các nghiên cứu trước đây cho thay số chi in vitro trung bình phụ thuộc vào giống

và quy trình (Fang và cộng tác viên, 2013; Mariani và cộng tác viên, 2011) Do đó mục

đích của nghiên cứu này là khảo sát chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ khácnhau ảnh hưởng đến quá trình phát triển chồi cũng như nhân nhanh cụm chồi in vitro.Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp nhân chéi bang chồi nách đạt

tỉ lệ nhân chồi thấp (Zhang và cộng tác viên, 2004; Chen va Yeh, 2007) nên mục đíchcủa nghiên cứu này là khảo sát sự phát sinh cụm chồi và nhân nhanh cụm chdi từ mẫuđốt thân — cảm ứng phát sinh phôi từ tế bào lớp mỏng của cây Phú Quý nhằm cải tiến,nâng cao quá trình tạo chồi bằng phương pháp nuôi cấy tế bào lớp mỏng

1.2 Mục tiêu đề tài

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng nhất lên sự phân hóa cơ quan thực vật vàđặc biệt là phân hóa chôi, từ lâu người ta đã chứng minh rang sự cân bang tỉ lệ auxin vàcytokinin có ý nghĩa lên quá trình phát sinh hình thái của cây nuôi cấy mô in vitro cũngnhư cây nguyên ven (Trần Văn Minh, 1999) Nên mục tiêu của đề tài này là xác địnhđược nồng độ BA phù hợp đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân và nhân nhanh cụmchỗồi cũng như nồng độ 2,4-D phù hợp đến quá trình phát sinh phôi từ tế bào lớp mỏng

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài được thực hiện với 3 nội dung:

Nội dung 1: Ảnh hưởng của BA đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân

Nội dung 2: Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào

lớp mỏng.

Nội dung 3: Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh cụm chồi

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Cay Phu Quy

2.1.1 Nguồn gốc va phân bố

Cây Phú Quý có tên khoa học

(Aglaonema sp.) Chi Aglaonema thuộc họ Ray

(Araceae) và gồm hơn 20 loài, sống ở vùng Đông

Nam A, Bắc An Độ, Nam Trung Quốc, Inđônexia

va Đông Malayxia (Hay, 1998) Aglaonema được

trông nhiêu ở Trung Quoc và nhiêu nước Đông

Nam A khác Vi vậy, tên thông thường sử dụng phổ

biến được gọi là “Chinese evergreen”

(Chen và cộng tác viên, 2003) Bên cạnh đó, Hình 2.1 Cây Phú Quý.

Aglaonema còn là một trong số những cây cảnh phổ biến dùng trong trang trí trên thếgiới, do màu sắc; hoa văn khác nhau trên những phiến lá Phần lớn giống lai tập trung

ở Thái Lan và InđônêsIa.

2.1.2 Đặc điểm cây Phú Quý

Cây phú quý thuộc loài cây thân thảo, cây mọc thành bụi, cao khoảng 25 cm đến

30 cm Thân tạo thành các bẹ lá có màu rắng pha hồng, phiến là có hình bầu dục và nhọn

ở dau, dai khoảng 15 em đến 25 cm, rộng khoảng 7 cm đến 10 cm, ngoài phiến lá cómàu đỏ, hoa mau trang và rễ cây có màu trắng

2.2 Nuôi cấy mô

Khái niệm biotechnology - công nghệ sinh học đã được đề xuất năm 1917 bởi một

kỹ sư người Hungari tên là Karl Erky để mô tả quá trình chế biến củ cải đỏ làm nguồnthức ăn phục vụ sản xuất lớn với qui mô lớn Theo Karl Erky, Biotechnology là từ ding

dé chỉ “Tất cả những công việc trong đó các sản phâm được sản xuất ra từ các nguyênliệu thô với sự giúp đỡ của các vật chất sống”

Năm 1961 một nhà vi sinh vật học người Thuy Điển là Carl Goren Hedén đề nghịđổi tên tạp chí khoa học Journal of microbiological and Biochemical Engineering andtechnology thành Biotechnology and Bioengineering dé đăng tải các nghiên cứu trong

lĩnh vực vi sinh hoc ứng dụng và lên men công nghiệp Từ đó, Biotechnology đã trở nên

rõ ràng và luôn gan liên với những nghiên cứu về “sự sản xuât công nghiệp các loại hang

hoá và dịch vụ thông qua các quá trình có sử dụng các cơ thé, hệ thống sinh học và chếbiến” (Trần Văn Minh, 1999).

2.2.1 Các kĩ thuật được sử dụng trong nuôi cấy mô

2.2.1.1 Nuôi cấy phôi

Đối với nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng Trong nhiều trường hợpthì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác Ngoài ra một số chất tự nhiên

như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy

phôi Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùngnhiều trong nuôi cấy phôi Auxin thường dùng ở nồng độ thấp Kinetin có vai trò đặcbiệt cho sự phát triển của phôi (Tran Văn Minh, 1999)

2.2.1.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cay đỉnh chéi cây nho dai, cùng với một số tác giả khác, ông

đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi.Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôicác bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn Muốn duy trìsinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môitrường mới Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôicấy co quan tách rời, cần b6 sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dang acideamine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng

có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này(Tran Văn Minh, 1999)

2.2.1.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chdi và cành có kích thước 0,1mm + lem.Các mô phân sinh dùng dé nuôi cay thường tách từ các mầm non, các chồi mới hìnhthành hoặc các cành non Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điềuhoà sinh trưởng rat quan trọng Muốn kích thích tạo chỗồi cần bổ sung cytokinine hoặc

tổ hợp cytokinine với auxin Muốn tạo rễ thì bố sung các auxin như NAA, IAA Nuôicay mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro(Trần Văn Minh, 1999)

2.2.1.4 Nuôi cấy bao phan

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứucủa Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) những năm

1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cay bao phan trên 30 loại cây Kết quả nghiêncứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phan nuôi cấy có thé phát triển thành cây đơn bộihoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc giántiếp thông qua tạo mô seo và tạo cơ quan (Tran Văn Minh, 1999).

2.2.1.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cay các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể đượctách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Những công trình về nuôi cấy tế bàođơn được tiến hành từ những năm 50 của thé ky XX Tế bao đơn có thé nhận được bằngcon đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòihỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng đề nghiêncứu cau trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trìnhsinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụngtrong chọn dòng tế bào (Tran Văn Minh, 1999)

2.2.1.6 Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông làngười đầu tiên dùng enzym dé thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào

rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới,phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Do không có thành tế bào nên protoplast trởnên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vat Bằng phươngpháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng

kỹ thuật dung hop protoplast để chuyển các bao quan và chuyển gene(Trần Văn Minh, 1999)

2.2.1.7 Phát sinh phôi soma

Phôi soma là cau trức được hình thành và phát triển từ các tế bào sinh dưỡng, có

thé phan hoa thanh cau tric lưỡng cực (một cực hình thành rễ, cực kia tao ra chéi) giống

như phôi hợp tử và không có liên kết hệ thống mạch với tế bào gốc ban đầu, trong nhữngđiều kiện thích hợp có thé phát triển thành một cơ thé có chức năng hoàn chỉnh Trongquá trình phát sinh phôi soma, tế bao sinh đưỡng đóng vai trò như phôi hợp tử và sựphát triển của phôi soma cũng trải qua các giai đoạn tương tự như sự sinh phôi hợp tử.Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự như phôi hữu tính, có mầm rễ và chỗồi đỉnhnên có thé nay mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chdi rễ sự phát

sinh phôi soma dễ hay khó tùy từng loai, mô, tế bào thực vật và các điều kiện nuôi cây( Bùi Trang Việt, 2000 và Dương Tan Nhut, 2009).

2.2.1.8 Phát sinh chỗồi co quan

La su hình thành chồi trực tiếp từ mẫu cay mà không qua giai đoạn mô seo

sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).

2.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng

2.2.2.1 Auxin

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Vài ảnh hưởng quantrọng của auxin điều hòa các quá trình sinh ly của thực vật có thé ké đến như sau: vươndài tế bao, quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn, sự tượng rễ, sự sảnsinh ethylene, sự phát triển trái, trinh quả sinh, sự rụng, sự hiện diện giới tính(Tran Văn Minh, 1999)

Auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dé cảm ứng sự tạo mô sẹo

từ mẫu cấy Loại auxin thường được sử dụng cho mục đích này là 2,4-D, nhưng nếu tiếptục duy trì mô sẹo trong môi trường có 2,4-D này thì tế bao sẽ bị đột biến Vì vậy người

ta có thê cảm ứng tạo mô sẹo bằng NAA hay IAA hoặc sau khi cảm ứng tạo mô sẹo bằng2,4-D thì mẫu cấy sẽ được chuyên sang môi trường có NAA hoặc IAA Auxin kích thích

sự phân tán các tế bào trong huyền phù tế bào còn cytokinin làm cho các tế bào kết dínhlại với nhau Nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình tháinhưng lại cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi Sự tạochéi và rễ từ mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinincảm ứng ban đầu Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tao chi từ mẫu cấy.Ngược lại, khi nồng đô auxin cao hơn cytokinin hoặc chi xử lý với auxin thì rễ sẽ đượchình thành Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản Người ta chorằng auxin cảm ứng tạo rễ là do nó cảm ứng sự tông hợp polyamine (Friedman và cộng

tác viên, 1985).

2.2.2.2 Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếuđến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô.Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6- benzylaminopurine (BAP) hoặc

6benzyladenin (BA), 6-y-ydimethyl-aminopurine (2-iP), purine-6amine (kinetin), va 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tu nhiên, con BA va kinetin là các cytokinin nhân tạo Noi chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

N-(2-furfurylamino)-1-H-(Trần Văn Minh, 1999)

Có nhiều cytokinin được tìm thay trong cây, tuy nhiên, chi, loài và những yếu tốkhác sẽ quyết định cytokinin nào là hiệu quả nhất Sau đây là những ảnh hưởng sinh lýcủa cytokinin: phân chia tế bao và tạo thành co quan; sự nảy mam, sự mở rộng của tếbao và cơ quan; sự tượng rễ và sự phát triển rễ: sự phát triển nụ và chỗi; trì hoãn sự lãohóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những chất hữu cơ(Nguyễn Minh Chơn, 2004)

Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/ cytokinin trong môi trường nuôi cay

quyết định sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tao chồi hay tạo phôi

soma (Ngô Xuân Bình, 2010).

2.2.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô

Nuôi cay m6 té bao thuc vat duoc str dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực vat, lâmnghiệp, và đồng ruộng Các ứng dụng bao gồm: thương mại hóa sản xuất các loài thựcvật sử dụng như là cây cảnh, trang trí phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, làthứ mà sử dụng nuôi cấy mô phân sinh và chéi dé tạo ra số lượng lớn các cá thé giốnghệt nhau, bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa, các nhà nhân giống có thé ưutiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế bao hơn là sàng loc cây trồng dé tìm cáctính trạng tốt, ví dụ kháng/chống chịu thuốc diệt cỏ Sinh trưởng quy mô lớn các tế bàothực vật trong môi trường lỏng trong các bioreactors đề tạo ra các hợp chất có giá trị,giống như sinh tong hợp các hợp chat thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổhợp, được sử dụng như là dược phẩm sinh học, lai xa các loài thực vật bằng cách bởi

dung hop protoplast và tai sinh các phép lai mới, nghiên cứu nhanh cơ sở phan tử của

các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản ở thực vật, ví dụ như chọn loc in vitro các cây

chong chịu với các điêu kiện bat lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro,

7

lai - thụ phấn các loài xa nhau và sau đó nuôi cấy tế bào hợp tử được tạo thành (thường

dễ bị chết nếu diễn ra trong tự nhiên) (cứu phôi), các thé đột biến nhân đôi nhiễm sắcthê và sự hình thành của các thê đa bội, ví dụ nhân đôi đơn bội, tứ bội và các dạng kháccủa thé đa bội có được tạo ra bằng cách áp dụng các chất chống phân bao (antimitotic)như là colchicine hoặc oryzalin, các mô tế bào nuôi cấy sau khi biến nạp có thé sử dung

dé thử nghiệm ngắn hạn các cấu trúc di truyền (genetic constructs) hoặc tai sinh tạo cáccây chuyên gen, các kỹ thuật nhất định như là nuôi cấy đỉnh phân sinh có thé được sửdụng dé tao nguồn nguyên liệu thực vật sạch từ nguồn bị lây nhiễm virus như là khoaitây và rất nhiều các loài có quả mềm, có thé tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau.2.3 Một số nghiên cứu về cây Phú Quý

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước

2.3.1.1 Các nghiên cứu về Aglaonema

Lê Hồng Giang và ctv năm 2006 đã nghiên cứu về môi trường nhân chồi cây Saosáng Aglaonema commutatum được ap dụng là môi trường MS có bồ sung super humic

250 mg/l + NAA I mg/l So sánh 8 nồng độ BA từ 0-6 mg/l Thí nghiệm được thực hiệntrong 2 điều kiện là nuôi cấy phòng cấy mô và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm sản xuấtthử Kết qua cho thay môi trường MS có bồ sung super humic 250 mg/l + NAA 1 mg/l+ BA 6 mg/l trong điều kiện phòng cay mô cho số chéi cao nhất 7,1 chỗồi trong 6 tuầnsau khi cấy và môi trường MS có bồ sung super humic 250 mg/1 + NAA 1 mg/1 + BA 2mg/l trong điều kiện phòng thí nghiệm sản xuất thử thì cho số chéi cao hơn 7,1 chéitrong 6 tuần sau khi cấy

Huỳnh Văn Trung năm 2006 đã nghiên cứu về môi trường nhân chỗi cây Sao sángAglaonema commutatum thu được kết quả cho thay môi trường MS có bé sung chất điềuhòa sinh trưởng BA 5mg/1 va NAA 1mg/1 cho kha năng nhân chồi cao nhất 3,2 chdi sau

45 ngày nuôi cấy

Nguyễn Hồng Ái năm 2011 đã nghiên cứu hiệu quả của BA lên sự nhân nhanh

chồi cây Phú Quý với các nồng độ 0, 1, 3, 5 mg/l, thu được kết quả môi trường MS có

bồ sung BA | mg/l cho chiều cao chồi 0,90 cm sau 8 tuần nuôi cấy

2.3.2.2 Các nghiên cứu liên quan đến kĩ thuật

Lê văn hòa và cộng tác viên năm 2012 đã nghiên cứu Nuôi cấy lớp mỏng tế bàocủa thân chồi non in vitro trên môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/l kết hợp với2,4-D 7 mg/l cho hiệu quả tạo mô sẹo cao (81,34%) và mô sẹo cứng chắc cao nhất

§

(64,77%) sau 8 tuần nuôi cấy; Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triểncủa mô seo là môi trường MS + NAA 2 mg/l kết hợp với 2,4-D 7 mg/1; Sự tạo phôi soma(và tái sinh chỗồi cây tre Rồng) từ mô sẹo trên môi trường MS bồ sung TDZ 0,01 mg/lđạt được 33,33% vào thời điểm 3 tuần sau khi cay, các chéi trong môi trường này sinhtrưởng và phát triển tốt.

Hồ thanh tâm và cộng tác viên năm 2020 đã nghiên cứu nâng cao hệ số nhân giống

in vitro và khảo sat quá trình thích nghỉ ngoài vườn ươm giống chuối laba (Musa sp.)Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA cho hiệuquả 100% số mẫu phát sinh chéi với số lượng trung bình 7,25 chồi/mẫu sau 10 tuần nuôicay Ở các giai đoạn tiếp theo, môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,5 mg/L BA cho hiệuquả nhân chồi cao nhất với số lượng trung bình 8,9 chồi/mẫu và chiều cao chồi trungbình đạt 3,76 cm/chồi Môi trường bồ sung 0,2 mg/L NAA thích hợp cho quá trình ra rễ

in vitro của chuỗi Laba Những cây chuối in vitro sinh và phát triển tốt ở điều kiện vườnươm khi được trồng trên giá thé có bổ sung tro, trau và phan bò đã được xử lý (1:1:1)với tỉ lệ sống đạt 100% và trọng lượng tươi cây đạt 5,06 g sau 30 ngày Kết quả nghiêncứu này cung cấp một quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh giống chuối Laba, nhằmtạo ra số lượng lớn cây giống chất lượng phục vụ cho công tác trồng trọt giống chuối

quý nay trên diện rộng.

2.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

2.4.1.1 Các nghiên cứu về Aglaonema

Mohammed Elsayed El-Mahrouk năm 2016 đã nghiên cứu một quy trình đơn giản

để tái sinh trong ống nghiệm của 4giaonema 'Valentine' bằng cách sử dụng mẫu cấychỗi nách đề nhân nhanh và sản xuất cây giống thật Các nồng độ khác nhau của BA (0,

1, 3, 5 va 7 mg/l), kinetin (0, 1, 3, 5 và 7 mg/l), TDZ (0, 0,5, 1,0, 1,5 và 2,0 mg/l), NAA

(0, 0,5 va 1,0 mg/l) và axit IBA (0, 0,5 và 1,0 mg/l) được sử dụng dé chup su tai tao Sutăng sinh chdi cao nhất (5,0) thu được trên môi trường Murashige va Skoog (MS) bésung 1,5 mg/l TDZ va 1 mg/l NAA Sự ra rễ in vitro dé dang đạt được với 100% ở tất

cả các nồng độ NAA va IBA được bổ sung vào môi trường MS có cường độ nửa hoặctoàn bộ Cây con tái sinh được di thực trong nhà kính với tỷ lệ sống 100% Phân tíchDNA đa hình (RAPD) được khuếch đại ngẫu nhiên đã xác nhận tính trung thực về mặt

di truyên của cây con tái sinh và cây me.

Ahmed A Barakat và Mohamed K Gaber năm 2018 đã nghiên cứu về câyAglaonema commutatum và đạt được kết quả tốt nhất cho giai đoạn khởi đầu, khi môitrường MS được tăng cường NAA và BA lần lượt là 2,00 và 1,00 mg/l Trong khi đó,môi trường tang cường với BA va NAA ở mức 4,00 và 1,00 mg/I, liên tiếp, cho kết quảtốt nhất cho giai đoạn nhân giống Đối với giai đoạn phát sinh thân rễ, kết quả tốt nhấtđược ghi nhận khi các chéi mới hình thành ở giai đoạn nhân giống được phân chia đơn

lẻ và nuôi cấy trên môi trường MS cộng với IBA va NAA lần lượt là 0,50 và 0,25 mg/l,dẫn đến số rễ trung bình hình thành trên mỗi mầm cao nhất

Mohamed M Abass và cộng tác viên năm 2018 đã được nghiên cứu dé tăng cườngnhân chéi của Aglaonema commutatum Kết quả chỉ ra rằng BA ở mức 8,0 mg/1 cho sốlượng chồi/mẫu cao nhất 4,08 chồi Các nồng độ khác nhau (0, 0,5, 1,0 hoặc 2,0 mg/l)của auxin (axit indoleacetic hoặc axit naphthaleneacetic) kết hợp với 8,0 mg/l BA đãđược thử nghiệm dé cải thiện sự nhân chồi

Totik và cộng tác viên năm 2011 đã nghiên cứu rằng khi nhân cụm chỗiAglaonema var với môi trường MS bồ sung TDZ 1,5 mg/l kết hop với BA 3mg/1 sau 2tuần và chuyền sang môi trường BA 3mg/I sau 4 tuần thì số chồi gia tăng 17 chôi

2.4.2.2 Các nghiên cứu liên quan đến kĩ thuật

EC Chena và ctv năm 2012 đã nghiên cứu quy trình vi nhân giống dựa trên tái sinhchi trực tiếp cho các giống Philodendron tự mọc Ba loại mẫu cấy (tức là phiến lá,cuống lá, đoạn đốt thân) đã được sàng lọc về khả năng tạo phôi sau ba tháng xử lý với0,5 mg/l của axit 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D), thiđiazuron (TDZ) hoặc cả hai Kếtquả chỉ ra rằng các phiến lá là những ứng cử viên kém cho sự hình thành phôi trong khicuống lá cho thấy tiềm năng tạo phôi ngẫu nhiên với tần suất 2,8 — 11,1% ở hai giốngđược thử nghiệm Các đoạn đốt thân là phản ứng nhanh nhất trong số ba loại vì các phôiđược hình thành trực tiếp sau khi xử ly TDZ ở tần suất 16,7 — 41,7% tùy thuộc vào giốngcây trồng Khi so sánh hiệu quả của các cytokinin khác nhau để tạo ra sự tăng sinh phôitrên các đoạn đốt thân, người ta nhận thấy rang các phương pháp xử lý 0,5 và 1 mg/l củakinetin (Kn) và 6-benzyladenine (BA) dẫn đến tỷ lệ phần trăm hình thành phôi cao hơn

so với phương pháp 0,5 và 1 mg/l.

10

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 6 năm 2023 tai Chi nhánhCông ty Cổ phần Công Nghệ Sinh Học TPECO, số 178A đường Nguyễn Ái Quốc,

Tp Biên Hoà, tỉnh Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Cây Phú Quý được sử dụng trong thí nghiệm là những cây sạch bệnh: không có

biểu hiện bệnh trên lá, thân cây đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, có chiều cao đồngđều và mẫu sử dụng ở đây là mẫu đốt thân cây Phú Quý

Quy trình xử lý mẫu: trước tiên là xử lý trước khi mang vô tủ cấy tại đây đoạn thânđược rửa với nước tiếp đến ngâm trong sunlight loãng trong vòng 10 phút rồi tiếp tụcmang đoạn thân đi tia dưới vòi nước cuối cùng là khử trùng bề mặt với cồn 70° và bỏ vô

hủ vô trùng Mang hủ vô trùng vào tủ cấy và tiếp tục xử lý, rửa bằng cồn 70° trong

30 giây và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút, tiếp đến mẫu được lắc đều với

11

vitamin 200 mg/l trong vòng 15 phút và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút, sau

đó mẫu được lắc đều bằng dung dịch khử trùng HgCl2 0,1% (được bổ sung với 0,5 mlTween 80) trong vòng 5 phút và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút lặp lại một lầnnữa và cuối cùng là lắc đều mẫu với kháng sinh 200 mg/I trong vòng 20 phút và rửa lạivới nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút Sau khi xử lý mẫu xong ta tiễn hành cắt đốt thân thànhtừng khúc có kích thước khoảng 0,8 cm đến 1,0 cm dé thực hiện thi nghiệm 1 và lớpmỏng ngang thân có kích thước khoảng 0,1 em đề thực hiện thí nghiệm 2

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Đề tài sử dụng thiết bị và dung cụ có sẵn tại chi nhánh Công ty Cổ phần CôngNghệ Sinh Học TPECO gồm: tủ cấy vô trùng tạo ra điều kiện vô trùng trong khoanglàm việc phục vụ trong quá trình cấy, xử lý mẫu; cán dao là dụng cụ cầm cùng với lưỡidao dùng để cắt mẫu trong quá trình nuôi cấy mô Cán dao được làm bằng thépkhông gi, có độ bền cao có chiều dài khoảng 12cm và lười dao được sử dụng trong thínghiệm là lưỡi dao số 22; đĩa cấy thường sử dụng là đĩa nhôm có phần đáy nông để cóthé xử lý mẫu thực vật và thao tác trên đó một cách dễ dàng, đĩa nhôm có đường kính

khoảng 20 cm, kẹp là dụng dụ dé gap mẫu, thuận tiện trong việc xử lý mau, bình xịt cồn,

bông gòn dùng dé đựng cồn hoặc dung môi hữu cơ giúp việc vệ sinh bề mặt nhẹ nhànghơn, đèn cồn là dụng cụ cần thiết có tác dụng khử trùng các dụng cụ, giảm tỉ lệ nhiễmtrong quá trình nuôi cấy mô, hủ nhựa là dụng cụ để chứa môi trường, cân kỹ thuật làdụng cụ dé cân các hóa chất, máy pH dùng dé do pH của môi trường đảm bảo nồng độion H' phủ hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, nồi hap dùng dé hap môi trường nhằm

tạo môi trường khử trùng hiệu quả.

3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Môi trường MS là tên của loại môi trường tổng hợp được pha sẵn, là tên viết tắt

của Murashige and Skoog medium, được phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio

Murashige và Skoog Folke K vào năm 1962 khi Murashige đang tìm kiếm một loại

hormone mới.

12

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS

Thành phân Nông độ (mg/l)

Ammonium nitrate (NH4NO3) 1650 Calcium chloride (CaC12, 2H2O) 440

Da luong Magnesium sulphate (MgSO4, 7H2O) 370

Potasstum phosphate (KH2PO4) 170 Potassium nitrate (KNO3) 1900 Boric acid (H3BO3) 6,2 Cobalt chloride (CoC12, 6H2O) 0,025 Cupric sulphate (CuSO4, 5H20) 0,025 Ferrous sulphate (FeSO4, 7H20) 27,8

Vi luong Manganese sulphate (MnSO4, 4 H20) 22,3

Potassium iodide (KI) 0,83 Sodium molybdate (Na2MoO4, 2H2O) 0,25 Zine sulphate (ZnSO4, 7H2O) 8,6 Na2EDTA 2H2O 3,72

FeSO4.7H2O 27,8

Be BOTS Na2EDTA.2H2O 37,3

Pyridoxine 0,5 Thiamine 0,1 Vitamin Glycine 2

m-Inositol 10

D-Pantothnic acid 0,5

Sau khi pha xong môi trường MS thì còn bổ sung 30 g/l đường và 5,0 g/l agar vàcác chất điều hòa sinh trưởng khác nhau phụ thuộc vào nội dung từng thí nghiệm Tiếpđến ta do pH sao cho pH trong khoảng 5,7 đến 5,8, thé tích dung dich sinh trưởng (môitrường nuôi cấy) trong hủ khoảng 30 ml/binh đến 35 ml/bình Môi trường nuôi cay đượchấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong vòng 18 phút Sau khi hấp xong

ta lay hủ ra lắc đều và dé môi trường nguội rồi tiễn hành sử dung

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy

Sau khi cấy xong thì mẫu được đưa vào phòng môi trường có điều kiện tối ưu nhất

dé cây có thé phát triển tốt nhất Nhiệt độ trong khoảng 25°C đến 28°C , thời gian nuôicay là 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng là 15 W/m2/s Độ am tối ưu dao động từ 60%đến 80% nếu độ 4m vượt quá 90% thì dùng quạt hút dé giảm độ âm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Ảnh hưởng của BA đến quá trình phát triển choi từ đốt thân

Việc kết hợp BA vào môi trường nuôi cây đã thúc day sự phát triển chồi nách vachiều dài chồi Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường

13

nuôi cấy quyết định sự phân hóa của tế bào (Tran Văn Minh, 1999) Đã có thí nghiệmnghiên cứu về nó như 2016 Mohammed Elsayed El-Mahrouk đã nghiên cứu sử dụngmau chéi nách dé nhân nhanh chồi với các nồng độ BA khác nhau.

Mục đích của thí nghiệm này là tìm được nồng độ BA có kết quả cao nhất đề pháttriển chồi từ mẫu đốt thân cây phú quý, bên cạnh môi trường MS cơ bản còn bổ sungchất điều hòa sinh trưởng IBA 0,5 mg/l và BA với những nồng độ khác nhau

Bang 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát triển chồi từ mẫu đốt thân

STT WNehitmthiic ‘Miftmimg TÔnEG9BÀ cự era

Ty lệ mẫu tạo chéi (%) =y's 7 ( 0) tổng số choi

Số chồi tạo thành (chéi)

tổng số chiều dài chồi

Chiều cao chéi (cm) = tổng số chồi

Tình trạng mẫu: hình thái, màu sắc

3.3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D đến cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào lớp mỏng

Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/ cytikinin trong môi trường nuôi cấyquyết định sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tạo phôisoma (Trần Văn Minh, 1999)

Mục đích của thí nghiệm này là tìm được nồng độ 2,4-D có kết quả tỉ lệ cảm ứng,

tỉ lệ phát sinh phôi cao nhất, ngoài môi trường MS cơ bản còn bé sung chất điều hòasinh trưởng BA 1,0 mg/l và 2,4-D với những nồng độ khác nhau

14

Bang 3.3 Nong độ 2,4-D đến sự quá trình cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào

lớp mỏng

Nông độ 2,4-DSTT Nghiệm thức Môi trường Số mẫu/LLL

Tình trạng mẫu như hình thái, màu sắc mẫu

3.3.3 Anh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh cụm choi

Mohamed M Abass và cộng tác viên năm 2016 cũng đã nghiên cứu đến sự sinhtrưởng và phát triển chồi của Aglaonema commutatum trong giai đoạn nhân giống vớicác nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 4, 8, 16 mg/I.Mục dich của thí nghiệm này là tim đượcnồng độ BA có kết quả số chồi nhiều nhất, ngoài môi trường MS cơ bản còn bé sungchất điều hòa sinh trưởng kinetin 0,2 mg/l và BA với những nồng độ khác nhau tùy thuộcvào nghiệm thức thí nghiệm Mẫu của thí nghiệm này là các chồi ở thí nghiệm 1 có chiều

cao khoảng 2 cm.

Bang 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh cụm chỗi

SIT HgĐPmUhG MốPhdớng TỔN PẢ Số muYỊT,

Cách bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệmthức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần, mỗi lần 9 mẫu Tổng số mẫu thí nghiệm 135 mẫu.

Số liệu ghi nhận sau 4 tuần và 8 tuần

Số chồi trung bình = nan

Tình trạng mẫu như hình thái, màu sắc mẫu

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử ly bang phan mém MINITAB 16.2.4, két quả được đọc dựa trên

bảng ANOVA.

16