DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 6 năm 2023 tai Chi nhánh Công ty Cổ phần Công Nghệ Sinh Học TPECO, số 178A đường Nguyễn Ái Quốc, Tp. Biên Hoà, tỉnh Đồng Nai.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Cây Phú Quý được sử dụng trong thí nghiệm là những cây sạch bệnh: không có
biểu hiện bệnh trên lá, thân cây đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh, có chiều cao đồng đều và mẫu sử dụng ở đây là mẫu đốt thân cây Phú Quý.
Quy trình xử lý mẫu: trước tiên là xử lý trước khi mang vô tủ cấy tại đây đoạn thân được rửa với nước tiếp đến ngâm trong sunlight loãng trong vòng 10 phút rồi tiếp tục mang đoạn thân đi tia dưới vòi nước cuối cùng là khử trùng bề mặt với cồn 70° và bỏ vô hủ vô trùng. Mang hủ vô trùng vào tủ cấy và tiếp tục xử lý, rửa bằng cồn 70° trong 30 giây và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút, tiếp đến mẫu được lắc đều với
11
vitamin 200 mg/l trong vòng 15 phút và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút, sau đó mẫu được lắc đều bằng dung dịch khử trùng HgCl2 0,1% (được bổ sung với 0,5 ml Tween 80) trong vòng 5 phút và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút lặp lại một lần nữa và cuối cùng là lắc đều mẫu với kháng sinh 200 mg/I trong vòng 20 phút và rửa lại với nước cất 3 lần mỗi lần 5 phút. Sau khi xử lý mẫu xong ta tiễn hành cắt đốt thân thành từng khúc có kích thước khoảng 0,8 cm đến 1,0 cm dé thực hiện thi nghiệm 1 và lớp mỏng ngang thân có kích thước khoảng 0,1 em đề thực hiện thí nghiệm 2.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Đề tài sử dụng thiết bị và dung cụ có sẵn tại chi nhánh Công ty Cổ phần Công Nghệ Sinh Học TPECO gồm: tủ cấy vô trùng tạo ra điều kiện vô trùng trong khoang làm việc phục vụ trong quá trình cấy, xử lý mẫu; cán dao là dụng cụ cầm cùng với lưỡi dao dùng để cắt mẫu trong quá trình nuôi cấy mô. Cán dao được làm bằng thép không gi, có độ bền cao có chiều dài khoảng 12cm và lười dao được sử dụng trong thí nghiệm là lưỡi dao số 22; đĩa cấy thường sử dụng là đĩa nhôm có phần đáy nông để có thé xử lý mẫu thực vật và thao tác trên đó một cách dễ dàng, đĩa nhôm có đường kính khoảng 20 cm, kẹp là dụng dụ dé gap mẫu, thuận tiện trong việc xử lý mau, bình xịt cồn, bông gòn dùng dé đựng cồn hoặc dung môi hữu cơ giúp việc vệ sinh bề mặt nhẹ nhàng hơn, đèn cồn là dụng cụ cần thiết có tác dụng khử trùng các dụng cụ, giảm tỉ lệ nhiễm trong quá trình nuôi cấy mô, hủ nhựa là dụng cụ để chứa môi trường, cân kỹ thuật là dụng cụ dé cân các hóa chất, máy pH dùng dé do pH của môi trường đảm bảo nồng độ ion H' phủ hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, nồi hap dùng dé hap môi trường nhằm
tạo môi trường khử trùng hiệu quả.
3.2.3. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Môi trường MS là tên của loại môi trường tổng hợp được pha sẵn, là tên viết tắt
của Murashige and Skoog medium, được phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio
Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 khi Murashige đang tìm kiếm một loại
hormone mới.
12
Bảng 3.1. Thành phần môi trường MS
Thành phân Nông độ (mg/l)
Ammonium nitrate (NH4NO3) 1650 Calcium chloride (CaC12, 2H2O) 440 Da luong Magnesium sulphate (MgSO4, 7H2O) 370 Potasstum phosphate (KH2PO4) 170 Potassium nitrate (KNO3) 1900 Boric acid (H3BO3) 6,2 Cobalt chloride (CoC12, 6H2O) 0,025 Cupric sulphate (CuSO4, 5H20) 0,025 Ferrous sulphate (FeSO4, 7H20) 27,8 Vi luong Manganese sulphate (MnSO4, 4 H20) 22,3 Potassium iodide (KI) 0,83 Sodium molybdate (Na2MoO4, 2H2O) 0,25 Zine sulphate (ZnSO4, 7H2O) 8,6 Na2EDTA. 2H2O 3,72 FeSO4.7H2O 27,8
Be BOTS Na2EDTA.2H2O 37,3
Pyridoxine 0,5 Thiamine 0,1 Vitamin Glycine 2
m-Inositol 10 D-Pantothnic acid 0,5
Sau khi pha xong môi trường MS thì còn bổ sung 30 g/l đường và 5,0 g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau phụ thuộc vào nội dung từng thí nghiệm. Tiếp đến ta do pH sao cho pH trong khoảng 5,7 đến 5,8, thé tích dung dich sinh trưởng (môi trường nuôi cấy) trong hủ khoảng 30 ml/binh đến 35 ml/bình. Môi trường nuôi cay được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong vòng 18 phút. Sau khi hấp xong ta lay hủ ra lắc đều và dé môi trường nguội rồi tiễn hành sử dung.
3.2.4. Điều kiện nuôi cấy
Sau khi cấy xong thì mẫu được đưa vào phòng môi trường có điều kiện tối ưu nhất dé cây có thé phát triển tốt nhất. Nhiệt độ trong khoảng 25°C đến 28°C , thời gian nuôi cay là 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng là 15 W/m2/s. Độ am tối ưu dao động từ 60%
đến 80% nếu độ 4m vượt quá 90% thì dùng quạt hút dé giảm độ âm.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Ảnh hưởng của BA đến quá trình phát triển choi từ đốt thân
Việc kết hợp BA vào môi trường nuôi cây đã thúc day sự phát triển chồi nách va chiều dài chồi. Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường
13
nuôi cấy quyết định sự phân hóa của tế bào (Tran Văn Minh, 1999). Đã có thí nghiệm nghiên cứu về nó như 2016 Mohammed Elsayed El-Mahrouk đã nghiên cứu sử dụng mau chéi nách dé nhân nhanh chồi với các nồng độ BA khác nhau.
Mục đích của thí nghiệm này là tìm được nồng độ BA có kết quả cao nhất đề phát triển chồi từ mẫu đốt thân cây phú quý, bên cạnh môi trường MS cơ bản còn bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IBA 0,5 mg/l và BA với những nồng độ khác nhau.
Bang 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát triển chồi từ mẫu đốt thân.
STT WNehitmthiic ‘Miftmimg TÔnEG9BÀ cự era
(mg/l)
i Al MS 0,5 9 2 A2 MS 1.0 9 3 A3 MS L5 9 4 A4 MS 2.0 9 5 A5 MS 2.5 9
Cách bố trí thí nghiệm: thi nghiệm được bố trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần, mỗi lần 9 mẫu. Tổng số mau thí nghiệm 135 mẫu.
Số liệu được ghi nhận sau 2, 4, 6 tuần nuôi cay và được tinh là 1 chồi khi chồi cao hơn hoặc bằng 0,7 cm tính từ gốc tới đỉnh chdi.
số chồi dạt tiêu chuẩn
x 100
Ty lệ mẫu tạo chéi (%) =y's 7 ( 0) tổng số choi
Số chồi tạo thành (chéi)
tổng số chiều dài chồi
Chiều cao chéi (cm) = tổng số chồi Tình trạng mẫu: hình thái, màu sắc.
3.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào lớp mỏng
Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỷ lệ auxin/ cytikinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tạo phôi soma (Trần Văn Minh, 1999).
Mục đích của thí nghiệm này là tìm được nồng độ 2,4-D có kết quả tỉ lệ cảm ứng, tỉ lệ phát sinh phôi cao nhất, ngoài môi trường MS cơ bản còn bé sung chất điều hòa sinh trưởng BA 1,0 mg/l và 2,4-D với những nồng độ khác nhau.
14
Bang 3.3. Nong độ 2,4-D đến sự quá trình cảm ứng, phát sinh phôi từ tế bào
lớp mỏng
Nông độ 2,4-D
STT Nghiệm thức Môi trường Số mẫu/LLL (mg/l)
1 Bl MS 0,5 9 2 B2 MS 0,8 9 3 B3 MS 1,1 9 4 B4 MS 1,4 9
§ B5 MS 1,7 9
Cach bé tri thi nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiêu đơn nhân tổ với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần, mỗi lần 9 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm 135 mẫu.
Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy.
ro a ee số mẫu cảm tn
Ti lệ mau cảm ứng (3%) = ca x 100
tong số mau
số mẫu phát sinh phôi
x 100
Tỉ lệ mẫu phát sinh phôi (%) =
tổng số mẫu
Tình trạng mẫu như hình thái, màu sắc mẫu.
3.3.3. Anh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh cụm choi
Mohamed M. Abass và cộng tác viên năm 2016 cũng đã nghiên cứu đến sự sinh trưởng và phát triển chồi của Aglaonema commutatum trong giai đoạn nhân giống với các nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 4, 8, 16 mg/I.Mục dich của thí nghiệm này là tim được nồng độ BA có kết quả số chồi nhiều nhất, ngoài môi trường MS cơ bản còn bé sung chất điều hòa sinh trưởng kinetin 0,2 mg/l và BA với những nồng độ khác nhau tùy thuộc vào nghiệm thức thí nghiệm. Mẫu của thí nghiệm này là các chồi ở thí nghiệm 1 có chiều
cao khoảng 2 cm.
Bang 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh cụm chỗi.
SIT HgĐPmUhG MốPhdớng TỔN PẢ Số muYỊT,
(mg/l)
1 Cl MS 1,0 9 5 C2 MS L5 9 3 C3 MS 2,0 9 4 C4 MS 2,5 9 5 CS MS 3.0 9
15
Cách bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu đơn nhân tố với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần, mỗi lần 9 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm 135 mẫu.
Số liệu ghi nhận sau 4 tuần và 8 tuần.
Số chồi trung bình = nan
Tình trạng mẫu như hình thái, màu sắc mẫu.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử ly bang phan mém MINITAB 16.2.4, két quả được đọc dựa trên
bảng ANOVA.
16