Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái và di truyền nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt bằng chỉ thị phân tử ISSR

trên quả ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ, đánh giá đa dang di truyền của 32 mẫu nam Colletotrichum spp.bằng đặc điểm hình thái sinh học và bằng chỉ thị sinh học phân tử với 8 primer ISSR.. M

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ĐÁNH GIA SỰ DA DANG VE ĐẶC DIEM HINH THÁI VÀ DI

TRUYEN NAM Colletotrichum spp GAY BENH THAN THU

TREN OT BANG CHI TH] PHAN TU ISSR

SINH VIEN THUC HIEN: HUYNH THUONG VUONG

NGANH : BAO VE THUC VAT

KHOA : 2019 — 2023

Tp Hồ Chi Minh, thang 08/2023

ĐÁNH GIA SỰ ĐA DẠNG VE DAC DIEM HÌNH THÁI VÀ DI

TRUYEN NAM Colletotrichum spp GAY BỆNH THAN THU

TREN OT BANG CHÍ THI PHAN TU ISSR

Tac gia

HUYNH THUONG VUONG

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

Chân thành cảm ơn bạn Mai, bạn Chính, bạn Hân, bạn Thống, chị Thoả, anh

Thắng và tất cả các bạn trong phòng lab 105, luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời

gian thực hiện khóa luận này.

Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến ba mẹ, các anh chị tronggia đình vì luôn là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt quãng đời sinh viên của mình.Không ai khác, con tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nỗ lực của con sẽ

là động lực mạnh mẽ nhất giúp con thành công trên con đường mà mình đã chọn Mếnthương gia đình rất nhiều!

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái và di truyền nắmColletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt bang chỉ thị phân tử ISSR” đã được thực

hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật — Khoa Nông học, Trường Dai học

Nông Lâm Thành phố Hồ Chi Minh từ tháng 2/2023 đến tháng 8/2023 Mục tiêu nghiêncứu: đánh giá khả năng gây hại của 32 mẫu nam Colletotrichum spp trên quả ớt chỉ

thiên Hai mũi tên đỏ, đánh giá đa dang di truyền của 32 mẫu nam Colletotrichum spp.bằng đặc điểm hình thái sinh học và bằng chỉ thị sinh học phân tử với 8 primer ISSR

32 mẫu nam Colletotrichum spp được quan sat đặc điểm hình thái và đo kíchthước bào tử giác bám; lây nhiễm bệnh nhân tạo trên ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ và tiễn

hành thực hiện PCR — ISSR với 8 primer (AF80820, AF80821, AF80822, AF80823, AF80825, UBC808, UBC810 va UBC834).

Đánh giá đa dang di truyền về đặc điểm hình thái chia thành 3 nhóm chính là nhóm

I gồm 3 mẫu nam thuộc loài C gloeosporioides và 29 mau thuộc loài C scovillei còn lạichia thành 2 nhóm (II và III) Kiểm tra khả năng gây bệnh của 32 mẫu nam Colletotrichumspp lên qua ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ cho thấy tất cả các mẫu nam đều có khả năng gâybệnh, tuy nhiên có sự khác nhau về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh giữa các nghiệm thức Tỷ lệbệnh dao động từ 11,11 — 99,44% và 3,70 — 47,53% đối với chỉ số bệnh Điều này chothấy, mặc dù cùng một loài nhưng giữa các mẫu nam vẫn có sự khác biệt đáng kể

Đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR — ISSR bang 8 primer cho sản

phẩm khuếch đại là 134 băng, trong đó có 120 băng đa hình chiếm tỷ lệ 89,9% và 14

băng đồng hình chiếm tỉ lệ 10,4% Sản phâm khuếch đại có kích thước từ 100 — 3000

bp Kết quả của 8 chi thị ISSR sử dụng cho hệ số tương đồng di truyền trung bình là

0,64 và chia 32 mẫu nắm thành 5 nhóm chính Kết quả này chứng minh được các mẫunam Collectotrichum spp được khảo sat có sự đa dạng cao về mặt di truyền.

MỤC LỤC

Trang TAOS 2523500 0000TNGE2GGEDHGRHGIEERIAGSIIEGHDNGGDRRRIIGNGISUENDGRGRRRRIENGRNNQSSgfibbaaiaakasali 1

Ll CAM ƠÏgáxsx8s6561818615151515158636536565380460358550513845803394834853823138XE33E8ED42ETISSEELEEGEE1S1S8503001811650088030 il

A ei ae ca cic are iii

V011 1V

U19 chit viét 0 .1354H BH, ÔÒỎ vi

[anh sách cá Bane sssszsssseigsontrttgaatebSd0s)'GIRGRGIEGRGESSSIEIRGIIGBN-SitSsegiGBAiSiksg2sosesveedi vu Dati SAGh CG HÌNiHcssssesseeessssrobsnshoDiSieADEEG0155GĐE05TSRGPEHGSISHSBSSLHETRHISEHGHSHGSEHESDIESGHESSEIG1G5050028548 VII

1.1 Tổng quan về nam Colletotrichum SSp -. 22-552©22255255222+2£S222++EE+2E2z+zzzsrve 3(BAR dec ged, cnsaoaeaesoerorgtiiiicrtirtigtioERGS0S8000G08009/08000/0300 68.3 3I2 hố A ene cern CS 41.1.3 Đặc điểm sinh học va sinh thai c.c.ccccccecccccseesessesseseesessesessessesessesseseeeeseesnesesseeees 41.1:3.1 Hình thức sống dị đưỡng và bán dj durGing, scccn<ccsninnsssarcnvsasnssnneassetnnsrnnsincersncinss 41.1.3.2 Hình thức sống hoại sinh 25-2 2223 24 2422212231121 7711121111121 21 2.1 2Xe 51.1.3.3 Hình thức sống nội sinh - 2-22 2+S222EE2EEt2EE2EEE2EE2212732221271221221 21222 e2 >)1.1.4 Co ché xi midi 3 5

115! VOn& 601 etngnnecietsniohiEiGESEDNESEESEHEEEESESESEINSICISGSBSBEDTVEREESHĐEBEGEISESTSEREEHERGGIMISUSEEEHSSWS91H4Đ- 7

1.1.6 Đặc điểm gây hại 2-22 2222 2212212211221221121122112112111211211111211211211211 211 1 e0 41.1.7 Nghiên cứu về nam Colletotrichum gloeosporioides -: 222z55+522z£: 71.1.8 Nghiên cứu về nam Colletotrichum 4€HÍ@MIHH -22-©2:©2252225222+222222z2+2222z<: §1.1.9 Nghiên cứu về nắm Colletotrichum fFMHCAfIHH 22-52- 55+ 5s+2s+2+222+2++£s+zszzszss2 9

1.2 Bénh than thu ni i00 o 10

1.2.1 Nghiên cứu về các loài nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt 10

1.2.2 Triệu chứng của bệnh than thư trên ớt - 5 252222222 tzsrerrrrrrrrrree 10

1.3 Phân tích đa dang di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử - 2- 11

1.3.1 Khái niệm đa dang di truyễnn 2: 2¿©2222S222222E22E22212212251221211221 2122222 111.3.2 Các chi thị sử dụng trong nghiên cứu da dang di truyền -2 5252552 12

1.3.3 Ky thuật ISSR ( Inter — simple Sequence RepeatS) - cs-ccccsccsccseres 14

1.3.4 Đánh giá đa dang di truyên 2-22 22222221221221122122112212211211221211211 2122 161.4 Một số nghiên cứu về đa dạng hình thai và da dang di truyền chi nắm Colletotrichum

spp trên thế giới và Việt Nam - 2: 2+2s+2S22ESEEEE1221221212121212121 212 e6 17Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 182.1 Nội dung nghiên cứu đề tài - 222252 2222212252221221121122112112712211211 212 2e 182.2 Thời gian và địa điểm - 2-22 2222 2E122E22EE2E12112212112112211211211211221 21.2 re 182.3 Đối tượng và vật liệu nghiên CUM oo .ccccccecesceccssesseesesessessssecseesssessessssessessessseeseeeees 18

2.3.2 Vat li@u nghién COU ecceeccecceseceseeseceeeseescessecseeesecseeeaeceeeeseeseeeaeeseeeseeeeeeaes 18 2.4 Phuong phap nghién Ciru 1 19

2.4.1 Đánh giá đặc điểm hình thái nam Colletotrichum Spp -. -: 5-552-55-552 19

2.4.2 Đánh giá khả năng lây bệnh của các dong nam Colletotrichum Spp - 19

2.4.3 Phân tích đa dạng di truyền nắm Colletotrichum Spp .- -. -: 5 - 212.4.3.1 Ly trích DNA từ mẫu mame ccccccececccesessesseeseseseeessesessssesesstssessseneaesaeenees 22

2ZA32 Phan ng PGR sasgisescioiossseoitkedoslGiesli8905450038602L8953105a98538LXGSERGSAICESSM4SduSSp4EEdLS8S& 23

2.4.3.3 Điện di đọc kết qua PCR trên gel agarose 1,5% -¿ z22z+22+22zze: 252.4.3.4 Đánh gia đa dạng về đặc điểm hình thái va đi truyễn 2-2 52 25QAA hon 7n ảẳỲ 26Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-s<©ces<eccessetzvssecrveseee 273.1 Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái các mẫu nam Colletotrichum spp 273.2 Đánh giá khả năng gây bệnh của các dòng nắm Colletotrichum spp 3 Ï3.3 Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm di truyền của các chủng nam Colletotrichum spp

gay bệnh than thư hại ớt bằng chỉ thi phân tử ISSR -+ -< -343.3.1 Sản phẩm PCR với primer ISSR 22 522s£SEezEezsersersersersersrrrreeree.e 343.3.2 Phân tích sự đa dang di truyền của 32 mẫu nam Colletotrichum spp gây bệnh than

thự tr UO EaieessssierseiaortteookitibptitledgtripltntEiskgExopttlssdigtSorclolSkb.Srl teongeouii fniclot3lrgssatcel 42

KẾT LUẬN VA HỆ NGH[eaeeanaeiearedadoiooiiicggo49012310910043062000000080010900 48

TÀI LIEU THAM KHẢO -22-°C2£€EE2Z€EE2ZCEE2Z£E22zeeC2vzzetvvzz.trrvaeee 49

„:058 0i 00007 ÔÔỎ 55

DANH SÁCH CHU VIET TAT

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

bp base — pair

ctv Cong tac vién

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleotides triphosphate

ISSR Inter - simple sequence repeats

(Khuéch dai vùng giữa 2 đoạn có cùng kiểu lặp lại)

NCBI National Center for Biotechnology Information

(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)

NSC Ngày sau cây

NTSYSpe Numerical Taxanomy System personal computer

PCR Polymerase chain reaction

(Chuỗi phan ứng nhân ban DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt)

PDA Môi trường Potato Dextrose Agar

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

(DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên)

SAHN Sequential Agglomerative Hierarchical Non — overlapping UPGMA Unweighted Pair — Group Method with Arithmetical Mean

(Phương pháp nhóm cặp không điều chỉnh các giá trị trung bình

số học)

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 1.1 Các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu da dang di truyền 13Bang 1.2 Ưu điểm và nhược điểm của các chỉ thị phân tử -2-2 15Bang 2.1 Danh sách các mẫu nam Colletotrichum spp sử dụng trong thí nghiém 22Bảng 2.2 Thành phan phản ứng PCR với primer -¿22222EEE222+222222222zcz 24

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ISSR - 5-5552 24 Bảng 2.4 Danh sách các primer được sử dung trong phản ứng PCR — ISSR 24

Bảng 2.5 Các hệ số phân tích đa dang di truyền 22-2222222E22Z++22222zzrtrrvzrcrer 26Bảng 3.1 Tỷ lệ bệnh và chi số bệnh của nam Colletotrichum spp trên quả ớt ở 6 NSC 33

Bảng 3.2 Nhiệt độ bắt cặp của 8 primer ISSR được sử dụng -7-c+c+c<c+ 34

Bảng 3.3 Số băng khuếch đại của 8 primer ISSR 2 ©222222222222222222ztrrrsee 35Bang 3.4 Hệ số tương đồng di truyền của 32 mẫu nắm Colletotrichum Spp 43Bang 3.5 Hệ số tương đồng di truyền của 32 mẫu nam Colletotrichum spp (tĐ, 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Bản đồ phân bố của nắm Colletotrichum spp trên thé giới - 3Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của loài Colletotrichum Spp - -2 -55222-z- 6

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh than thư trên quả ớt do nam Colletotrichum spp 11

Hình 1.4 Kỹ thuật ISSR mdi đơn (AG)s, non — anchored (a), 3’ — anchored (b) va

5’-anchored (©) coua nong idNGTODENGIG00SGGI80CQGIGGHEIGIEVRSGIIIODRQBNSGAdSEIDAGUDSSGGAGESDkĐã88 14

Hình 2.1 Phân cấp chỉ số bệnh than thư trên ớt -2-©222¿2222EEE2222zz+t22E2Szcez 21Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu nam nhóm |,, 2 22©2222E222£+222222+2 28Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm nhóm ÏI, 2-2 22E£2£ES£2222+z 29Hình 3.3 Đặc điểm hình thái của các mẫu nam nhóm II], 2222222222222 30Hình 3.4 Triệu chứng bệnh do nam Colletotrichum spp sau 6 ngày trên quả ớt chỉ thiên

Hal mt 61 05/5 32

Hình 3.5 San phâm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR primer AF80820 .36Hình 3.6 Sản phâm PCR được khuếch dai dựa vào kỹ thuật ISSR với primer AF80821 36Hình 3.7 San phâm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer AF80822 37Hình 3.8 Sản phẩm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer AF80823 38Hình 3.9 Sản phâm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer AF80825 39Hình 3.10 Sản phẩm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer UBC808 39Hình 3.11 Sản phẩm PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer UBCS10.Hình 3.12 Sản pham PCR được khuếch đại dựa vào kỹ thuật ISSR với primer UBC834 41Hình 3.13 Cây phân nhóm di truyền 32 mẫu nắm Colletotrichum spp - 45

GIỚI THIỆU

x K À

Đặt vân đề

Trong số các bệnh hại ớt, bệnh than thư do nắm Colletotrichum Sp gây ra được

xem là nguy hiểm nhất (Than va ctv, 2008), là một trong những bệnh gây ảnh hưởng

đến giá trị kinh tế, gây giảm năng suất thương mai từ 10% đến 80% ở các nước dang

phát triển (Poonpolgul va Kumphai, 2007) Đối với nắm Colletotrichum gây bệnh thanthư trên ớt, các nghiên cứu gan đây đã có những thay đồi lớn về thành phan loài so với

công bố trước đây Đến nay, nguyên nhân gây bệnh than thư trên ớt được chứng minh cóliên quan ít nhất đến 13 loài Colletotrichum bao gồm: C gloeosporioides, C truncatum (C

capsici), C acutatum, C coccodes, C dematium, C nigrum, C atramentarium, C fructicola, C siamense, C boninense, C brevisporum, C.cliviae va C scovillei (Than va

ctv, 2008; Sharma va Shenoy, 2013) Tại Việt Nam đã có it nhất 7 loài là C acutatum, C

capsici, C gloeosporioides sensu stricto, C nigrum, C fructicola, C siamense, C.

aeschnomenes được ghi nhận gây bệnh than thư ở các vùng trồng ớt trên toàn quốc (LêĐình Đôn và ctv, 2012; Nguyễn Duy Hưng, 2017) Trong những năm gần đây, nhiều nghiêncứu phân loại lại nam Colletotrichum được thực hiện, chủ yêu dựa trên phân tích phân tử(Cannon và ctv, 2012; Damm va ctv, 2012; Weir va ctv, 2012) Các nghiên cứu chỉ ra rằng,

C gloeosporioides và C acutatum thực chất là phức hợp loài, trong đó C gloeosporioidesgồm ít nhất 22 loài khác nhau (Weir và ctv, 2012) và C acutatum gồm ít nhất 31 loài khácnhau (Damm và ctv, 2012) Sự đa dang trong quan thé nắm Colletotrichum spp cho thay

mối tương quan giữa phân bồ di truyền va địa lý biến động rat lớn

Việc nhận dạng và phân loại các loài nam Colletotrichum dua trên đặc điểm hìnhthái không đủ cơ sở dé phân biệt loài do sự biến đổi về hình thái và kiểu hình giữa cácloài trong điều kiện môi trường khác nhau Cannon và ctv (2012) cho rằng dữ liệu thu

được từ các phân tích axit nucleic sẽ cung cấp khuôn khô đáng tin cậy nhất dé xây dựng

phân loại Colletotrichum vì các đặc tinh DNA không bi ảnh hưởng trực tiếp bởi các yếu

tố môi trường Việc xác định chính xác các loài nắm Colletotrichum spp cô ý nghĩa rat

lớn trong việc phòng trừ bệnh Mối liên hệ giữa đặc điểm hình thái, khả năng gây bệnh

và đặc điểm di truyền bằng chỉ thị sinh hoc phân tử ISSR trên các chủng namColletotrichum spp vẫn chưa được có công bồ nào được thực hiện ở Việt Nam Chi thị

ISSR cho sản phâm PCR ổn định do đoạn mồi (primer) dai hơn và tỷ lệ phan trăm băng

đa hình cao hơn so với chỉ thị RAPD (Blair và ctv, 1999) Chính vi thực tiễn trên, đề tài

“Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái và di truyền nam Colletotrichum spp

gây bệnh thán thư trên ớt bằng chỉ thị phân tử ISSR”, được thực hiện nhằm khảo sát

sự đa dạng và đặc điểm hình thái và mối quan hệ di truyền của những chủng nam gâybệnh thán thư hại ớt để từ đó tìm ra được primer đặc trưng nhận dạng các chủng nắm

Colletotrichum spp.

Muc tiéu dé tai

Đánh giá kha năng gây hại của 32 mẫu nam Colletotrichum spp gây bệnh trên qua ớt

chỉ thiên Hai mũi tên đỏ.

Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái và di truyền một số loài nắmColletotrichum spp gây bệnh thán thư trên ớt bằng chỉ thị phân tử ISSR

Yêu cầu

Quan sát đặc điểm của tản nắm, sợi nắm, đo kích thước bào tử và giác bám nhằm đánh

giá được sự đa dạng về đặc điểm hình thái của các chỉ nắm Colletotrichum spp

Khuéch đại thành công DNA các mẫu nắm với các đoạn mồi ISSR

Phân tích được kết quả kỹ thuật ISSR bằng phần mềm thống kê di truyền

Giới hạn đề tài

Chỉ nghiên cứu giới hạn 32 mẫu nắm Colletotrichum spp gây bệnh than thư

trên ớt do phòng thí nghệm Bệnh cây khoa Nông học cung cap.

Chi sử dung 8 primer ISSR dé đánh giá đa dạng di truyền

Chưa thực hiện do đường kính tản nắm, quan sát và đánh gia được đĩa cành

sợi nam Colletotrichum spp.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tống quan về nam Colletotrichum ssp

1.1.1 Phân bố va phố ky chủ

Nam Colletotrichum là loại nam kí sinh đa kí chủ (Agrios, 2005), phân bồ rộng trênkhắp thế giới Một số loài Colletotrichum hoặc các biotypes có thé cùng gây hại trên một

ký chủ Bệnh than thư trên xoài gây ra bởi Colletotrichum acutatum và Colletotrichum

gloeosporioides Dâu tây có thé bị nhiễm Colletotrichum fragariae, Colletotrichum

acutatum va Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên cả thân lá và quả Hạnh nhân va

các loại trai cây rung lá khác có thé nhiễm Colletotrichum acutatum hoặc Colletotrichumgloeosporioides Cam quýt, cà phê, bau bi, cà, ớt đều có thé bị gây hại (Freeman và ctv,1998) Trên ớt được chứng minh có liên quan ít nhất đến 13 loài Colletotrichum bao gồm:

C gloeosporioides, C truncatum (C capsici), C acutatum, C coccodes, C dematium,

C nigrum, C atramentarium, C fructicola, C siamense, C boninense, C brevisporum,

C.cliviae va C scovillei (Than va ctv, 2008; Sharma va Shenoy, 2013) NắmColletotrichum spp tập trung chủ yếu tại Nam A đặc biệt là Trung Quốc, An Độ, vùng

bờ biển Tây của Nam Mỹ, một số quốc gia Tây Phi đặc biệt là Ghana (Hình 1.1)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Nắm Colletotrichum có SỢI nam nội sinh, mảnh, phân nhánh, không mau, có váchngăn, sợi nắm có nội bao và gian bào Nhiều hat dau được hình thành trong mỗi sợi nam,khi sợi nắm già trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành đạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoàicùng Nam Colletotrichum sinh sản vô tính bang bao tử, bao tử đính phát triển trên cuốngbao tử dang quả thể là cụm cuống bao tử Cụm cuống bao tử có dạng đĩa phẳng, mỗicụm cuống bao tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bao tử trong suốt Cuốngbảo tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùngvới bao tử và cuống bao tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông cứng dài,thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào, cấu trúc như tơ cứng Một vải loại nam củaColletotrichum có hoặc không có lông cứng có thé được kiêm soát bởi sự thay đổi của

độ 4m Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử nảy mam từ một đến nhiều ống mam dé

hình thành sợi nam, gây ton thương trên bề mặt vật chủ Soi nam gia đôi khi hình thànhvách dày, màu nâu sậm, hình cầu gọi là hậu bào tử, có thé ở tận cùng hoặc chen gitra sợinam và tổn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mam dé hình thành sợinam mới (Lê Hữu Vàng, 2021) Cũng như những loại nam gây bệnh khác,Colletotrichum tồn tại chủ yêu giai đoạn vô tính, còn giai đoạn hữu tính chủ yếu tồn tạitrên mô đã chết (Sutton, 1995)

1.1.3 Đặc điểm sinh học và sinh thái

1.1.3.1 Hình thức sống dị dưỡng và bán dị dưỡng

Hình thức sống di dưỡng sinh học có nghĩa là mầm bệnh ở trong mô thực vậtsống và hap thụ các chất chuyên hóa của thực vật dé phát triển mà không giết chết tếbào thực vật (Mendgen và Hahn, 2002) Nam di dưỡng san xuất cấu trúc nắm chuyênbiệt, haustoria, đó là câu trúc nhiễm trùng biệt hóa cao cần thiết cho cơ chế sinh bệnh

và tạo điều kiện thuận lợi cho các mối quan hệ ký sinh với các cây ký chủ sống đề hấpthụ cacbon và nito (Agrios, 2005; De Silva va ctv, 2016) Nam hình thành haustoria vàtham gia vào quá trình chống lại sự phan ứng của tế bao ký chủ (Voegele và Mendgen,2011) Các cây ký chủ vẫn sống, không có biểu hiện rõ rang các triệu chứng bệnh, tuynhiên sự phát triển của cây có thé bị ảnh hưởng Đề xâm chiếm thành công tế bao thực

vật, chúng cân tiệt ra nhiêu loại protein điêu khiên chức năng sinh lý của vật chủ và môi

trường sinh hóa (O’Connell và ctv, 2012; Guyon va ctv, 2014) Nhiều loài

Colletotrichum có thé có hình thức sông di dưỡng trong giai đoạn đầu, sau đó là chuyềnsang một kiểu sống hoại sinh do đó được gọi là sinh vật tự dưỡng Đối với những loàinay, nhiễm trùng sơ cấp được hình thành trong các tế bào biểu bì mà không giết chếtcác tế bào Tiếp theo là giai đoạn hoại tử, nhiễm trùng thứ cấp xâm nhập và giết chếtcác vùng tế bào lân cận (Perfect va ctv, 1999; Barimani va ctv, 2013)

1.1.3.2 Hình thức sống hoại sinh

Các mầm bệnh hoại sinh là những mam bệnh chủ động lây nhiễm và xâm chiếm

tế bào thực vật dẫn đến chết tế bào (Kan, 2005) Sinh vật hoại tử tế bào thường tiết racác enzym lytic dé phân hủy thực vật hoặc chất độc dé làm chết các mô của thực vật.Mam bệnh sau đó tồn tại trong các tế bào chết hoặc sắp chết dé hoàn thành vòng đời(Gan và ctv, 2013) Kiểu sống hoại sinh trái ngược với kiểu sống của các mầm bệnh dịdưỡng lấy chất dinh dưỡng từ tế bào sống do đó phải duy trì khả năng tồn tại của vật

chủ (Kan, 2005) Hầu như các loài Colletotrichum phát triển giai đoạn hoại sinh ở một

số điểm trong chu kỳ sống của chúng ngoại trừ một số ít tồn tại hoàn toàn như

endophytes (Prusky và ctv, 2013; Chang và ctv, 2014).

1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm

Nắm có thê xâm nhiễm được vào bên trong mô cây kí chủ và gây bệnh cần phảitrải qua các giai đoạn: Bào tử phát triển trên bề mặt kí chủ > Lay lan và bám trên bềmặt ® Bao tử nảy mầm Hinh thành đĩa áp ® Xâm nhiễm qua lớp biểu bì của cây ®Phát triển và lây lan ra các vùng xung quanh ® Tao 6 nam và bao tử (Prusky va ctv,2013) Theo Wharton và Diéguez Uribeondo (2004) nam Colletotrichum spp xâmnhiễm vào mô kí chủ theo hai cách: bán kí sinh và hoại sinh (Hình 1.3)

Intracellular hemibiotrophy Subcuticular intramural necrotroph

B

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của loài Colletotrichum spp (Wharton va DiéguezUribeondo, 2004), A: đĩa áp (appressorium); C: bào tử (conidium); Cu: biểu bì(cuticle); E: mô biéu bì (epidermal); ILS: đốm sáng (internal light spot); M: tế bao thịt

lá (mesophyll cells); N: hoại sinh (necrotrophic); PH: sợi nam sơ cấp (primary

hyphae); PP: hình thành vòi xâm nhiễm (penetration pore and peg); ScH: dưới lớp

biểu bì (subcuticular); SH: sợi nam thứ cấp (secondary hyphae)

Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm(PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào kí chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu

sáng (ILS) Ở hình 1.2 A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế

bảo biểu bì của kí chủ và phông to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nắm có kíchthước lớn, được gọi là sợi nam sơ cấp (PH), sợi nam này có thể định vị lan sang các mô

biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế cận Trong giai đoạn dau của sự định cư này, sự tươngtác giữa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc Tiếp theo sau là giai đoạn hoại sinh

(N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi nam thứ cấp mỏng (SH) Các sợinắm thứ cấp này đâm xuyên vào trong các tế bào và len lỏi theo các ngã gian bào đồng

thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào kí chủ Ở hình 1.2 B là cách

xâm nhiễm kiểu hoại sinh, sự định cư trong tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới lớp biểu bì(ScH), và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nam bên trong vách hoặc nếu cóthì giai đoạn này rất ngắn Nắm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào và

qua các ngả gian bao (Wharton và Diéguez - Uribeondo, 2004).

Bào tử nam Colletotrichum nảy mam trong nước khoảng 4 giờ (Vũ Triệu Man,2007) Để xâm nhập vào bên trong kí chủ, sợi nam hình thành đĩa áp dé tao áp lực xâmnhiễm Sau khi xâm nhiễm vào bên trong kí chủ, sợi nam sẽ tan công bang cách len lõi

vào bên trong tế bào tiết ra enzyme phân hủy vách và màng sinh chất của tế bào Khi vào

bên trong tế bào thì nắm tạo thành vòi hoặc đầu hút chất dinh dưỡng của tế bào kí chủ

1.1.5 Vòng đời

Da phan các loài Colletotrichum ở dang bao tử và tồn tại trong đất hoặc trên cácmảnh vụn đã bị nhiễm bệnh Bảo tử nam sau khi tiếp xúc với vật chủ, chúng sẽ nảy nam,hình thành đĩa bám và bat đầu xâm nhiễm vào các tế bao của vật chủ, giai đoạn tiếp theo

là hoại tử do các tế bao vật chết đi vì mat chất dinh dưỡng Lúc này trên vật chủ như trái

cây, thân hoặc lá xuất hiện các vết bệnh, thối nhũn, mau đen, hơi lõm và có thé có chất

nhay Giai đoạn tiếp theo là nam Colletotrichum spp sẽ hình thành các cành sinh bào tử

và phát tán bào tử, hoặc chúng sẽ tồn tại đưới dạng sợi nam hay hach nam trong dat, tan

dư thực vật hay con gọi là giai đoạn tiềm ấn, bào tử hình thành và ton tại trong các thểquả dạng chai, khi điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát triển thành các túi bào tử và pháttán bảo tử tiếp tục vòng đời

1.1.6 Đặc điểm gây hại

Thán thư ớt là một trong những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng trên quả, gâythiệt hại nghiêm trọng đối với quả trước và sau thu hoạch (Bosland và Votava, 2003)

Vết bệnh thường có hình tròn và xuất hiện những chấm nhỏ li ti màu vàng xếp thành

những vòng tròn đồng tâm bên trong Vào mùa mưa vết bệnh thường có màu cam hồng

và tâm vết bệnh có màu đen có thể có dịch nhày Khi vết bệnh khô lại vỏ quả có hiệntượng lõm xuống (Mai Thị Phương Anh, 1999) Theo Than và ctv (2008) đã miêu tảtriệu chứng điển hình trên qua là các tốn thương hình tròn, lõm, với vòng tròn đồng tâmtrên bề mặt quả ớt và xuất hiện tản nam hồng với nhiều bao tử vô tính Dưới áp lực bệnhnặng, vết bệnh liên kết lại gây thối quả

1.1.7 Nghiên cứu về nam Colletotrichum gloeosporioides

Nam Colletotrichum gloeosporioides có mặt ở hầu hết các nước trên thé giới, đặc

biệt phd biến ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới Tên Colletotrichumgloeosporioides được đề xuất dựa trên tên loài nam Vermicularia gloeosporioides đượcphân lập trên cây họ cam quýt ở Y (Weir va ctv, 2012) Dé xác định được sự phân bố

của loài nam này chi có thê dựa vào cây ký chủ của chúng.

Nam C gloeosporioides có bao tử đơn bào trong suốt, một đầu tròn một đầu nhọnhoặc hai đầu tròn, 9 - 24 x 3 - 4,5 um (Harp và ctv, 2008) Ngoài ra, trên môi trườngPDA nhân tạo, kích thước và hình dạng của bào tử có thể thay đổi so với trên cây kýchủ Khối bảo tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn độcsinh ra từ sợi nam trong đĩa cành nhẫn hoặc không dễ nhìn thấy lông gai Giác bám màu

nâu, hình chùy đến dạng không đều, không có hình dạng xác định, kích thước 6 - 20 x

4 - 12 wm Theo Sutton (1995) việc tồn tại nhiều hình dang và kích thước của giác bám

và bào tử trên nhiều loại cây ký chủ khác nhau cho thấy tồn tại nhiều loài khác nhau

trong phức hợp loài C gloeosporioides.

Nam có thé tồn tại ở nhiệt độ 4°C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nắm pháttriển là từ 25 — 29°C và âm độ gan 100%, trong điều kiện này nắm gay hại nghiêm trọng

nhất Anh hưởng của các yếu tô môi trường (nhiệt độ và 4m độ), nồng độ chủng và mức

độ bệnh than thư do C gloeosporioides gây ra được quyết định bởi trái có vết bệnh vàtrái không có vết bệnh Theo Jeffries (1990) cho rằng bệnh vẫn có thé xuất hiện trong

điều kiện khô khi bao tử hoặc sợi nắm tiềm sinh xâm nhiễm vào mô bị ton thương và

mô già, điều này cho thấy bệnh vẫn có thể gây thành dịch trên quả Sự nảy mầm củanam C gloeosporioides liên quan chặt chẽ đến điều kiện môi trường Âm độ không khí

cao thuận lợi cho bao tử nảy mâm và xâm nhiễm vào ký chủ.

Một chủng C gloeosporioides gây triệu chứng loét điển hình chỉ có trên quả ớtxanh Khi quan sát dưới kính hién vi tác giả cho thay sự xâm nhiễm của nam này vàotrong thành tế bào thông qua lớp biểu bì chỉ xảy ra trên quả ớt xanh mà không xảy ra

trên quả ớt chín (Oh và ctv, 1998).

1.1.8 Nghiên cứu về nam Colletotrichum acutatum

Colletotrichum acutatum được xác định bởi Simmonds (1965) Đến nay, số

lượng nam C acutatum ngày càng tăng Điều này dựa trên việc xác định các loài mớihoặc dựa trên sự phân loại lại các loài khác, chủ yếu từ C gloeosporioides, cho thấy su

tương đồng về hình thái cao và phổ của kí chủ Su đa dang giữa các chủng C acutatum

đã được công nhận từ lâu (biến thiên lên tới 4% trong trình tự rDNA — ITS), nhưng sosánh với các phân loại lân cận rõ ràng cho thấy đây là một nhóm đơn loài (Damm và

ctv, 2012).

Tại Mỹ, C acutatum được coi là loài Colletotrichum có sức tàn phá mạnh nhất

vì nó ảnh hưởng đến quả chin và quả chưa chin, trong khi đó C gloeosporioides chỉ gâybệnh chủ yếu trên quả ớt chín (Harp và ctv, 2008) Theo Sutton (1995), phức hợp loài

C acutatum có bao tử trong suốt, hai đầu nhọn, đơn bào, kích thước 8,5 — 16,5 x 2,5 —

4 um Giác bám màu nâu, dạng hình trứng ngược đến hình chuỳ, thường nhẫn ở cạnh

và có kích thước 8,5 — 10 x 4,5 — 6 um Tản nam loài C acutatum có màu da cam hoặc

màu xám nâu và đặc trưng là bào tử hình thoi Hình dang của giác bám có thé phân biệt

loài C acutatum (với giác bam it phân thuy) với C gloeosporioides (với giác bám thuỳ

nhiều hơn) Hình dạng và kích thước giác bám là đặc trưng để định các loài

Colletotrichum spp với nhau.

1.1.9 Nghiên cứu về nam Colletotrichum truncatun

Nam Colletotrichum truncatum, trước kia được gọi là Colletotrichum capsici, là

một trong các loài Colletotrichum có ý nghĩa kinh tế với phô ký chủ va tinh gây bệnhrat đa dạng (Ranathunge và ctv, 2012) Colletotrichum truncatum ban đầu được mô tả

là Vermicularia truncatum Sydow ở An Độ Colletotrichum truncatum có phạm vi ký

chu rộng Colletotrichum truncatum cũng là nguyên nhân gây ra bệnh than thư trên cây

tiêu (Than và ctv, 2008).Chủng nam này cũng là loài phô biến trên ớt tại An Độ (Sharma

và Shenoy, 2013), ở Thái Lan (Suwannarat và ctv, 2017), ở Uc (Da Silva va ctv, 2017)

và là loài phô biến nhất trên ớt tại Trung Quốc (Diao va ctv, 2017)

Theo Đoàn Thị Lan Anh và ctv (2019) bào tử phân sinh hình lưỡi liềm hai đầu tù,

đơn bao, trong suốt Đĩa cành có lông gai đa bào màu rat đậm Bao tử không mau, hình

lưỡi liềm, nảy mam sau 12 giờ Kích thước trung bình 25,51 - 38,55 x 3,65 - 4,69 um.Sợi nắm mảnh, màu trắng lúc đầu mọc bung cao về sau sát mặt thạch Tản nam màutrang, hoi xu, về sau chuyén sang mau vang nau Trén bề mặt tan nam xuất hiện nhiềubúi nắm đen mọc thành những đường tròn đồng tâm, mép hơi gợn sóng Trên bề mặt tảnnắm xuất hiện giọt dầu màu cam chứa ô bào tử bên trong và có gai Mặt sau của tản nắm

có màu vàng nâu đến nâu Đường kính tản nấm sau 6 ngày nuôi cấy là 90 mm Giác bám

có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phân

thùy, lúc đầu không màu chuyên dần sang nâu đến đen; kích thước trung bình 9,34 —

23,96 x 6,25 — 9,34 um.

1.2 Bệnh thán thư trên ớt

1.2.1 Nghiên cứu về các loài nam Colletotrichum spp gây bệnh than thư trên ớt

Bệnh thán thư, bắt nguồn từ một tiếng Hy Lạp có nghĩa là “coal”, là tên gọi chung

của các bệnh thực vật được đặc trưng bởi các ton thuong mau tối, trũng, chứa các bào

tử (Issac, 1992) Bệnh than thư do loài Colletotrichum gây ra thuộc giới Nam, ngành

Ascomycota, lớp Deuteromycetes, bộ Melanconiales, họ Melanconiaceae Bệnh than

thư trên 6 đã được chứng minh là do nhiều hon một loài Colletotrichum bao gồm C

acutatum, C capsici, C gloeosporiodes và C coccodes (Than va ctv, 2008) Theo Kim

va ctv (1999) xác định các loài gây bệnh than thư trên ớt ở Hàn Quốc là C.gloeosporioide, C acutatum, C coccodes, C dematium Tại Việt Nam đã có ít nhất 7

loài là C acutatum, C capsici, C gloeosporioides, C nigrum, C fructicola, C.

siamense, C aeschnomenes được ghi nhận gây bệnh than thư ở các vùng trồng ớt trên

toàn quốc (Lê Đình Đôn và ctv, 2012; Nguyễn Duy Hưng, 2017)

Bệnh than thư gây ra bởi một số loài nam Colletotrichum spp dẫn đến mat năngsuất nghiêm trọng và ảnh hưởng đến chất lượng cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới Thiệt hại do nắm này gây ra là rất nghiêm trọng ở nhiều nước ở Châu Á, bao gồm

Hàn Quốc, Thái Lan và Đài Loan, trong đó C acutatum và C gloeosporioides là gâyhại nghiêm trọng nhất và phân bố rộng rãi nhất của mầm bệnh thán thư Năng suất ớt

giảm 50 — 80% khi ớt bị nhiễm bệnh thán thư (Poonpolgul và ctv, 2007) Bệnh thán thư

gây hại chủ yếu trên quả ớt chín, gây thiệt hại nghiêm trọng cho quả ớt cả trước và sau

thu hoạch.

1.2.2 Triệu chứng của bệnh than thư trên ớt

Triệu chứng và dấu hiệu của bệnh thán thư có thể thay đổi theo bộ phận cây bị tấncông và điều kiện ngoại cảnh nhưng nhìn chung đều là các vết đốm hoại tử, trên vết đốm

có các 6 bao tử (đĩa cành nắm) màu gạch non hoặc đen (Hà Viết Cường, 2008)

Bệnh thán thư có thê hại thân, lá, quả và hạt, nhưng hại chủ yếu trên quả vào giaiđoạn chín (Vũ Triệu Man, 2007) Vết bệnh ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên

bề mặt vỏ qua, sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thé lên tới 1 cm đường kính Vết

bệnh thường có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường mau đen chạy

dọc theo vết bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những cham nhỏ là đĩa cành của nam gây

bệnh Các vết bệnh có thê liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng.Nam có thé gây hai trên một số chéi non, gây hiện tượng thối ngọn ot Chồi bị hại cómàu nâu đen, bệnh có thé phát triển nặng làm cây bị chết dan hoặc cây bệnh có quả ởtừng phần nhưng quả ít, chất lượng kém Trên quả ớt triệu chứng bệnh được ghi nhận 3loại điển hình (Liu Fangling và ctv, 2016):

Loại 1: Các triệu chứng có màu sắc từ màu nâu sam đến đen, vết thương trũng

có vành hơi nhô lên và nhiều đốm màu đen trên bề mặt, thường tạo ra các khối bào tửtrang trong điều kiện 4m ướt, bào tử điển hình có hình lưỡi liềm (hình 1.3 a-c)

Loại 2: Các triệu chứng gồm các mô hoại tử lõm xuống, có nhiều màu từ nâu sam

đến đen, với các vòng tròn đồng tâm có nhiều đĩa cành đen trên bề mặt, tạo ra các khốimàu hồng, nhớt trong điều kiện 4m ướt, bào tử hình trụ đến hình trụ dài (hình 1.3 d-f)

Loại 3: gôm các mô màu nâu nhạt đên nâu sâm, các khôi bào tử màu cam, bào tử

có hình thoi (hình 1.3 g-i).

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh than thư trên quả ớt do nắm Colletotrichum spp

(Liu Fangling va ctv, 2016)

1.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử

1.3.1 Khái niệm đa dạng di truyền

Đa đạng di truyền là sự khác biệt về đặc điểm di truyền của các cá thể trong cùngmột loài hay các quan thé trong loài cũng như giữa các cá thé trong một quan thể Trong

một loài, các giống khác nhau có trình tự đoạn gen khác nhau Trong cùng một giống,

các cá thê cũng có thể mang những trình tự gen khác nhau, do sự xuất hiện của một loại

đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt di truyền, có thể quy định

thành một tinh trạng khác với những cá thé cùng giống Sự khác biệt di truyền được ghinhận thông qua sự khác biệt trong trình tự DNA, trong đặc tính sinh học (cau trúcprotein, đặc trưng của enzyme), đặc điểm sinh lý (kháng lại các yếu tố bat lợi môi trườnghay mức độ sinh trưởng) và đặc điểm hình thái (màu hoa, dạng cây) giữa các cá thể(Nguyễn Đức Thành, 2015)

1.3.2 Các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Việc xác định và mô tả đặc điểm của các loài Colletotrichum dựa trên các đặc điểmhình thái học như kích thước và hình dạng của bào tử và giác bám, sự ton tại của lông

cứng hoặc sự hiện diện của giai đoạn hình thức hữu tính, và các đặc điểm văn hóa như

màu sắc khuẩn lạc, tốc độ tăng trưởng và kết cấu (Smith và Black, 1990 ) Chỉ nhữngtiêu chí này không phải lúc nào cũng đủ dé phân biệt các loài vì sự khác nhau về hình

thái và kiều hình giữa các loài trong các điều kiện môi trường khác nhau Dé khắc phục

các vấn đề phân loại liên quan đến các phương pháp nhận dạng truyền thống này, cácphân tích trình tự DNA đã được sử dụng dé mô ta đặc điểm và giải quyết sự phức tap

về phân loại của một số chi nam Colletotrichum (Photita ctv, 2005) Cannon va ctv(2012) tuyên bố rang dit liệu thu được từ các phân tích axit nucleic sẽ cung cấp khuônkhổ đáng tin cậy nhất dé xây dựng phân loại Colletotrichum vì các đặc tính DNA không

bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các yếu tố môi trường Ứng dụng kết hợp các công cụ chânđoán phân tử, cùng với các phương pháp truyền thống, bao gồm đặc tính hình thái học

và thử nghiệm khả năng gây bệnh, là một cách tiếp cận phù hợp và đáng tin cậy để

nghiên cứu các quan thê loài Colletotrichum (Cannon và ctv, 2000)

Chỉ thị DNA là những thay đổi trong phân tử DNA, nằm gần hay liên kết với gen

và không có hoặc ít ảnh hưởng tới kiểu hình Chỉ thị DNA là một đoạn DNA được sửdụng đề đánh dấu hay truy theo một vi trí (locus) trên nhiễm sắc thể Những chi thị DNA

mang day đủ các đặc tính của một chỉ thị di truyền điển hình Khác với chỉ thị hình thái

và chỉ thị sinh hoá, chỉ thị DNA không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi cácyếu tố môi trường Chỉ thị DNA được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau vềphương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình (Bảng 1.1) (Nguyễn Đức Thành, 2015)

Các chỉ thị phân tử ngày nay càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong phân tích

da dang di truyền.

Bảng 1.1 Các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

(Nguyễn Đức Thành, 2015).

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt

Các chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA

RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn

Polymorphism chếREF Restrition Endonuclease Lay dau cat han ché

Fingering

Cac chỉ thị dựa trên phan ứng PCR

AFLP Amplified Fragment Length Da dạng độ dai khéch đại

Polymorphism chon loc

RAPD Randomly Amplified DNA đa hình được khuếch

Polymorphism DNA đại ngẫu nhiên

AP-PCR Arbitrarily primed PCR PCR với primer ngẫu nhiên

Các chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tỉnhISSR Inter — Simple Sequence Repeats Chuỗi lặp lại đơn giản giữa

ISTR Inverse Sequence Tagged Chuỗi lặp lại ngược được

Repeats đánh dấu

Các chỉ thị PCR các chuỗi đặc trưngSTS Sequence — Tagged — Site Vị trí chuỗi đánh dau

SCAR Sequence Characterised Vùng nhân bản các trình tự

Anplfication Regions được mô tả

SSR Simple Sequence Repeats Các chuỗi lặp lại don giản

Các chỉ thị gen nhảy

REMAP Retrotrasposon — Microsatellite Da hinh tiéu vé tinh gen

Amplified Polymorphism nhảy được khuéch đại

IRAP Inter — Retrotrasposon Amplified Da hình gen nhảy giữa được

Polymorphism khuéch dai

Cac chi thi nhan khac ITS Interal Transcribed Spacer Vùng sao mã giữa

SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn

DarT Diversity array Technology Céng nghé sap xép da dang

Chỉ thi DNA có hiệu quả cao hon so với các chỉ thi sinh hoa truyền thống do nghiên

cứu trực tiép vật liệu di truyền và có thê tìm ra môi quan hệ giữa các loài (William và

ctv, 1990) Việc sử dụng các chỉ thi sinh hoá có nhiều hạn chế vì phải sử dụng số lượng

mau lớn (Babik và Rafinski, 2000) So với chi thị hình thái, chỉ thị DNA tiết kiệm hon

về thời gian và công sức (Cooke, 1984)

1.3.3 Kỹ thuật ISSR ( Inter — simple Sequence Repeats)

Nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật chỉ thị phân tử ISSR được xuất bản năm 1994.ISSR là một trong các loại chỉ thị microsatellite sử dụng nguyên tắc cơ bản của RAPDvới môi hình thành từ phần của chuỗi microsatellite và phan base ngẫu nhiên có độ dàikhoảng 16 — 25 bp (Reddy va ctv, 2002) Các mỗi sử dụng có thé là non — anchored hay

còn gọi là MP — PCR (microsatellite primed PCR) (Gupta va ctv, 1994), hoặc là anchored ở vi trí 5’ hoặc 3’ với 1 - 4 base (Zietkiewicz va ctv, 1994) Trinh tự primer

được sử dung trong phan ứng PCR — ISSR được thiét ké dua trén những đoạn trình tựnucleotide lặp lại đơn giản gồm 2 nucleotide như (CA), (AT)n, (AG)n hay những trình

tự gồm 3 nucleotide được lặp lại nhiều lần như (AGC), (TA TT)n

Về nguyên tac, PCR sẽ khuếch dai những đoạn sườn (nằm kế cận) các motif

microsatellite Trong những điều kiện khuếch đại phù hợp, kỹ thuật ISSR cho phép sản

sinh vài chục sản phẩm có chiều dài trong khoảng 200 — 2000 bp, do đó chúng có thé

được điện di trên gel agarose hay gel acrylamide (Reddy va ctv, 2002) Sự đa dạng được

phát hiện chủ yếu thuộc dạng xuất hiện hoặc không xuất hiện như đối với RAPD nhưng

đôi khi tương ứng với sự khác nhau trong độ dai các đoạn như đối với microsatellite

Các bước thực hiện kỹ thuật ISSR:

- Tach DNA hệ gen.

- Chay PCR với DNA hệ gen với mồi đơn là các microsatellite

- Phân tách các đoạn DNA được khuếch đại trên gel agarose

- Nhuộm gel và chụp anh.

- Phân tích số lượng

- Đánh giá đa dang di truyền

So với các chỉ thị khác, chỉ thị ISSR có các ưu điểm và nhược điểm xét về mức độ

đa hình, chi phí thực hiện và ban chất của các chỉ thị (Bảng 1.1)

Bảng 1.2 Ưu điểm và nhược điểm của các chỉ thị phân tử (Vijayen, 2005)

Tên chỉ Sử dụng Mức độ đa Chỉ phí Chi phí

Bản chấtthị PCR hình đầu tư thực hiệnRFLP Khong Trung binh Déngtrdi Cao Cao

RAPD Có Cao Trội Thấp Thấp

SSR Có Cao Đồngtrội Cao Trung bìnhISSR Có Cao Trội Thấp Thấp

AFLP Có Cao Trội Trung bình Trung bình

lsozyme Không Thấp Đồng trội Cao Trung bình

SIS Có Cao Trội Cao Trung bình

Trong hầu hết trường hợp, ISSR là chỉ thị mang tính trội (Tsumura và ctv, 1996).Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nó là chỉ thị đồng trội có thé phân biệt được cá thể

đồng hợp tử và di hợp tử (Sankar va Moore, 2000) Những chi thị ISSR được phát hiện

rat đa hình ISSR có ưu điểm hơn RADP do sử dụng môi có kích thước dai hơn nên các

điều kiện trong giai đoạn bắt cặp của các môi có sự nghiêm ngặt cao, hạn chế được hiệntượng nhằm lẫn bắt cặp giữa các primer dẫn đến khả năng lặp lại (reproductible) cao

hơn RAPD (Zietkiewicz và ctv, 1994) Nghiên cứu khả năng lặp lại của ISSR cho thay

92 — 95% các băng DNA được khuếch đại từ cùng mẫu DNA của cùng một giống.

Những băng mờ nhạt, không rõ mới không có khả năng lặp lại Hơn nữa, kỹ thuật này

thực hiện đơn giản, ít tốn thời gian và chi phí không cao so với các chỉ thị phân tử khác

(Reddy và ctv, 2002) Theo Bornet và Branch (2001) khi nghiên cứu sử dụng ISSR trên bông cải và cây dâu tây thì chỉ thị ISSR có khả năng lặp lại cao và đáng tin cậy Hiện

nay, kỹ thuật ISSR được sử dụng rộng rãi trên trong nghiên cứu nhận diện di truyền, đa

dạng di truyền, lập bản đồ genome, xác định gen trong chọn giống cây trồng và nghiên

cứu hoá sinh học (Reddy và ctv, 2002).

1.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền

Da dang di truyền giữa các cá thé trong một quan thé được đánh giá dựa vào mức

độ đa dạng gen Đa dạng gen là số băng đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình được thực hiện

bằng việc khuếch đại các trình tự DNA với các primer hoặc các cặp primer bằng các kỹ

thuật chỉ thị DNA tương ứng Số băng DNA đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình có thể dao

động từ 0 — 100% và giá trị càng lớn thì mức độ đa dạng càng cao Tỷ lệ băng đa hình

được tinh bằng tổng số băng đa hình trong quan thé nghiên cứu chia cho tông số các

băng ghi được (Nguyễn Đức Thành, 2015)

Phân tích sự đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử DNA bao gồm phân

tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thu thập và các chỉ số đa dạng di truyền ở mức

độ cá thé hay quan thé Quan hệ di truyền giữa các cá thé trong quan thé được đánh giádựa vào hệ số tương đồng di truyền (genetic similarity cofficient) hoặc hệ số khôngtương đồng di truyền (genetic dissimilarity cofficient) Các hệ số thường dùng là hệ sốDice (còn gọi là hệ số Nei và Li); hệ số Jaccard; hệ số phù hợp đơn giản (SM) (Kosman

và Leonnard, 2005).

Mối quan hệ di truyền được thé hiện bằng việc phân nhóm dựa trên các thuộctính hay mối quan hệ chung của cá thể thông qua việc sử dụng các hệ số tương đồng

Hệ số tương đồng được tính toán dựa vào các số liệu về chỉ thị DNA dé phân nhóm theo

biéu đồ hình cây hoặc biéu đồ kiểu hình Các phương pháp phố biến dé xây dựng biểu

đồ hình cây cho ma trận khoảng cách là phương pháp nhóm cặp không điều chỉnh sử

dụng các giá trị trung bình số học (UPGMA) (Sneath và Sokal, 1973); phương pháp lâncận (NJ) (Saitou va Nei, 1987) Phần mềm NTSYSpc (Rohlf, 2000) được sử dụng thông

dụng nhất trong phân tích phân nhóm dựa trên số liệu chỉ thị phân tử DNA (Nguyễn

Trong một nghiên cứu về chủng nam C falcatum của tác giả Prittesh Patel (2018), sự đadang di truyền dựa trên PCR 6 các mẫu C falcatum bang cách sử dụng chị thị phân tử ISSR.Tổng cộng có 39 ISSR đã được sang lọc trên 10 lần bổ sung C falcatum, trong đó 21 ISSR đãcho thấy sự khuếch đại nhất quán Thống kê liên quan đến biến thể di truyền được ước tính xử

ly bằng phần mềm NTSYSpe với hệ số Dice Kết qua cho thấy 68,07% tinh đa hình và hệ sốtương tự nằm trong khoảng từ 0,73 đến 0,93 trong phân tích ISSR Chương trình dendro đượctạo bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử ISSR và các phần bé sung được nhóm RAPD - ISSR kếthợp thành các cụm khác nhau cho thay sự thay đồi phân tử ở mức độ đáng kê giữa các phần bổsung C falcatum Cũng có thé thay rõ từ các sơ đồ PCR rằng các phần bé sung khá phân tánvới các hệ thống đánh dau được thử nghiệm cho thấy cơ sở di truyền tốt

Trong nghiên cứu về chủng nam C fruncatum ở Malaysia, tác giả Farshid Mahmodi(2013), kết luận rằng chỉ thị phân tử ISSR được sử dung dé ước tính sự đa dang di truyền ở C.truncatum Một bộ 3 đoạn mồi ISSR đã tiết lộ tổng cộng 26 alen từ các san phâm được khuếch

dai Phân tích cụm bằng phương pháp UPGMA phân lập cụm C @runcatum thành hai nhóm

chính, khác nhau với khoảng cách 0,64 Tuy nhiên, sự đa dang di truyền của các dong phân lập

C truncatum cho thấy mỗi tương quan giữa phân bồ di truyền và địa lý, nhưng nó không pháthiện ra mối quan hệ giữa sự phân cụm và tính biến đôi gây bệnh Các phân tích phát sinh loài

đã phân biệt các chủng phân lập C truncatum với các loài Colletotrichum tham chiếu khác có

nguồn gốc từ Ngân hang gen Trong số các đặc điểm hình thái, hình dang, mau sắc của khuẩnlạc và tốc độ tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy có tương quan một phần với ISSR và

nhóm phát sinh loài.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu đề tài

Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nam Colletotrichum spp gây bệnh than

thư hại ớt chỉ thiên Hai mỗi tên đỏ.

Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái của các chủng nam Colletotrichum spp

gay bénh than thu hai ot.

Đánh giá su đa dạng về đặc điểm di truyền của các chủng nam Colletotrichum spp.gay bệnh than thư hại ớt bằng chi thị phân tử ISSR

2.2 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 2 năm 2023 đến tháng 8 năm 2023,tại phòng thí nghiệm Bệnh cây khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh

2.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

32 mau nam Colletotrichum spp và ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

Các trang thiết bị gồm: cân điện tử, bếp điện, dia petri, tủ cấy vi sinh, kính hiển vi,máy hấp khử trùng, lò vi sóng, máy lắc Vortex, máy ly tâm, máy PCR, hệ thống chụpgel UV, tủ âm -20°C, máy điện di, eppendorf 1,5 ml, eppendorf 0,2 ml, đầu tuýp,

micropippet, lam kính, lame.

Ly trích DNA: Sử dụng bộ kit ly trích DNA của công ty TNHH ABT.

Thành phần PCR: Mytaq Mix 2X, nước cất, DNA, primer ISSR

Ky thuật điện di: Agarose 1,5%, TAE 1X, 6X Gelred DNA Loading buffer tricolor, Ladder 1Kb.

Môi trường sử dung: môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Atlas, 2004) với

thành phần gồm: khoai tây (200g), agar (20g), đường D-glucose (20g), nước cất(1000ml) Hap khử trùng ở 121°C, latm trong 25 phút

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Đánh giá đặc điểm hình thái nắm Colletotrichum spp

Từ những mẫu nam Colletotrichum spp lưu giữ tại phòng thí nghiệm Bệnh cây khoaNông học, tiến hành phân nhóm dựa trên những đặc điểm hình thái, sau đó chọn ranhững mẫu đặc trưng trong từng nhóm dé tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái Cácđặc điểm hình thái quan trong trong phân loại nam Colletotrichum spp gồm hình dạng

và kích thước bào tử phân sinh.

Cay một khoanh hệ sợi nắm Colletotrichum (lay từ mép tan nắm) đường kính 5 mmvào dia petri đã có san môi trường PDA, đặt đĩa ở nhiệt độ 28°C ủ trong 7 ngày Quansát những đặc điểm hình thái bao tử của nắm Colletotrichum: màu sac, hình thái, kíchthước bao tử: đo chiều dai, chiều rộng của 30 bảo tử Đặc điểm của giác bám: Một mảnhmôi trường PDA (1 cm?) được đặt trên dia Petri vô trùng Bào tử nắm được cấy vào cạnhcủa miếng môi trường và một lamen vô trùng được đặt lên trên mảnh môi trường Đĩa

được ủ 7 ngày ở 25°C cho tới khi đĩa áp hình thành ở mặt dưới của lamen (Cai va ctv,

2009) Đặc điểm của đĩa áp gồm hình dang và kích thước được đánh giá theo mô tả công

bố của tác giả Cai và ctv, 2009 Ghi nhận hình dạng và kích thước của giác bám Quan

sát dưới kính hiển vi Olympus BX40 dé đo kích thước 30 bảo tử và 30 giác bám và đặc

tính sinh học cả từng chủng nam dựa theo khoá phân loại nam (Sutton và ctv, 1995) Dữ

liệu được xử lí và tinh toán bang phần mềm Microsoft Excel 2019.

2.4.2 Đánh giá khả năng lây bệnh của các dòng nam Colletotrichum spp

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

Quả ớt đề tiến hành thí nghiệm là ớt chỉ thiên Hai mũi tên đỏ không có triệuchứng bị bệnh, không bị côn trùng chích hút và vết thương cơ giới, đồng đều với nhau

về kích thước, hình dạng, màu sắc được xử lý bằng cồn 70 và rửa bằng nước sạch, đểkhô tự nhiên trước nhỏ dung dich bao tử nắm.

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ với 33 nghiệmthức trong đó bao gồm 1 nghiệm thức đối chứng, 6 quả 6t/nghiém thức, một nghiệmthức thực hiện 3 lần lặp lại Nuôi cấy chủng nam Colletotrichum spp ở nhiệt độ phòng.Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, 10 mL nước cất thanh trùng được cho vàotừng dia petri, dùng lam kính sạch cạo nhẹ phần sợi nam, lọc qua vải lọc đã thanh trùng,thu được huyền phù bảo tử nắm Mật số bào tử nam được đếm trên buồng đếm bào tử

và điều chỉnh đến mật số 108 bào tử/mL (Montri và ctv, 2009) Tiến hành nhỏ trực tiếpdịch 20 L huyền phù bao tử nam lên bông gòn và đặt trên bề mặt quả ớt ở điều kiện

gây vết thương (1 vết thương trên 1 qua) và không gây vết thương Quả ớt đối chứng

được xử lý băng nước cât vô trùng.

Các hộp nhựa dùng dé đựng được lau sạch bằng cồn 70, đưới đáy hộp có đặt lớpgiấy giữ 4m đề duy trì độ âm tạo điều kiện tối ưu cho nam gây bệnh và được ủ tối trong

24 giờ trong điều kiện nhiệt độ phòng Sau 24 giờ gỡ bông gòn ra và dé hộp nhựa bìnhthường ở điều kiện nhiệt độ phòng Quan sát biểu hiện triệu chứng sau khi lây bệnh.Thời gian xuất hiện triệu chứng được tính từ khi lây nhiễm đến khi có triệu chứng xuất

hiện trên quả Tính tỷ lệ bệnh sau 6 ngày gây bệnh.

Chỉ tiêu theo doi

Quả ớt được theo dõi và lấy số liệu theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT vào thờiđiểm 6 ngày sau cho dịch bào tử lên quả

— Tỉ lệ bệnh (%) = (Số quả bị bệnh/Tổng số quả thí nghiém)*100

— Chi số bệnh (%) = (( 9n9 + 7n7 + 5n5 + 3n3 + n1)/9N)*100

Trong đó:

nl: số quả bị bệnh ở cấp 1 với < 5 % diện tích quả bị bệnh

n3: số quả bị bệnh ở cấp 3 với > 5 — 15 % diện tích quả bị bệnh

nd: số quả bị bệnh ở cấp 5 với >15 — 25 % diện tích qua bị bệnh

n7: số quả bị bệnh ở cấp 7 với >25 — 50 % diện tích quả bị bệnh

n9: số quả bị bệnh ở cấp 9 với > 50 % điện tích quả bị bệnh

N: tổng số quả điều tra (thí nghiệm)

2.4.3 Phân tích đa dạng di truyền nam Colletotrichum spp

Các bước tiên hành thí nghiệm được thực hiện tuần tự theo 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Tach chiết DNA từ 32 chủng nam Colletotrichum spp thu thập được

(danh sách các mẫu nam Colletotrichum spp đã được phân lập và định danh trong Bang2.1) Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị sinh học phân tử ISSR dé phântích đa dang di truyền của 32 chủng nam Colletotrichum spp

Giai đoạn 3: Phân tích đa dạng di truyền bằng phân nhóm dựa trên hệ số tương

quan Dice, kiểu phân nhóm UPGMA trên phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2000)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu nam Colletotrichum spp sử dung trong thí nghiệm

STT Mau Loai Colletotrichum | STT Mau Loai Colletotrichum

nam nam

1 LDO1 C scovillei 17 LD17 C scovillei

2 LD02 C scovillei 18 TN0I C scovillei

8 LD08 C scovillei 24 TNI0 C scovillei

9 LD09 C scovillei 25 TNII C scovillei

10 LDI0 C scovillei 26 TN13 C scovillei

lãi LDII C scovillei 27 BR02 C scovillei

12 LDI2 C scovillei 28 BR04 C scovillei

13 LDI3 C scovillei 29 BROS C scovillei

14 LDI4 C scovillei 30 BRO1 C gloeosporioides

15 LDIS C scovillei 31 BR03 C gloeosporioides

16 LDI16 C scovillei 32 BR06 C gloeosporioides

Tất cả 32 mẫu nắm trên được phân lập từ quả ớt chỉ thiên có triệu chứng bệnh thán thư tại

3 tinh Lâm Đông, Tây Ninh va Ba Ria — Vũng Tau.

2.4.3.1 Ly trích DNA từ mẫu nắm

Dé có thé ly trích DNA của các chủng nam Colletotrichum spp phải tiến hànhnuôi cay nam trên môi trường PDA dé phát triển và tạo bào tử Sau khoảng 10 ngày,

nam đã phát triển, tiến hành sử dụng bộ kit ly trích DNA của Công ty TNHH Giải pháp

Y sinh ABT theo quy trình có sẵn của nhà sản xuất như sau:

Quy trình thực hiện:

1 Mẫu mô được cắt nhỏ và cho vào tube 1,5 mL cùng với 200 wL TL buffer và 20

uL Proteinase K, nghiền mẫu bằng chày cho đến khi nát mẫu, vortex đều và ủ 6 72°Ccho đến khi mẫu ly giải hoàn toàn Chú ý vortex thường xuyên trong quá trình ủ

2 Thêm 200 L CL buffer, vortex đều và ủ 72°C trong 10 phút

3 Thêm 200 pL Ethanol (96 - 100%), trộn đều và chuyền hỗn hợp sang cột silica đặtsẵn trong tube 2 mL Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút Giữ lại cột và loại bỏ chất lỏng bên

6 Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ, làm khô bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút

7 Chuyển cột sang tube 1,5 mL mới, thêm 50 pL EB buffer và ủ một phút ở nhiệt

độ phòng ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút thu phan dich chưa DNA bên dưới

8 DNA thu được sử dụng ngay hoặc bao quan ở -20°C.

Sau khi ly trích, DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch (A260/280) bangmay Nano-Drop (ND2000 Spectrophotometer, Thermo Scientific, U.S.A), nham dambảo chất lượng DNA và điều chỉnh cho phù hợp với từng phản ứng PCR DNA nay được

sử dụng làm nguồn chung cho các phản ứng PCR trong quá trình nghiên cứu

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ISSR

Chukì Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian

1 Tién bién tinh 95 5 phút

Bién tinh 95 30 giây

35 Bắt cặp 50 — 54” 1 phút

Kéo dải 72 1 phút

1 Hậu kéo dài 12 10 phút

* Nhiệt độ bắt cặp tuỳ thuộc vào primer (môi) trong bảng 2.4.

Bảng 2.4 Danh sách các primer được sử dụng trong phan ứng PCR — ISSR

Primer Trình tự Nhiệt độ nóng Tài liệu tham khảo

(5’ — 3’) chay (°C)AF80820 (AG)sT 52 Ratanacherdchai va ctv, 2010 AF80821 (AG)sC 34,4 Ratanacherdchai va ctv, 2010 AF80822 (GA)sT 52 Ratanacherdchai va ctv, 2010 AF80823 (TG)sA 52 Ratanacherdchai va ctv, 2010

AF80825 (GT)sYC 55,8 Ratanacherdchai va ctv, 2010UBC808 (AG)sC 54,4 Mahmodi va ctv, 2014

UBC810 (GA)s(CT)C 52 Mahmodi va ctv, 2014

UBC834 (AG)sTT 53,6 Mahmodi va ctv, 2014

*Y=C, T

2.4.3.3 Điện di đọc kết qua PCR trên gel agarose 1,5%

San phẩm PCR sau phan ứng được điện di trên gel agarose 1,5%, dung dịch đệmTAE 1X, hiệu điện thế 90V, cường độ dòng điện 400 mA, trong 30 - 40 phút

Phương pháp đỗ gel agarose và điện di

Bước 1: Chuan bị gel agarose 1,5% (cho 1,5 g agarose vào 100 ml dung dịch

TAE 1X, đun sôi hén hợp trên khoảng 2 phút trong máy microwave).

Bước 2: Dé nguội dung dich agarose đã được nấu chín đến khoảng 50 - 60°C,

tiến hành đổ dung dịch vào khuôn gel có gắn sẵn lược dé tạo giếng Đợi đến khi gel

đông hoàn toàn (hơn 40 phút).

Bước 3: Lay lược ra, đặt gel đã chuẩn bị vào bổn điện di, ngập trong dung dich

Bước 7: Đọc kết quả dưới tia UV

Bước 8: Chụp bản gel dé lưu lại kết quả

2.4.3.4 Đánh giá đa dạng về đặc điểm hình thái và di truyền

Kích thước của các đoạn DNA khuếch đại được đo bằng cách sử dụng UVIDod(phiên bản 99.02) bằng cách so sánh với điểm đánh dau 1 kb bậc thang DNA Các đoạn

DNA được khuếch đại 6n định được cho điểm là 1 khi có mặt và 0 nếu không có dai

DNA Điểm số được sử dụng dé tạo ma trận dữ liệu nhằm phân tích mối quan hệ di

truyền bằng việc phân nhóm dựa trên các thuộc tính hay mối quan hệ chung của cá thé

thông qua việc sử dụng hệ số tương đồng Hệ số tương đồng được tính toán dựa trên các

số liệu về chỉ thi DNA dé phân nhóm hay biểu đồ hình cây hoặc biểu đồ kiểu hình nếu

hệ số tương đồng được tính toán dựa trên số liệu kiểu hình

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức hệ số Dice(hay còn gọi là hệ số Nei và Li); hệ số Jaccard (Bang 2.5) Sơ đồ hình cây được thiết lập

dựa trên phương pháp phân nhóm UPGMA theo tương đồng di truyền (Jaccards/Dice),

sử dung phần mềm NTSYSpe 2.1 (Rohlf, 2000)

Bảng 2.5 Các hệ số phân tích đa dạng di truyền ( Kosman và Leonnard, 2005)

Tên hệ số Công thức Giải thích

Hés6 Dice D¡=2aj/(2aj+bi+cj) a là số băng chung của 2 cá thể; b là số băng

của cá thé i; c là số băng của cá thé j

Hệ số Jaccard Jj= ay/(aj + bị + cj) a là số băng chung của 2 cá thé; b là số băng

của cá thê i; c là sô băng của cá thê j

2.4.4 Xử lý số liệu

Các số liệu được tổng hợp, tính toán bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2019

Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức hệ số Dice (hay

còn gọi là hệ số Nei va Li); hệ số Jaccard Sơ đồ hình cây được thiết lập dựa trên phươngpháp phân nhóm UPGMA theo tương đồng di truyền (Jaccards/ Dice), sử dung chương

trình phan mềm NTSYSpc 2.1

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đánh giá sự đa dạng về đặc điểm hình thái các mẫu nắm Colletotrichum spp

Tên chủng nam dùng trong thí nghiệm được kí hiệu như sau: hai chữ cái đầu tiên

là kí hiệu nơi thu mẫu (tinh), day số gồm 2 kí tự tiếp theo là thứ tự mẫu thu được

Vi dụ: chủng nắm LDO1, với:

LD: mẫu nắm thu được tại tỉnh Lâm Đồng

01: mau số 1 thu được

Quan sát đặc điểm hình thái của 32 đĩa Colletotrichum spp trên môi trường PDA

7 ngày sau cấy và dựa vào khóa phân loại Colletotrichum spp của Sutton năm 1995,

các mau nam được chia thành 3 nhóm chính như sau:

Nhóm I gồm 17 mẫu nắm Colletotrichum scovillei: LD01, LD02, LD03, LD04,

LD05, LD06, LD07, LD08, LD09, LD10, LD11, LD12, LD13, TN01, TN02, BR02 và

BROS Soi nắm mảnh, mau trang đến nâu nhạt, mọc sát mặt thạch, đơn bao, trong suốt vàphân nhánh, có vách ngăn, trong mỗi tế bào của sợi nắm có nhiều hạt dầu Tan nắm màutrắng đến trắng xám, mép tròn đều hoặc hơi tròn Mặt trên đĩa nam có những cham nhỏ

màu đen, kích thước không đồng đều, không có những đường tròn đồng tâm (hình 3.1 A)

Mặt dưới của đĩa nắm màu hồng cam hoặc hơi vàng, các chấm nhỏ màu đen và đậm dầngần tâm đĩa (hình 3.1 B) Bào tử đơn bào, không mau, tế bào có dang hình trụ, bên trong

có giọt dau hình tròn không màu Xuất hiện sau 3 NSC với mật độ thấp Kích thước trung

bình 9,13 — 14,33 x 2,17 — 5 pm (hình 3.1 C) Giác bám có dạng hình trứng ngược, hình

chùy, hơi tròn hay hình dạng không xác định, có phân thùy, lúc đầu không màu chuyêndần sang nâu đến đen Kích thước trung bình 7,33 — 13,33 x 2,77 — 5,33 um (hình 3.1 D)

4 7eo

{it sagas i ote

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu nam nhóm I, (A) mặt trước đĩa nam

Colletotrichum scovillei mọc trên môi trường PDA 7 NSC,

(B) mặt sau dia nam Colletotrichum scovillei moc trên môi trường PDA 7 NSC,

(C) hình dạng bao tử, (D) hình dang giác bam.

Nhóm II gồm 11 mẫu nắm Colletotrichum scovillei bao gồm TN03, TN04, TN05,

TN09, TN10, TN11, TN13, LD14, LD15, LD16 và LD17 Soi nắm mảnh, màu trang hơi

xám nhạt, mọc bung đều Tản nắm màu trắng xám đến xám đen, mép tròn đều Mặt trênđĩa nam có những vòng tròn đồng tâm (hình 3.2 A) Mặt sau đĩa nắm màu xám den vàđen, có những vòng tròn đồng tâm đều nhau, có những đốm đen nhỏ (hình 3.2 B) Bảo

tử trong suốt dạng hình trụ, hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu hơi nhọn Bảo tửxuất hiện 3 ngày sau cây với mật độ thấp Kích thước trung bình 7,75 — 14,08 um x 3,42

— 6,75 um (hình 3.2 C) Giác bám có dạng hình trứng ngược, hình chùy, hơi tròn hay

hình dạng không xác định, có phân thùy, lúc đầu không màu chuyên dần sang nâu đến

đen Kích thước trung bình 7,00 — 12,67 um x 4,08 — 7,75 um (hình 3.2 D).

ea :

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm nhóm IL, (A) mặt trước đĩa nắm

Colletotrichum scovillei mọc trên môi trường PDA 7 NSC,

(B) mặt sau dia nam Colletotrichum scovillei moc trên môi trường PDA 7 NSC,

(C) hình dang bao tử, (D) hình dang giác bam.

Nhóm III gồm 3 mẫu nam Colletotrichum gloeosporioides gồm BR01, BR03 va

BRO6 Soi nắm mảnh màu trắng xám đến đen, mọc bung cao va đều Tản nắm màu trắngxám đến xám đen, mép tròn đều Mặt trên đĩa nắm màu trắng, có những vòng tròn đồng

tâm (hình 3.3 A) Mặt sau màu nâu đen đến đen, có những vòng tròn đồng tâm màu đenđều nhau (hình 3.3 B) Bào tử trong suốt, đơn bảo, hình trụ ngắn hai đầu hơi tròn hoặc

một đầu tròn và một đầu hơi nhọn Xuất hiện sau 3 ngảy sau cây với mật độ thấp Kích

thước trung bình 5,5 — 14,38 x 3,63 — 6,63 um (hình 3.3 C) Giác bám có dạng hình

trứng ngược, hình chuỳ hay hình dạng không xác định, màu nâu nhạt đến nâu thẫm,vách mỏng, bên trong có nhiều chất nhân màu vàng phân bố bắt định Kích thước trung

bình 6,25 — 12,38 x 6 — 7,88 um (hình 3.3 D).

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm IIL, (A) mặt trước đĩa nắm

Colletotrichum gloeosporioides mọc trên môi trường PDA 7 NSC,

(B) mat sau dia nam Colletotrichum gloeosporioides mọc trên môi trường PDA 7

NSC, (C) hình dạng bào tử, (D) hình dạng giác bám.

Theo khoá phân loại của Sutton (1995) mô tả hình thái của loài namColletotrichum gloeosporioides có bao tử trụ thang, góc tù ở đỉnh hoặc hình trụ một đầuhẹp lại, một đầu cin, kích thước 9 — 24 x 3 — 4,5 ym; giác bám có dang hình chuỳ, hình

trứng ngược có nếp nhăn, dạng xẻ thuy, kích thước trung bình 6 — 20 x 4 -12 m.Tương

tự, De Silva va ctv năm 2017 cho rằng Colletotrichum scovillei là một trong những loàiphổ biến gây bệnh than thư trên ớt Colletotrichum scovillei có hình thái bào tử là hìnhtrụ thang với kích thước bào tử trung bình là 12 + 3,5 pm x 4,5 + 1,5 và kích thước trungbình giác bám là 8 + 2,5 um x 4+ 1,5 um Như vậy kết quả nghiên cứu về đặc điểm hìnhthái nắm Colletotrichum seovillei và Colletotrichum gloeosporioides trong nghiên cứunày là tương đối phù hợp

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi

(2022) rang Colletotrichum scovillei có hình thái bào tử là hình trụ thang, hai đầu tròn