TỎNG QUAN TÀI LIỆU
Loại 2: Các triệu chứng gồm các mô hoại tử lõm xuống, có nhiều màu từ nâu sam đến đen, với các vòng tròn đồng tâm có nhiều đĩa cành đen trên bề mặt, tạo ra các khối
Loại 3: gôm các mô màu nâu nhạt đên nâu sâm, các khôi bào tử màu cam, bào tử có hình thoi (hình 1.3 g-i).
Hình 1.3 Triệu chứng bệnh than thư trên quả ớt do nắm Colletotrichum spp.
(Liu Fangling va ctv, 2016)
1.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử 1.3.1 Khái niệm đa dạng di truyền
Đa đạng di truyền là sự khác biệt về đặc điểm di truyền của các cá thể trong cùng một loài hay các quan thé trong loài cũng như giữa các cá thé trong một quan thể. Trong
một loài, các giống khác nhau có trình tự đoạn gen khác nhau. Trong cùng một giống, các cá thê cũng có thể mang những trình tự gen khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt di truyền, có thể quy định thành một tinh trạng khác với những cá thé cùng giống. Sự khác biệt di truyền được ghi nhận thông qua sự khác biệt trong trình tự DNA, trong đặc tính sinh học (cau trúc protein, đặc trưng của enzyme), đặc điểm sinh lý (kháng lại các yếu tố bat lợi môi trường hay mức độ sinh trưởng) và đặc điểm hình thái (màu hoa, dạng cây) giữa các cá thể (Nguyễn Đức Thành, 2015).
1.3.2 Các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Việc xác định và mô tả đặc điểm của các loài Colletotrichum dựa trên các đặc điểm hình thái học như kích thước và hình dạng của bào tử và giác bám, sự ton tại của lông cứng hoặc sự hiện diện của giai đoạn hình thức hữu tính, và các đặc điểm văn hóa như màu sắc khuẩn lạc, tốc độ tăng trưởng và kết cấu (Smith và Black, 1990 ). Chỉ những tiêu chí này không phải lúc nào cũng đủ dé phân biệt các loài vì sự khác nhau về hình thái và kiều hình giữa các loài trong các điều kiện môi trường khác nhau. Dé khắc phục các vấn đề phân loại liên quan đến các phương pháp nhận dạng truyền thống này, các phân tích trình tự DNA đã được sử dụng dé mô ta đặc điểm và giải quyết sự phức tap về phân loại của một số chi nam Colletotrichum (Photita ctv, 2005). Cannon va ctv (2012) tuyên bố rang dit liệu thu được từ các phân tích axit nucleic sẽ cung cấp khuôn khổ đáng tin cậy nhất dé xây dựng phân loại Colletotrichum vì các đặc tính DNA không bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các yếu tố môi trường. Ứng dụng kết hợp các công cụ chân đoán phân tử, cùng với các phương pháp truyền thống, bao gồm đặc tính hình thái học và thử nghiệm khả năng gây bệnh, là một cách tiếp cận phù hợp và đáng tin cậy để nghiên cứu các quan thê loài Colletotrichum (Cannon và ctv, 2000).
Chỉ thị DNA là những thay đổi trong phân tử DNA, nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh hưởng tới kiểu hình. Chỉ thị DNA là một đoạn DNA được sử dụng đề đánh dấu hay truy theo một vi trí (locus) trên nhiễm sắc thể. Những chi thị DNA mang day đủ các đặc tính của một chỉ thị di truyền điển hình. Khác với chỉ thị hình thái và chỉ thị sinh hoá, chỉ thị DNA không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Chỉ thị DNA được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình (Bảng 1.1) (Nguyễn Đức Thành, 2015).
Các chỉ thị phân tử ngày nay càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong phân tích
da dang di truyền.
Bảng 1.1 Các chỉ thị DNA thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền (Nguyễn Đức Thành, 2015).
Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt
Các chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA
RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn Polymorphism chế
REF Restrition Endonuclease Lay dau cat han ché
Fingering
Cac chỉ thị dựa trên phan ứng PCR
AFLP Amplified Fragment Length Da dạng độ dai khéch đại
Polymorphism chon loc
RAPD Randomly Amplified DNA đa hình được khuếch
Polymorphism DNA đại ngẫu nhiên
AP-PCR Arbitrarily primed PCR PCR với primer ngẫu nhiên Các chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tỉnh
ISSR Inter — Simple Sequence Repeats Chuỗi lặp lại đơn giản giữa ISTR Inverse Sequence Tagged Chuỗi lặp lại ngược được
Repeats đánh dấu Các chỉ thị PCR các chuỗi đặc trưng
STS Sequence — Tagged — Site Vị trí chuỗi đánh dau
SCAR Sequence Characterised Vùng nhân bản các trình tự Anplfication Regions được mô tả
SSR Simple Sequence Repeats Các chuỗi lặp lại don giản
Các chỉ thị gen nhảy
REMAP Retrotrasposon — Microsatellite Da hinh tiéu vé tinh gen
Amplified Polymorphism nhảy được khuéch đại
IRAP Inter — Retrotrasposon Amplified Da hình gen nhảy giữa được Polymorphism khuéch dai
Cac chi thi nhan khac
ITS Interal Transcribed Spacer Vùng sao mã giữa
SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn
DarT Diversity array Technology Céng nghé sap xép da dang
Chỉ thi DNA có hiệu quả cao hon so với các chỉ thi sinh hoa truyền thống do nghiên
cứu trực tiép vật liệu di truyền và có thê tìm ra môi quan hệ giữa các loài (William và
ctv, 1990). Việc sử dụng các chỉ thi sinh hoá có nhiều hạn chế vì phải sử dụng số lượng
mau lớn (Babik và Rafinski, 2000). So với chi thị hình thái, chỉ thị DNA tiết kiệm hon về thời gian và công sức (Cooke, 1984).
1.3.3 Kỹ thuật ISSR ( Inter — simple Sequence Repeats)
Nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật chỉ thị phân tử ISSR được xuất bản năm 1994.
ISSR là một trong các loại chỉ thị microsatellite sử dụng nguyên tắc cơ bản của RAPD với môi hình thành từ phần của chuỗi microsatellite và phan base ngẫu nhiên có độ dài khoảng 16 — 25 bp (Reddy va ctv, 2002). Các mỗi sử dụng có thé là non — anchored hay
còn gọi là MP — PCR (microsatellite primed PCR) (Gupta va ctv, 1994), hoặc là anchored ở vi trí 5’ hoặc 3’ với 1 - 4 base (Zietkiewicz va ctv, 1994). Trinh tự primer
được sử dung trong phan ứng PCR — ISSR được thiét ké dua trén những đoạn trình tự nucleotide lặp lại đơn giản gồm 2 nucleotide như (CA), (AT)n, (AG)n hay những trình tự gồm 3 nucleotide được lặp lại nhiều lần như (AGC), (TA TT)n.
(a)
s TempiateDNA 3 [ TCICTCTCTCTCTICTCTCTCTd
[AGAGACAGACAAGA—_ Primer
(__ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ]
3 —` : 5
Amplified product
(b)
s 3 [ TCTICTCTCTCTCTCTCICIC ]
[wwWwarwwzm
[_ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ]
3# =———=——=——=— kả
(c)
s 3 [ TCTCTCTCTCTCTCTCTCTC |
[ — CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT J 3 s
Hình 1.4 Kỹ thuật ISSR mồi đơn (AG)s, non — anchored (a), 3’ — anchored (b) và 5’-
anchored (c) (Reddy va ctv, 2002)
Về nguyên tac, PCR sẽ khuếch dai những đoạn sườn (nằm kế cận) các motif microsatellite. Trong những điều kiện khuếch đại phù hợp, kỹ thuật ISSR cho phép sản
sinh vài chục sản phẩm có chiều dài trong khoảng 200 — 2000 bp, do đó chúng có thé
được điện di trên gel agarose hay gel acrylamide (Reddy va ctv, 2002). Sự đa dạng được
phát hiện chủ yếu thuộc dạng xuất hiện hoặc không xuất hiện như đối với RAPD nhưng đôi khi tương ứng với sự khác nhau trong độ dai các đoạn như đối với microsatellite.
Các bước thực hiện kỹ thuật ISSR:
- Tach DNA hệ gen.
- Chay PCR với DNA hệ gen với mồi đơn là các microsatellite.
- Phân tách các đoạn DNA được khuếch đại trên gel agarose.
- Nhuộm gel và chụp anh.
- Phân tích số lượng.
- Đánh giá đa dang di truyền
So với các chỉ thị khác, chỉ thị ISSR có các ưu điểm và nhược điểm xét về mức độ đa hình, chi phí thực hiện và ban chất của các chỉ thị (Bảng 1.1)
Bảng 1.2 Ưu điểm và nhược điểm của các chỉ thị phân tử (Vijayen, 2005)
Tên chỉ Sử dụng Mức độ đa Chỉ phí Chi phí
Bản chất
thị PCR hình đầu tư thực hiện RFLP Khong Trung binh Déngtrdi Cao Cao
RAPD Có Cao Trội Thấp Thấp
SSR Có Cao Đồngtrội Cao Trung bình ISSR Có Cao Trội Thấp Thấp
AFLP Có Cao Trội Trung bình Trung bình
lsozyme Không Thấp Đồng trội Cao Trung bình
SIS Có Cao Trội Cao Trung bình
Trong hầu hết trường hợp, ISSR là chỉ thị mang tính trội (Tsumura và ctv, 1996).
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nó là chỉ thị đồng trội có thé phân biệt được cá thể đồng hợp tử và di hợp tử (Sankar va Moore, 2000). Những chi thị ISSR được phát hiện rat đa hình. ISSR có ưu điểm hơn RADP do sử dụng môi có kích thước dai hơn nên các điều kiện trong giai đoạn bắt cặp của các môi có sự nghiêm ngặt cao, hạn chế được hiện tượng nhằm lẫn bắt cặp giữa các primer dẫn đến khả năng lặp lại (reproductible) cao hơn RAPD (Zietkiewicz và ctv, 1994). Nghiên cứu khả năng lặp lại của ISSR cho thay
92 — 95% các băng DNA được khuếch đại từ cùng mẫu DNA của cùng một giống.
Những băng mờ nhạt, không rõ mới không có khả năng lặp lại. Hơn nữa, kỹ thuật này
thực hiện đơn giản, ít tốn thời gian và chi phí không cao so với các chỉ thị phân tử khác
(Reddy và ctv, 2002). Theo Bornet và Branch (2001) khi nghiên cứu sử dụng ISSR trên bông cải và cây dâu tây thì chỉ thị ISSR có khả năng lặp lại cao và đáng tin cậy. Hiện
nay, kỹ thuật ISSR được sử dụng rộng rãi trên trong nghiên cứu nhận diện di truyền, đa dạng di truyền, lập bản đồ genome, xác định gen trong chọn giống cây trồng và nghiên
cứu hoá sinh học (Reddy và ctv, 2002).
1.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền
Da dang di truyền giữa các cá thé trong một quan thé được đánh giá dựa vào mức độ đa dạng gen. Đa dạng gen là số băng đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình được thực hiện bằng việc khuếch đại các trình tự DNA với các primer hoặc các cặp primer bằng các kỹ thuật chỉ thị DNA tương ứng. Số băng DNA đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình có thể dao
động từ 0 — 100% và giá trị càng lớn thì mức độ đa dạng càng cao. Tỷ lệ băng đa hình
được tinh bằng tổng số băng đa hình trong quan thé nghiên cứu chia cho tông số các băng ghi được (Nguyễn Đức Thành, 2015).
Phân tích sự đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử DNA bao gồm phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thu thập và các chỉ số đa dạng di truyền ở mức độ cá thé hay quan thé. Quan hệ di truyền giữa các cá thé trong quan thé được đánh giá dựa vào hệ số tương đồng di truyền (genetic similarity cofficient) hoặc hệ số không tương đồng di truyền (genetic dissimilarity cofficient). Các hệ số thường dùng là hệ số Dice (còn gọi là hệ số Nei và Li); hệ số Jaccard; hệ số phù hợp đơn giản (SM) (Kosman
và Leonnard, 2005).
Mối quan hệ di truyền được thé hiện bằng việc phân nhóm dựa trên các thuộc tính hay mối quan hệ chung của cá thể thông qua việc sử dụng các hệ số tương đồng.
Hệ số tương đồng được tính toán dựa vào các số liệu về chỉ thị DNA dé phân nhóm theo biéu đồ hình cây hoặc biéu đồ kiểu hình. Các phương pháp phố biến dé xây dựng biểu đồ hình cây cho ma trận khoảng cách là phương pháp nhóm cặp không điều chỉnh sử dụng các giá trị trung bình số học (UPGMA) (Sneath và Sokal, 1973); phương pháp lân cận (NJ) (Saitou va Nei, 1987). Phần mềm NTSYSpc (Rohlf, 2000) được sử dụng thông
dụng nhất trong phân tích phân nhóm dựa trên số liệu chỉ thị phân tử DNA (Nguyễn
Đức Thành, 2015).
1.4 Một số nghiên cứu về da dạng hình thái và đa dạng di truyền chỉ nắm Colletotrichum spp. trên thế giới và Việt Nam.
Khi nghiên cứu khảo sát sự đa dạng di truyền của những chủng nam Colletotrichum spp.
gây bệnh than thư hại ớt phân bố ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Lê Thị Kim Huyén (2013) đã sử dụng 5 primer chuyên biệt dựa vào kỹ thuật RAPD cho thấy mức độ tương đồng của các chủng nam Colletotrichum spp. biến thiên từ 37,5 — 99,8%. Dựa vào sơ đồ phân nhanh cho thấy, 51 chủng nam gây bệnh than thư hại ớt chia thành 2 loài C. capsici và C. acutatum.
Trong một nghiên cứu về chủng nam C. falcatum của tác giả Prittesh Patel (2018), sự đa dang di truyền dựa trên PCR 6 các mẫu C. falcatum bang cách sử dụng chị thị phân tử ISSR.
Tổng cộng có 39 ISSR đã được sang lọc trên 10 lần bổ sung C. falcatum, trong đó 21 ISSR đã cho thấy sự khuếch đại nhất quán. Thống kê liên quan đến biến thể di truyền được ước tính xử ly bằng phần mềm NTSYSpe với hệ số Dice. Kết qua cho thấy 68,07% tinh đa hình và hệ số tương tự nằm trong khoảng từ 0,73 đến 0,93 trong phân tích ISSR. Chương trình dendro được tạo bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử ISSR và các phần bé sung được nhóm RAPD - ISSR kết hợp thành các cụm khác nhau cho thay sự thay đồi phân tử ở mức độ đáng kê giữa các phần bổ sung C. falcatum. Cũng có thé thay rõ từ các sơ đồ PCR rằng các phần bé sung khá phân tán với các hệ thống đánh dau được thử nghiệm cho thấy cơ sở di truyền tốt.
Trong nghiên cứu về chủng nam C. fruncatum ở Malaysia, tác giả Farshid Mahmodi (2013), kết luận rằng chỉ thị phân tử ISSR được sử dung dé ước tính sự đa dang di truyền ở C.
truncatum. Một bộ 3 đoạn mồi ISSR đã tiết lộ tổng cộng 26 alen từ các san phâm được khuếch dai. Phân tích cụm bằng phương pháp UPGMA phân lập cụm C. @runcatum thành hai nhóm chính, khác nhau với khoảng cách 0,64. Tuy nhiên, sự đa dang di truyền của các dong phân lập C. truncatum cho thấy mỗi tương quan giữa phân bồ di truyền và địa lý, nhưng nó không phát hiện ra mối quan hệ giữa sự phân cụm và tính biến đôi gây bệnh. Các phân tích phát sinh loài đã phân biệt các chủng phân lập C. truncatum với các loài Colletotrichum tham chiếu khác có nguồn gốc từ Ngân hang gen. Trong số các đặc điểm hình thái, hình dang, mau sắc của khuẩn lạc và tốc độ tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy có tương quan một phần với ISSR và
nhóm phát sinh loài.
Chương 2