Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, ánh sáng, BA, IBA, NAA đến sự hình thành mô sẹo, nhân chồi và tạo rễ in vitro của cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch.)

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàntoàn ngẫu nhiên đơn yếu tô và hai yếu tố với ba lần lặp lại với mục tiêu là xác định nồng độ 2,4-D kết hợp với thời gian chiếu sáng đến quá trình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

te ve ve ve ve ee

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ 2,4-D, ANH SANG, BA, IBA, NAA DEN

SỰ HÌNH THÀNH MO SEO, NHÂN CHOI VÀ TẠO RE IN VITRO

CUA CAY DAU TAY (Fragaria x ananassa Duch.)

SINH VIÊN THUC HIỆN : BUI MINH ĐỨCNGÀNH : NÔNG HỌC

KHÓA : 2019 - 2023

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2023

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ 2,4-D, ANH SÁNG, BA, IBA, NAA DEN

SỰ HÌNH THÀNH MO SEO, NHÂN CHOI VA TAO RE IN VITRO

CUA CAY DAU TAY (Fragaria x ananassa Duch.)

Tac gia

BUI MINH DUC

Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Hướng dẫn khoa họcThS Nguyễn Thị Thanh Duyên

Thành phố Hồ Chí MinhTháng 11/2023

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cô gang của bản thân còn có sự

giúp đỡ và động viên của mọi người Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ba Me là người có công sinh thành, nuôi day va tạo mọi điều kiện tốt nhất dé chocon được như ngày hôm nay và trong tương lai

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và thầy côKhoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy,truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên môn bé ích trong suốt 4 năm học và tạo mọi

điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Thanh Duyên,người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, góp ý và định hướng cho em trong suốt quá trìnhthực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cám ơn các bạn Anh Hào, Nhật Hào, Thúy Vy, Tú Trinh, An Khang đã tạo cảm

hứng, đồng hành và chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ nhau thoan thành khóa luận tốt nghiệp

Cám ơn các bạn trong lớp DHI9NHB - Trung Kiên, Vỹ Khang, Minh Nhật,

Quyền Cước, Phi Yến, Thanh Thương đã tận tình giúp đỡ mình trong quá trình thựchiện khóa luận.

Thành phó Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 11 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Bùi Minh Đức

1

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “ Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, ánh sáng, BA, IBA, NAAđến sự hình thành mô sẹo, nhân chéi và tạo rễ in vitro của cây Dau tây (Fragaria xananassa Duch.) ” đã được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộmôn Di truyền - Giống Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ ChíMinh từ tháng 05/2023 đến tháng 11/2023 Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàntoàn ngẫu nhiên đơn yếu tô và hai yếu tố với ba lần lặp lại với mục tiêu là xác định nồng

độ 2,4-D kết hợp với thời gian chiếu sáng đến quá trình tao mô sẹo, sự tương tác củanồng độ IBA, BA đến khả năng nhân nhanh chồi, nồng độ NAA thích hợp tác động đếnquá trình tạo rễ của cây Dâu tây in vitro Kết quả ghi nhận được như sau:

Tại thời điểm 49 ngày sau cấy, mẫu lá đặt trong điều kiện tối kết hợp với môitrường MS bé sung 2,0 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ mẫu tao mô sẹo tốt nhất (69,3%) với khốilượng mô seo cao nhất (254,8 mg), mô sẹo chắc có màu nâu vàng

Môi trường MS bồ sung 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L IBA thích hợp cho quá trìnhnhân nhanh chồi, có hệ số nhân chéi là 11,9 lần, số lá đạt 40,0 lá, chiều cao chổi 3,8 cm,trọng lượng tươi cụm chéi nặng 2,4 g sau 42 ngày nuôi cấy

Môi trường tối ưu cho quá trình ra rễ là MS kết hợp bồ sung 0,1 mg/L NAA chokết quả tốt về tỷ lệ ra rễ (100%), số rễ/cây đạt 17,3 rễ với chiều dai 2,5 cm, đường kính

cô rễ 2,5 mm Chiều cao cây là 5,2 em có số lá/cây là 5,6 lá ở thời điểm 21 NSC

a Se en ix

)/9827000000 |

Đặt vấn đỀ 00 0 2 12212212212112112212112111111211211111111111121111 eo 1MGC THS kosgsaoessi000500D0001EE50G9000TEGGHRNEGENGXIGIEGHEISHERGGIBEEGICAENSIHISRNEUEAGEEREGIGSGENISGASSRBSSSSISSNĐSE.SSB 2

“1 51L 2

ẫil han, secs iS i 5

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆỆU 2©222222222E22E2EzEzzzzszrszrszrszrssesees 31.1 Sơ lược về cây dâu tây ¿- 2 2¿©2+2222212212211221221221271211221111211211211211 21 xe 31.1.1 Phan loại thực vật của dâu tây 2 + +2 22x Ssssssrrsrrrrrrrrrrrrrrrrrrrereest en:1.1.3 Đặc điểm thực vật học của đâu tây 22 s+cs+zsszxerserserserssrserserxeeec- Ổ1.2 Gia tri cla Cy Cau tay ố 4 l,1 4Gfliirdinh:lÐØfEsszsssxsssssesesiosastoeroiioteoetibittoileiiniOĐEBOABEHERasgabRansssul 41.2.2 Giá trị kinh tẾ S2 2<SE22E22122221121211212112111121121111211211 112112111 ceg 41.3 Tình hình sản xuất dâu tây trên thé giới và Việt Nam -2 2222z 5lLTI Tu HỄ senescence 5

II NGÀ (Ai 435»Ả3: 61.4 Nuôi cấy TG 16 bảo thực vật cao 21 H111 1101011021700102210001107-6 61.4.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy Tð tẾ bảo tng: VỆ eeeisesiieiekioiosaeoaossi 61.4.2 _ Lịch sử nuôi cấy mô trên thé giới - 2: 252+2S+2E+SE+£E££EzZEtzErzxezxzzxeze 71.4.3 Lịch sử nuôi cây mô ở Việt Nam - - + +22 ++**+2E++EEEsserrkerkrrrerrxee 8

1443 TNHữNgiÔNg ep cre eccceszcneccrrsecccermsesmnarinoserrcermiinneteamninnesemeteeoremees 91.4.5 Một số chat điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy in vi/ro 121.4.6 Những yếu tô ảnh hưởng đến kĩ thuật nhân giống vi/ro 13

1V

1.4.7 Các phương pháp nuôi cay mô tế bào thực vật -2 22©2z+22z+zz+cs2 161.5 Tinh hình nghiên cứu nhân giống cây dâu tây ở Việt Nam và trên thé giới 17TRÀ THEE RE 5 17

1.5.2 Ở Việt Nam 5c TT EEE121E11111121121 1111121111211 re 18

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 202.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2- 2 2+2222E2+2EE+EE22EE222E2222222222222222.e 202.2 Vat 0003 20

CE Se roi oin1600/001966/00000300008100000010808660006 20

2.2.2 Thiét bi c0 202.2.3 Điều kiện nuôi cay in vitro các thí nghi€m ceeceesceeeceesceeeneeeseeeseeesseeesees 20

2.2.4 Môi trường nuôi cấy trong thi mghiGm occ eececceecsecseeseeseeestecseeseeeneens 212.3 Bồ trí thí mghiGm oe cecceecccccccccccssessesseesessssesseseesssesssessssssesseseesseseessnssnsenseesaeeeeeees 222.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nông độ 2,4-D và thời gian chiếu sáng trong tạo môSCO CAY DAU tay 1 222.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA va IBA đến khả năng nhân nhanh chồi câyB0 242.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây DâuLEA sere sate eerie ee a a pe to ee mS 272.4 Phương pháp xử lý số liệu 2-22 ©22222+2E22EE2EE+2EE2EEE22122122212212211221 221.22 29Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-©222222222+222z22Eerxrerrrerrree 303.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và thời gian chiếu sáng trong tạo mô sẹo từ mẫueA: TD A LAN 5-sasssssomsiossesossdlossvonsdiontsaili/SGosusBiljmrzscBinloniosipsgiGrcGUEBl8urge2:30nimoloc-iGErrgrcag3uiEngigisioidtxgss 303.2 Ảnh hưởng của BA va IBA đến kha năng nhân nhanh chéi cây Dau tay 373.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây Dau tây 45KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, 2 ©22S2S22S22E122122112212711211 2212112112112 1c xe 53TÃITIƑU THAM BA sie osscesercosiczneeccsaskorcovstnanuntevesrevhsicssvesiiunvcaleasensananecaueinuvuett 54

310800 9-3 58

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Analysis of variance (Phan tich phuong sa1)

6 - benzyladenineChi cuc Trong trot va Bao vé thuc vat

Cong tac vién Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức Luong thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc)

Gibberellic acid Indo - 3 - butyric acid

6 - purfurylamino purineLan lap lai

Musrashige and SkoogNgày sau cấy

1 - Naphthalene acetic acid Nghiệm thức

Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Thidiazuron

vi

DANH SÁCH CÁC BÁNG

Trang

Bang 1.1 Diện tích dâu tây trên thế giới (ha) trong giai đoạn 2016 - 2020 5

Bảng 1.2 Năng suất dâu tây trên thế giới (tan/ha) giai đoạn 2016 - 2020 5

Bang 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng dâu tây tai Lam Đồng giai đoạn 2015

-0 a ee ee ee eee ee sesl 6Bang 2.1 Thanh phan các mơi trường được sử dung trong thí nghiệm 21Bang 2.2 Các nghiệm thức thi nghiệm 1 eee cece eecceceeseeeeeeseceneeseeeeeseeeneeseeeeeenes 23 Bang 2.3 Cac nghiệm thức thi nghiệm 2 - <2 eee eeeeeceeeeecesceeeeeeeeneenees 25 Bang 2.4 Các nghiệm thức thi nghiệm 3 - - (5< 2< SE SE SE £*£eEeeEereereerrrkrre 27Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và nồng độ 2,4-D đến tỷ lệ tạo mơ sẹo

(%) từ mẫu lá cây Dâu tây ¿- ¿2 522222E2212E221221212122121121221211212121121 212121 xe 31

Bang 3.2 Anh hưởng của thời gian chiếu sáng và nồng độ 2,4-D đến tỷ lệ (%) chết

mau 1a CAY DAU mm ›ồ.ễ'®^®^'®^®^.ễ.ễ5®"êễ.ễ£ 33

Bang 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng (gid/ngay) và nồng độ 2,4-D (mg/L)đến hình thái, mau sắc mơ sẹo vào thời điểm mơ sẹo bắt đầu hình thành 3 5Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và nồng độ 2,4-D đến thời điểm (ngày)xuất hiện mơ sẹo và khối lượng tươi (mg) mơ sẹo ở 49 NSC - -.ỮBang 3.5 Ảnh hưởng của tơ hợp BA và IBA đến số hệ số nhân chdi (lần) cây Dâu tâyOe: ee:Bang 3.6 Anh hưởng của tơ hợp BA va IBA đến số lá/cụm chi cây Dâu tây qua các7272/2755 50070000 000 yänn g1 4]Bảng 3.7 Anh hưởng của tổ hợp BA va IBA đến chiều cao chéi (cm) cây Dâu tây qua

các thời điểm - 522-2222 22 2112221 222.1 2 TH HH Hưng 43

Bang 3.8 Ảnh hưởng của tơ hợp BA va IBA đến trọng lượng tươi cụm chi (g) câyDâu tây tại thời điểm 42 NSC -2- 252 22222222222212212212211271211211211 2121111 eEcre 44Bảng 3.9 Anh hưởng của NAA đến chiều cao cây Dâu tây (cm) qua các thời điểm 46Bảng 3.10 Ảnh hưởng của NAA đến số lá/chồi cây Dâu tây qua các thời điểm 47Bang 3.11 Ảnh hưởng của NAA đến tỷ lệ ra rễ (%) chồi cây Dâu tây qua các thời

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của NAA đến số rễ (rễ/chồi), chiều đài rễ (cm) và đường kính

cô rễ (mm) cây Dâu tây tại thời điểm 21 NSC 2-2 522E22E22E22E22E2E2222e2xe 49Bang 3.13 Ảnh hưởng của NAA đến chiều dai lá (em) và chiều rộng lá (cm) cây Dâutây tại thời điểm 21 NSC áccsc- s62 220011615060 116 11x18 20144 0 184001160504186 0611101114038 51Bang PL 1.1 Chuyén đổi số liệu tỷ lệ tạo mô sẹo (%) từ mẫu lá cây Dâu tây tại các

thời điểm (NSC) bằng công thức arcsin%jx -2- 22 2+222222E+22E22EE222E2zxzzxzres 58Bang PL 1.2 Chuyên đổi số liệu ty lệ chết (%) mẫu lá cây Dâu tây tại các thời điểm(NSC) bằng công thức arcsin^lx 222222222 223222122212212212211211221122112211 221 ee ao)

Bảng PL 1.3 Chuyên đôi số liệu tỷ lệ ra rễ (%) chồi cây Dâu tây qua các thời điểmbằng công: Ho: aEESÌHĐA eo HH HH HH0 GHE00711001001 1033123.0000022010004 003) 60

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình oll, Cay AWA ssseneesnnndtiodsbintinostiisigigstioet3i3i0X6nS08010008033H.3°0gg0389 2NngSE0t-EuE818.018g10ui0s.npuli

Hình 2.1 Mẫu lá dau tây sau khi cat 0 0.cccccccccccecccsessesssessesssessesesessesseessesseeseessesstesseens 22Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm L -2- 2 2+S+SE+EE+E2EE#EE2EEEEEEE2E2322122223 2x22, 23Hình 2.3 Mẫu chôi dâu tây đã xử lý 22-©22222+2222222222EE22E222EE22EE22Eecrkree 24Hi: 35 Su đỗ tổ trì lí nghi ẤT 7 ssseeenokidhuiklnlogilEslniggchoggikkintkitsisrsgsggi6i60008/máenusi 25Hình 2.5 Choi cây dâu tây từ cụm chồi thí nghiệm 2 -2 2222+2E222++£Ez2zzzz+2 27Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 - 2-2 ©222SE22E22EE22E222122122212712212221212222 2e 28Hình 3.1 Mô sẹo Dây tây ở thời điểm 49 NSC 2-©22©22222222222E222222EEEzrrcrev 35Hình 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến quá trình nhân nhanh chéi cây Dâu

Hình 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến qua trình ra rễ cây Dâu tây - 49Hình PL2.1 Toàn cảnh thí nghiệm 1 cee 5-5-2252 *S2*S*£+2E£>E+zerrerrerrrrrrrree 61

Hình PL2.2 Mô sẹo 35 NSC - 2 2-25 212E1221122121121127112111121121111 211 1c 61

Hình PL2.3 Mô sẹo chét c.ccccccscsecsssesessessceesesecsesscsvssecsesssesssesstsesevssevstsssevetesseteeeees 61Hinh PL2.4 Miẫu lá bị nhiễm khuẫn S202 260,6, 61Hình PL2.5 Toán cảnh thí ighi@it 2 sicssccsssssessssssunsssssesesonsanasvesnsnessaveassasveunsansevevsssessnass 62Hình PL2.6 Cụm chồi bồ sung 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L IBA 42 NSC 62

Hình PL2.7 Mẫu nhiễm khuẩn 02.0.0 ccccccceceecececseseeeeseecseeseeseesesseseeeeseesaeenseesseeeees 62

Hình PL2.8 Chéi dâu tây 21 NSC bổ sung 0,5 mg/L BA + 0,3 mg/L IBA 62Hình PL2.9 toàn cảnh thí nghiệm 3 - - - G2 E222 2v vn ng ng re 63Hình PL2.10 Hiện tượng tạo mô sẹo ở rễ khi bỗ sung 0,7 mg/LNAA 63

Hình PL2.11 Cây ra rễ ở môi trường MS 2-5252 2++222E+£E+EE2Ezzxerrzrrxerrrrs 63

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Dau tây (Fragaria x ananassa Duch.) thuộc chỉ Fragaria họ hoa hồng (Rosaceae)

cung cấp nhiều chất khoáng như Ca, K, Fe, Mn, các loại vitamin A, vitamin nhóm B và

đặc biệt là vitamin C khá cao, cao hơn cả cam va dưa hấu (Nhan Minh Trí va ctv, 2014).Ngoài ra, qua dâu tây còn có tác dụng chống oxy hóa nhờ chứa nhiều anthocyanin thuộcnhóm flavonoid (Cordenunsi và ctv, 2002) và chất fisetin giúp bảo vệ tế bào tránh bị lãohóa (Hà Thị Tuyết Phượng, 2010) Nghiên cứu cho thấy quả dâu tây chứa chất ellagicacid có khả năng chống ung thư (Selva Muthukumaran và ctv, 2017)

Hiện nay, nhiều giống dâu tây đã được du nhập và trồng ở một số vùng tại ViệtNam Dâu tây có thể cho quả quanh năm Cây giống được nhân giống bằng phương pháptruyền thống là tách cây con từ ngó cây mẹ, cây có hệ số nhân, độ đồng đều thấp về lâudài còn gây ra hiện tượng thoái hóa giống (Sở NN&PTNT Lâm Đồng, 2019) Ngượclại, sử dụng phương pháp nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô giúp tạo cây con

đồng nhất về mặt di truyền với số lượng lớn, sạch bệnh từ nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu

và sử dụng số lượng nguồn mẫu nhỏ (Dương Tan Nhựt, 2007) Do đó phương pháp nhângiống in vitro là công cụ hiệu quả cho phép nhân nhanh tạo ra số lượng lớn cây giốngđồng nhất về mặt di truyền (Biswas và ctv, 2009; Freddi và ctv, 2006).

Phương pháp nhân giống in vitro cần đầu tu trang thiết bị, hóa chất với giá thànhcao Trong số các loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D là một auxinmạnh kích thích sự hình thành mô sẹo Sự kết hợp giữa BA và IBA thích hợp để nhanh

nhanh chồi Dâu tây NAA cần thiết cho quá trình ra rễ cây Dâu tây Do đó, việc sử dụng

các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ và điều kiện thích hợp nhằm giảm chi phí sảnxuất, tăng lợi nhuận khi cây Dâu tây đạt tiêu chuẩn xuất vườn

Xuất phát từ vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, ánh sáng,

BA, IBA, NAA đến sự hình thành mô sẹo, nhân chdi và tạo rễ in vitro của cây Dâu tây

(Fragaria x ananassa Duch.)” đã được tiễn hành

Mục tiêu

- Xác định được nồng độ 2.4-D và thời gian chiếu sáng thích hợp trong quá trình

tạo mô sẹo của mẫu cây Dâu tây

- Xác định được nồng độ BA, IBA thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi của

mẫu cây Dâu tây

- Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của chồi cây Dâu tâyYêu cầu

Bồ trí thí nghiệm chính quy đầy đủ, theo dõi và ghi nhận lại ảnh hưởng của nồng

độ 2.4-D, ánh sáng, BA, IBA, NAA đến quá trình tạo mô sẹo, nhân nhanh chỗi và tạo

rễ cây dâu tây in vitro

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ thực hiện nuôi cấy giống cây Dâu tây ở giai đoạn tạo mô sẹo, nhânnhanh chồi, tạo rễ tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di Truyền - Giống, Trại thựcnghiệm khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh từ thang 05 năm

2023 đến tháng 10 năm 2023

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 So lược về cây dâu tây

1.1.1 Phân loại thực vật của dau tay

Dau tây (Fragaria x ananassa Duch.) cây cha mẹ có nguồn gốc từ Châu Mỹ va

được các nhà làm vườn Châu Âu lai tạo vào thé kỷ XIIX từ Fragaria chiloensis và

Fragaria virginiana dé tạo nên giỗng dau tây được trồng rộng rãi hiện nay

(Nguồn: en.wikipedia.org/wiki/Strawberry)

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của dâu tây

Theo Võ Khắc Chi (2003), cây dâu tây có đặc điểm:

1.1.3.1 Rễ

Dâu tây có hệ thống rễ chùm, rễ phát triển đến độ sâu cách mặt đất khoảng 30

cm, đầu chóp rễ có khả năng phân nhánh mạnh Có hai loại rễ là sơ cấp và thứ cấp Rễ

sơ cấp hút nước và chất đinh dưỡng cho thân ngầm Rễ thứ cấp mọc ra từ rễ sơ cấp và

chỉ sống trong vài ngày hoặc vài tuần Rễ cây dâu tây phát triển tốt trong điều kiện nhiệt

độ đất khoảng 25°C

1.1.3.2 Thân

Dâu tây là cây lâu năm, thân thảo, sống đa niên, thân ngắn với nhiều lá mọc rấtgần nhau Cuống lá và chéi hoa mọc ra từ chồi của thân và được bao bọc bởi lớp vaymàu nâu Có 2 kiểu thân là thân chính và thân bò Một số chéi nách có thé phát triển

3

thành nhánh với những đốt dải gọi là ngó, những ngó này hình thành lá và rễ mới từ các

mắt.

1.1.3.3 Lá

Tùy vào mỗi giống sẽ có đặc điểm lá khác nhau Đa phần các giống dâu tây đều

có lá kép với 3 lá chét, một số giống có 4 hoặc 5 lá chét, mép lá có răng cưa Cuéng ládài, thường có màu trắng khi lá còn non và chuyên sang màu đỏ của đất khi lá già Lá

dâu bao xung quanh thân, và thường có dạng oval.

1.1.3.6 Quả

Quả của dâu tây là một loại qua gia do dé hoa phình to, qua thật nằm ở bên ngoàiquả giả Quả có hình bầu dục, quả non có màu xanh lục, khi quả chín, quả có màu hồnghoặc màu đỏ tuỳ từng giống Quả dâu tây có mùi thơm, vị ngọt lẫn vị chua

1.2 Giá trị của cay dau tay

1.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Dây tây đã được sử dụng như thuốc nhuận tràng, lợi tiêu, sát trùng Lá dâu tâychứa flavonoid, tanin, tinh dầu dé bay hoi và các alkaloid Vitamin trong dâu tây có giátrị trong chữa bệnh do hấp thu kém chất dinh dưỡng ở đường ruột Ngoài ra, dâu tây cóchứa hàm lượng chất chống oxi hóa cao, chống viêm, chống huyết khối, kháng khuẩn,giảm dau và chống ung thư (Arzu Birinci Yildirim va ctv, 2014)

phố lớn và các tỷnh, huyện lân cận Doanh thu thuần của dâu tây cao gấp khoảng bốnlần mia và cao hơn khoảng chín lần so với lúa mi (Afridi va ctv, 2009) Ở Lâm Đồng,

năng suất dâu tây trung bình khoảng 9 - 10 tắn/ha/năm với giá trung bình là 100.000

đồng/kg thì lợi nhuận khoảng 400 - 700 triệu/ha/năm (Cao Thị Làn và ctv, 2019)

1.3 Tình hình sản xuất dâu tây trên thế giới và Việt Nam

1.3.1 Trên thế giới

Theo thống kê của FAO (2020), điện tích trồng dâu tây trên thế giới khoảng

384.668 ha dâu tây với năng suất đạt 23,04 tan/ha

Bảng 1.1 Diện tích dâu tây trên thế giới (ha) trong giai đoạn 2016 - 2020

Châu lục 2016 2017 2018 2019 2020

Thế giới 365,867 370,986 394,843 400,026 384,668

Chau A 138,726 143,555 155,866 161,887 164,204Chau Au 161,918 159,416 170,648 166,173 151,529Chau My 49,054 52,389 49,169 49,964 46,282 Chau Phi 13,934 13,156 16,147 19,134 20,126Châu Úc 2,235 2,470 3,013 2,868 2,527

(Theo FAO, 2022)

Trong khi diện tích trồng dâu tây ở các nước châu A và châu Phi có xu hướngtăng dần qua từng năm thì châu Mỹ và chau Âu lại có xu hướng giảm dan điện tích canhtác Xét về diện tích trồng dâu, đứng đầu là châu Á với 164,204 ha, châu Âu đứng vị tríthứ 2 với 151,529 ha Châu Mỹ đứng đầu về năng suất với 43,50 tan/ha, vị trí tiếp theo

là châu Phi với 39,02 tắn/ha

Bảng 1.2 Năng suất dâu tây trên thế giới (tắn/ha) giai đoạn 2016 - 2020

Châu lục 2016 2017 2018 2019 2020Thế giới 21,97 22,23 21,61 22,52 23,04Chau My 44,16 43,76 44,75 45,10 43,50 Chau Phi 38,34 38,04 37,66 38,32 39,02Chau A 25,81 26,14 25,42 26,01 26,41Châu Úc 23,75 19,94 20,31 25 n15 24,61

Châu Âu 10,54 10,36 9,98 10,47 10,99

(Theo FAO, 2022)1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam cây dâu tây chủ yếu được trồng ở Đà Lạt - Lâm Đồng và

một số vùng có khí hậu ôn đới ở miền Bắc như: Sapa - Lào Cai, Mộc Châu - Sơn La.Hiện nay nguồn dâu tây sản xuất ở Việt Nam chủ yếu được nhập từ Pháp, Mỹ, Nhật,

New Zealand và một số giống được nhập từ Isarel

Theo số liệu thống kê của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật tỷnh Lâm Đồng(2020), điện tích trồng dâu tây 9 tháng đầu năm 2011 là 114 ha, đến năm 2012, chỉ cònkhoảng 70 ha Sau khi thay đổi phương thức canh tác trong điều kiện tự nhiên sang canhtac ứng dung công nghệ cao trong nhà màng, trồng trên giá thé và sử dụng hệ thống tướinhỏ giọt cũng như thay đối giống nên sản lượng dâu tây đã tăng dan Năm 2015 điệntích dâu tây đạt 132 ha, năng suất đạt 92,3 tạ/ha và sản lượng đạt 1.218 tấn Từ năm

2015 đến năm 2017, sản xuất dâu tây tại Lâm Đồng không có sự thay đổi nhiều nhưng

đến năm 2018 có sự nhảy vọt đáng kể Sau 5 năm diện tích dâu tây đã tang 44%, năngsuất dâu tây đã tăng 35% và sản lượng tăng gần gấp đôi (95%)

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng dâu tây tại Lâm Đồng giai đoạn 2015 - 2019

Tiêu chí 2015 2016 2017 2018 2019

Diện tích (ha) 1320 141,0 148,0 184,0 190,0

Năng suất (tạ/ha) 92,3 96,4 963 120,0 125,0Sản lượng (tấn) 1218 1359 1421 2208 2375

(Chi cục TT&BVTV tỷnh Lâm Đông, 2020)

1.4 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.4.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.4.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bảo là tính toàn năng di truyền

của tế bào thực vật Hanberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tếbào bất kì của cơ thê sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đề phát triển thành một

cá thê hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa

đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thé sinh vật đó.Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoànchỉnh Đó là tính toàn năng của tế bảo.

1.4.1.2 Sự phân hóa tế bào

Cơ thê thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quanchức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Trong tất cả cácloại tế bào đều có nguồn gốc từ một tế bào đầu tiên (tế bao hợp tử) Ở giai đoạn dau, tế

bào tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng chuyên biệt (chưachuyên hóa) Sau đó, từ các tế bao phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bao

chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.

Sự phân hóa tế bao là sự chuyền các tế bào phôi sinh thành các tế bao mô chuyênhóa, đảm bao các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thé biểu thị:

Tế bào phôi sinh > Tế bảo phân chia > Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt.Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, tếbao không hoàn toàn mat khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ởđiều kiện thích hợp, tế bao có thé trở về dang tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ.Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bảo

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chếcác gen tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đượchoạt hóa (vốn bị ức chế trước đó) dé cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bịđình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cầutrúc của mỗi phân tử DNA của mỗi tế bảo khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của

cơ thể thực vật luôn được hài hòa (Ngô Xuân Bình và ctv, 2003)

1.4.2 Lịch sử nuôi cấy mô trên thế giới

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô và tế bảo thế giới được bắtđầu từ năm 1902, Haberlandt dựa trên Học thuyết tế bào của Schleiden và Schwann lần

đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công Nuôi cấy

mô có thê chia thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 (1902 - 1930): giai đoạn của các thử nghiệm ban đầu

- Giai đoạn 2 (1934 - 1954): năm 1937, Gautheret nuôi thành công mô tế bảo ca

rot, phát hiện vai trò của vitamin, auxin va cytokinin.

7

- Giai đoạn 3 (1957 - 1992): tách và nuôi tế bào đơn, nhận biết vai trò của tỷ lệ

cytokinin/auxin, tạo được protoplast và tái sinh cây, tạo cây đơn bội từ nuôi túi phan từnăm 1980: phát triển công nghệ gene thực vật

- Giai đoạn 4 (từ 1992 đến nay): ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy môlớn và trên diện rộng

1.4.3 Lịch sử nuôi cay mô ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến

kỹ thuật nuôi cay mô thực vật

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học,

Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên

cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy baophan, nuôi cay mô sẹo và protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao 6 phan lúa vathuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội va ctv, 1978) Tiếp đó là thành côngnuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và ctv, 1978) Phòng thí nghiệm tiếp theo

được đặt tại Phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông

Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Hoc Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tậptrung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau QuảTrung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một sé tynh va co so san xuat (Da Lat,Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vậtphát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giốngkhoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện LâmNghiệp) Một số kết quả bước dau đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bàokháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mat nước (NguyễnTường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bào

trần, chuyên gen lục lạp cũng thu được kết quả (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993) Nuôi

cấy bao phần đề tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học

va Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây được liệu quý dé bảo tồn nguồn gen

va tạo các dòng tế bao có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển(Phan Huy Bảo và Lê Thi Xuân, 1998; Phan Thị Bảy va ctv, 1995; Bùi Bá Bồng, 1995).

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước

tiễn vượt bậc Cụ thé:

Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệnuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗnhư Paulownia, đó bầu, Neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống,tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh Nghiên cứu cải thiện 7 điều kiệnnuôi cấy in vitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dau, hoa lan,

cây cảnh Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô phôi

vô tính (soma), mô chồi sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng tạo điều kiện rất thuậnlợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tao sản pham có kha năng thương mại hóa Tạo

và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầu ghi nhận được sự hình thành rễ tơ(hairy root) sam Ngọc Linh nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện choviệc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằm thu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và ydược Tạo thành công mô sẹo/rễ bắt định hai cây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thấtnhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuất hợp chất thứ cấp Đã nhân giống thànhcông giống lan đặc hữu Việt Nam (Bích Diệp, 2014)

1.4.4 Nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bảo thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bao đãtách rời ra khỏi cơ thé thực vật trong môi trường thích hợp đề trở lại trạng thái chưaphân hóa có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triển thànhcây con mới Tat cả mọi tế bào của một cơ thé thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa làchứa bộ gen tương tự nhau, do đó tat cả các tế bào của một cơ thé đều có kha năng tổnghợp những loại protein hay enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi đưỡng trong môitrường thích hợp đều có thé phát triển thành cây nguyên ven đặc trưng cho loài và rahoa, kết quả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.4.4.1 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Van Ay (2019) nhân giống in vitro gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Chon cây mẹ dé lấy mẫu thường là cây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh

9

và có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chọn chi, đoạn thân, cóhoặc không có chồi ngủ, hoa non, lá non Mô được chọn dé nuôi cây mô là các mô cónăng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ồn định.

Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thé kéo đài từ 3 - 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (nuôi cấy khởi động)

Là giai đoạn khử trùng dua mẫu vào nuôi cấy in vitro Trong nuôi cấy mô, khửtrùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, tỷ lệ

sống cao, mẫu tồn tại và sinh trưởng tốt Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt, lọc,hóa chat và một số phương pháp khác dé khử trùng mẫu cây

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chéi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây bằng phương pháp nuôi cay

mô va tế bảo thực vật nhằm mục dich tăng sinh khối thê nhân giống Vật liệu nuôi cấy

là cá thé chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo chéi, đôi khi nồng độsinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấythích hợp giúp cho quá trình phát sinh chồi nhanh hơn

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ lá, thân, rễ dé chuẩn bị chuyên ra

vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để năng sức sống khi ra môi trường bên ngoài Các

chất có tác dụng tạo chéi bị loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ.Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là một bước làm thíchnghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự tạo rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, hàmlượng Auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền

Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Đề đưa cây từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởngtốt cần đảm bảo một số yêu cầu về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiềucao cây Cây con đã ra rễ được lay khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và đặt trong chậu nơi

có bóng râm, độ âm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu

thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ âmđộ.

1.4.4.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà

phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểm chính:

- Đưa ra sản phẩm nhanh hon

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao

- Sản phẩm cây giống đồng nhất

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen

- Nhân nhanh nhiều cây không kết hạt, hạt nảy mầm kém

- Tiết kiệm không gian

- Nâng cao chất lượng cây giống

- Sản xuất quanh năm

Bên cạnh đó phương pháp nhân giống in vitro còn có những bat lợi như sau:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phảitat cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bang vi nhân giống Nhiều cây trồng

có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thé nhân nhanh dé đáp ứng nhu cầu thươngmại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều van dé lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh

tế bao thực vat in vitro vẫn chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: Vĩ nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo

Do đó, giá thành sản phâm còn khá cao so với các phương pháp truyền thông như chiết,ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể saikhác với cây mẹ ban dau do hiện tượng biến di tế bao soma Kết qua là cây con khônggiữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhângiống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượngcác chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến di nay cần được lưu ý khắc phục nhằmdam bao sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

lãi

1.4.5 Một số chat điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là hợp chất hữu cơ có tác dụng điều tiếtquá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nếu sử dung ở nồng độ thấp còn néu sửdụng ở nồng độ cao có thể gây ức chế sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vậtbao gồm 2 nhóm chính sau:

Auxin

Auxin là một chất có nhân indole, có công thức hóa học là C¡oHsO¿N, Auxin tự

nhiên được tìm thấy ở nhiều thực vật là indole acetic acid (IAA) IAA có các dẫn xuất

là 1-Naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-Dichlorophenoxyaxetic acid (2,4D) NAA

được Went và Thimann phát hiện năm 1937 va là một Auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh

hơn auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chdi, lá đangphát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mầm

Ứng dụng:

- 2,4-D là một auxin mạnh, có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sựacid hóa vách tế bào, kích thích sự tăng trưởng tế bào, thúc đây sự hình thành mô sẹo

- Trong nuôi cay mô, Auxin (IBA va NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt

- NAA (Auxin tổng hợp ø-NAA 99%) là chất điều tiết sinh trưởng thực vật cótác dụng ở phố rộng, thúc day sự phân chia tế bao và hình thành rễ nhánh, rễ, lá, dung

để tăng nhanh tốc độ giâm trồng và được sử dụng rộng rãi trong việc nhân giống cây

nông nghiệp, lâm nghiệp.

Cytokinin

Năm 1956, Skoog va Miller tách ra từ 500g DNA (acid deoxyribo nucleic) của

tinh dich cá trích (Clupea) một chat kết tinh va có hoạt tính đối với mô tủy cây thuốc lá

và đặt tên là Kinetin Cytokinin là chất điều hòa tăng trưởng có tác dụng làm tăng sựphân chia tế bào Cytokinin thường gặp là Kinetin và Benzyl adenine (BA) Cytokininđược vận chuyên từ mô phân sinh đỉnh rễ (là nơi tổng hợp nhiều Cytokinin trong cây)

Do đó, Cytokinin có hàm lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976)

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cay m6 thuc vat: TDZ (Thidiazuron),

BA (Benzyl adenine), BAP (Benzyl-amino-purine), Kinetin (6 - furfuryl amino purine)

va Cytokinin tự nhiên trong nước dita được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chồi

in vitro.

+ Ngược lại sẽ tác dụng lên sự phân chia tế bào, phân hóa mô, phát sinh phôi.

1.4.6 Những yếu tố ảnh hưởng đến kĩ thuật nhân giống in vitro

Mẫu cấy

Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ còn tat cả các mô khác trong cơ thể thực

vật đều có thé dùng làm vật liệu cấy Tuy vậy, các mô đang phát triển mạnh như mô

phân sinh ngọn, thượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát sinh, thịt quả non, lá non, cuốnghoa, dé hoa, mô phân sinh đốt khi đặt vào môi trường chứa chat sinh trưởng thích hop

có khả năng nuôi cay dé tao mô sẹo hoặc tạo thành cây hoàn chỉnh

Phương pháp vô trùng

Mau có chứa ít hay nhiều vi khuẩn, nam tùy theo sự tiếp xúc của mẫu với môitrường Đề loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi mô nuôi cấy thì phương pháp thông dụng hiện nay

là dung các hóa chất có hoạt tính diệt khuan và nắm vi khuẩn

Kha năng tiêu diét nam, vi khuẩn của hóa chat vô trùng phụ thuộc vào nồng độ,thời gian xử lý và mức độ xâm nhập trên bề mặt nuôi cấy Đề tăng hiệu quả thì người ta

có thé ngâm mẫu vao ethanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lí với dung dich

diệt khuẩn Với các mẫu quá ban thì phải rửa kỹ bang nước xà phòng và phải dé dướivòi nước chảy từ 20 - 30 phút, sẽ có tác dụng làm giảm đáng kề hệ vi khuân khỏi mẫucấy

Tác nhân vô trùng ngoài diệt nam, vi khuẩn còn ảnh hưởng tới mô cấy Vì vậy,chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn va sự man cảm của mẫu (NgôXuân Bình, 2010).

Môi trường nuôi cấy

Thanh phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đối tùy theo loài, bộ phận vàmục đích nuôi cấy, vì vậy thành phần của môi trường là khác nhau Thành phần môitrường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cây và

mục dich nuôi cây như: duy tri mô ở trạng thái mô seo, tạo ré, tạo mâm hoặc tái sinh cây

13

hoàn chỉnh (Ngô Xuân Bình, 2010) Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độcác chất, nhưng tat cả các loại môi trường nuôi cây đều gồm có các thành phan sau: Cácloại muối khoáng nguồn cacbon, vitamin, các chất điều tiết sinh trưởng, các nhóm chất

bồ sung, chất độn

a) Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô - tế bào

thực vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm vi

lượng.

- Các nguyên tố đa lượng:

Nito (N): thường được sử dụng ở hai dạng nitrat (NO3°) hoặc muối amoni (NH4')riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO47

Photpho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất cao Chính

vì vậy photpho là một nguyên tố cần thiết của môi trojong và thường được đưa vào môi

trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photphat Ngoài ra khi photpho ở dạng H2PO4

va HPO4 còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trongquá trình nuôi cấy

- Các nguyên tố vi lượng: Ngoài các nguyên tố khoáng đa lượng, trong môitrường còn cần các nguyên t6 vi lương là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co

b) Nguồn cacbon

Hầu hết các mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có kha năng tổng hợp cacbon Vì

vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Trong

phan lớn các môi trường, nguồn cacbon va năng lượng chủ yếu là saccarosevà glucose

là nguồn cacbon tốt nhất Ở một số mô thì có thé dùng mantose, fructoseva galactose

c) Vitamin

Mặc dù tat cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cay in vitro có kha nan tự tổnghợp được hau hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng do đó phải bỗ sungthêm vào môi trường một số vitamin, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B như vitaminB1, B3, B5, Bó, axit nicotinic, mesoinosit.

d) Các nhóm chất chat bỗ sung

Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng nhiều dung dịchhữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như: nước dita, địch chiết nắm men nhằm

tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy có trường hợp người ta sử dụng cả than hoạt tính như một chấtphụ gia, kết quả nghiên cứu của Fridborg và ctv (1978) cho thấy than hoạt tính có tác

dụng hấp thụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao phan và làm tăng hiệu suất sinh phôi

(Fridborg và ctv, 1978).

e) Chất độn (thạch - agar)

Agar là thành phần quyết định trạng thái vat lí của môi trường Khi nồng độ của

agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng như hấp thụcủa mô gặp khó khăn Đa số nuôi cấy phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưngphụ thuộc vào loài cây mà sử dụng cho phù hop.

Điều kiện nuôi cấy

c) Giá tri pH của môi trường

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận cácdinh dưỡng từ môi trường vao tế bao Vì vậy, đối với mỗi loại môi trường nhất định vađối với từng trường hợp cụ thê của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường vớimức ồn định ban dau Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển

ở nhiều loài thực vật biến đồi từ 5,0 - 6,0 Khi pH thấp sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolose

dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự gia hóa của các tế bao trong mônuôi cây.

Is

1.4.7 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp

như sau:

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dé dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên Sau khi vôtrùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Sau một thời gian, từ đỉnh sinh

trưởng sẽ phát triển thành một hay nhiều chỗi Chỗi tiếp tục phát triển, vươn thân, ra lá,

rễ, đề trở thành một cây hoàn chỉnh

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tô chức Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khimôi trường có bổ sung auxin Trong điều kiện môi trường không có chat kích thích tạo

mô sẹo, khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nuôi cây mô sẹo đượcthực hiện đối với các loại thực vật không có khả năngnhân giống thông qua nuôi cấyđỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ, từ một cụm tế bảo

mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiênmức độ biến dị dang té bao soma lai cao hon

Nuôi cấy tế bao don

Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độđiều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn Sau đó, tế

bao đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp dé phát triển, tăng sinh khối

Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bảo đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôicấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bảo, tiếp tục phân chia và pháttriển thành cây hoàn chỉnh Khi tế bao mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiệngiống cây trồng

Nuôi cấy hạt phan đơn bội

Hạt phan ở thực vat được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo.

Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây dâu tây ở Việt Nam và trên thế giới1.5.1 Trên thế giới

Sakila và ctv (2007) sử dụng đoạn đốt thân của dâu tây đề tiến hành nhân giống.Kết quả cho thấy, khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khácnhau với Kinetin hoặc GA3 Phản ứng nhân chỗi cao nhất đạt được trên môi trường MS

có bổ sung 1,5 mg/L BA + 0,5 - 0,1 mg/L Kinetin Các chéi con tái sinh ra rễ trên môitrường cơ sở MS với các nồng độ IBA và IAA khác nhau Tan suất ra rễ tối đa và sốlượng rễ cao nhất được tạo ra trên môi trường chứa 1,0 mg/L IBA

Nghiên cứu của Karim và ctv (2011) sử dụng mẫu lá cây dâu tây 2 tuần tuổi để

làm thí nghiệm Các mẫu được ủ trong điều kiện tối 15 ngày sau khi cấy dé tạo mô sẹo.Sau đó được duy trì ở 25°C + 2°C (nhiệt độ phòng) dưới ánh đèn huỳnh quang trang mát

trong 16 giờ/ngày ở cường độ 2000-3000 lux Môi trường MS (Murashige và Skoog) bổsung axit 2,4-diclorophenoxyacetic (3,0 mg/L) và 6-Benzyl adenine (0,5 mg/L) đượccho là có hiệu qua nhất về tỷ lệ phần trăm tạo mô sẹo và mức độ phát triển mô sẹo Sựkết hợp của BA (1,5 mg/L) và NAA (0,75 mg/L) cho thấy tỷ lệ cảm ứng chồi cao nhất(55,6%) và tái sinh nhiều chéi Sự kết hợp của BA, NAA va KIN (6-Furfuryl aminopurine/kinetin) được cho là hiệu qua nhất trong việc tạo chồi (60,7%) và nhân chồi (16,7chéi) Sau khi tái sinh chéi thành công, các chồi tái sinh được nuôi cấy dé tạo rễ trongMS.

Nghiên cứu của Ara và ctv (2012) sử dụng mẫu lá dâu tây làm thí nghiệm Mẫu

lá được khử trùng và cấy vào môi trường nuôi cấy sau đó ủ trong môi trường tối trong

45 ngày dé tao mô sẹo Môi trường MS bồ sung 1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L 6-BA chothấy tỷ lệ tạo mô sẹo tốt nhất Quá trình nhân chéi nuôi cay ở điều kiện 16 giờ sáng/§giờ tối nhiệt độ 25°C + 2°C Số lượng chồi cao nhất thu được ở môi trường MS bồ sung

2 mg/L 6-BA + 0,5 mg/L NAA.

Danial va ctv (2016) sử dung phan ngó trên cây dâu tây dé làm thi nghiệm chobiết rằng sự kết hop 2,0 mg/L BA với 0,25 mg/L IBA có thé tạo ra số chồi/mẫu tối đa(6,375 chồi) với chiều dai chéi cao (0,675 cm) và số lá/mẫu (19,0 1a) Các chồi tăng sinhđược xử lý trên môi trường MS bổ sung 0,75 mg/L IAA dé đạt được tỷ lệ ra rễ tối ưu

17

Suvalaxmi Palei và ctv (2017) sử dụng lá non, lá trưởng thành và ngó để làm thínghiệm, bé sung các nồng độ và sự kết hợp khác nhau của BAP, NAA và 2, 4-D dé tạo

mô sẹo và nuôi cấy trong bóng tối khoảng 30 ngày để tạo mô sẹo Cảm ứng tạo mô sẹocao nhất (90%) được ghi nhận trong môi trường bé sung 1,0 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/LBAP BA 2,5mg/L và NAA 0,5mg/L với môi trường MS cơ bản cho thấy phản ứng tối

đa đối với sự tái sinh thông qua mô sẹo tao ra trung bình 5,1 chdi Tỷ lệ ra rễ tối đa được

quan sát thấy trong môi trường 1⁄2 MS được bồ sung 0,25 mg/L IBA va 2% sucrose.

Prakarn Chomboon và ctv (2022) sử dụng mẫu lá dâu tây đã tạo thành công mô

seo trong môi trường MS bán rắn bổ sung 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA trong vòng 2

tuần dưới ánh sáng 2000 lux 16 giờ/ngày nhiệt độ 25+2°C Môi trường MS bán rắn bổ

sung 1 mg/L TDZ và 0,2 mg/L 2,4-D tạo ra 3,8 microshoot trên mỗi mô sẹo trong vòng

49-56 ngày Các mô sẹo có nguồn góc từ lá với các chéi bat định này được nuôi cấy với0,1 mg/L GA3 và lắc ở tốc độ 120 vòng/phút Số lượng chồi tăng từ 15,3 chồi lên 43,6chổi trên mỗi lần nuôi cấy (100 ml) trong vòng 2 tuần, nhưng tat cả đều là cụm chéi.Cụm chồi tái sinh thành chồi bình thường trong vòng 1 tháng khi nuôi cấy trên môitrường MS bán ran với 8 g/l agar Chỗi hình thành rễ trên môi trường MS bán rắn bổsung 0,5 mg/L IBA trong vòng 2 tuần

1.5.2 Ở Việt Nam

Lã Văn Hiền và ctv (2017) đã sử dụng lá dâu tây được nuôi nảy mầm trên môitrường MS trong 6 tuần dùng làm vật liệu để cảm ứng mô sẹo với 20 ngày sáng, 10 ngàytối trên môi trường MS bồ sung 0,2 mg/L (2,4-D) và 1,0 mg/L (TDZ) Sau 3 - 4 tuần môsẹo xuất hiện với tỷ lệ 85,3% Mô seo tái sinh và nhân nhanh trên môi trường MS bổsung BA 0,2 mg/L và TDZ 1,0 mg/L Khả năng hình thành chồi tốt 91,7% và 60,6% ởnồng độ BA 0,2 mg/L kết hợp TDZ 1,0 mg/L va Kinetin 0,2 mg/L kết hợp TDZ 1,0mg/L Hệ số nhân chỗi thu được 10,2 chồi và 4,38 chéi ở hai công thức trên Dâu tây có

khả năng ra rễ cao trên môi trường MS có IBA 0,5 mg/L, tỷ lệ ra rễ trung bình đạt 92,8%,

trung bình 3 - 5 rễ/cây, chiều dài rễ dao động 0,8 - 3,2 em Kết quả cho thấy nhân giốngdâu tây thông qua mô sẹo có khả năng tái sinh và hệ số nhân giống cao

Trần Thị Ngọc Lan (2018) đã nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tâyNhật “Penihuble” bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đạt tỷ lệ sống 93,33%,hình thành mô sẹo 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bồ sung

0,2 mg/L NAA, 0,5 mg/L BA, chu kì chiếu sáng 16 giờ sang/8 giờ tối cường độ ánhsáng 2000 lux Mô sẹo được tiếp tục nhân lên đạt tỷ lệ tăng trưởng 8,56 lần, hình thànhphôi sinh dưỡng (15,78 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 30 g/1 sucrose, 7 g/lagar, 0,5 mg/L BA Môi trường 1⁄2 MS là phù hợp cho phôi sinh dưỡng phát triển thànhcây với tỷ lệ 100% mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc lên khả năng cảm ứng mô sẹo và tái sinh

chéi từ mẫu lá cây dâu tây (Fragaria x ananassa) nuôi cây in vitro của Dương Tan Nhựt

và ctv (2018) đã khử trùng các mẫu lá trong nano bạc ở nồng độ, thời gian khác nhau.Tất cả các mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung | mg/L TDZ, 0,1 mg/L

IBA, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày Nghiệm thức cho

ty lệ nhiễm thấp nhất (22,2%) khi được khử trùng ở nồng độ 0,5 g/L nano bạc trong 20phút Tỷ lệ tái sinh chéi (64,4%), số chồi/mẫu (21 chỗi) và số chéi cao trên 1,5 cm (6,66chồi) cao nhất ở nồng độ 0,2 g/L nano bạc trong 20 phút Các chổi này được tiếp tụcnuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,02 mg/L NAA cho chiều cao cây (6,75 cm),chiều đài rễ (5,13 cm), khối lượng tươi (0,71 g) cao nhất ở nghiệm thức bé sung 1 mg/Lnano bạc; số rễ nhiều nhất (6,33 rễ) ở nghiệm thức bổ sung 2 mg/L nano bạc; khối lượngkhô (80,61 mg) và giá trị SPAD (34,49) đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 1 mg/Lnano bạc.

Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Trường và ctv (2021) cho thấy môi trường MS có

bổ sung 0,75 mg/L BA kết hợp 0,3 mg/L IBA cho hệ số nhân chồi cao nhất (23,1chồi/mẫu) với chat lượng tốt Môi trường 1⁄2 MS kết hợp với 0,3 mg/L NAA là tốt nhấtcho chỗi ra rễ (18,6 rễ/chồi) trên giống dâu tây “Sunraku” nhập nội từ Nhật Bản

19

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: tháng 5/2023 đến tháng 10/2023

- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di truyền - Giống, Trại

thực nghiệm Khoa Nông Học, Trường Dai Học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1 Giống

- Mẫu cây Dau tay (Fragaria x ananassa Duch.) giỗng Hana chịu nhiệt đượccung cap từ Trung tâm nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa tại TP Đà Lạt, tynh LamĐồng

- Vật liệu được sử dụng nghiên cứu là cây Dâu tây có lá màu xanh, rõ gân lá, sạchnam, khuẩn được cấy chuyên từ bịch nilon chứa mẫu chồi sang chai thủy tinh chứa môitrường MS bồ sung 30 g/L đường saccarose, 8 g/L agar

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị: Cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, máy chưngcất nước, buồng cây vô trùng, tủ sấy, máy khuấy gia từ nhiệt

Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, chai thủy tinh (loại 100 ml,

500 ml), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, pen cấy,kéo.

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro các thí nghiệm

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối

Nhiệt độ: 25 + 2°C

Độ ẩm: 50 - 60 %

Cường độ ánh sáng: 2000 lux

2.2.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường dinh dưỡng khoáng MS cải tiến theo nghiên

cứu của Murashige va Skoog (1962), có bổ sung các chat điều tiết sinh trưởng theo bang

sau:

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm

Thành phần Nông độ (mg/L)Khoáng đa lượng NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2.2H20 440 MgSOu.7HaO 370

KH:PO¿ 170

Khoáng vi lượng MnSOx.4H2O 23.3

ZnSO4.7H20 8,6 H3PO3 6,2

KI 0,83 Na2Mo04.2H20 0,25 CuSO4.5H20 0,025 CoCl2.6H20 0,025Sat EDTA Naz.EDTA 37.3

FeSO4.7H20 27,8

Vitamin Myo-Inositol 100

Thiamin (Bì) 0,5

Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine (Be) 0,5 Glycine 5

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng:

- 2,4-D độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada)

- BA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada)

- IBA độ tinh khiết > 98% (hãng BioBasic - Canada)

- NAA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada)

BÀI

Các thành phần khác:

- Đường saccarose: 30 g/l

- Agar: 8 g/l

Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 + 0,05 (bằng NaOH 1N va HCl 1N)

trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng 6 121°C, 1 atm trong 15 phút

2.3 Bồ trí thí nghiệm

2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ 2.4-D và thời gian chiếu sáng trong tạo môsẹo cây Dâu tây.

Vật liệu: chồi cao 3 - 4 em được cấy chuyền qua chai thủy tinh

Mẫu cấy: lá được cắt thành hình vuông có kích thước 1,0 cm x 1,0 em

Môi trường nền: Môi trường được sử dụng là môi trường MS có bồ sung 8g/1

agar, 30g/1 đường saccarose

Mục tiêu: Xác định được nồng độ 2,4-D và thời gian chiếu sáng thích hợp

Hình 2.1 Mẫu lá dâu tây sau khi cắt

Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm hai yếu tố gồm 8 nghiệm thức được bé trí theo kiểu hoan toản ngẫunhiên (Completely Randomized Degign), ba lần lặp lại, trong đó:

Yếu tô D (nồng độ 2.4-D): 1 mg/L (D1); 1,5 mg/L (D2); 2 mg/L (D3); 2,5 mg/L (D4)Yếu tố T (thời gian chiếu sáng): tối hoàn toàn (T1), 16 giờ sáng/ 8 giờ tối (T2)

TIDI | TID2| 12D3 | T2DI| 12D4| T2D2| T1D2[ T1D4

TID4[ T2DI| TID3 | TIDI[ TID4| T2D4|[ T1D3 | T2D2

TI1D3 | T2D3 | 12D2| T2D3| TI1D2| T2DI | TIDI| T2D4

Hình 2.2 So đồ bé trí thí nghiệm 1Cách thực hiện:

Chai chứa mẫu cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưavào trong tủ cấy vô trùng

Trong tủ cấy vô trùng:

Bước 1: Dùng pence gắp cây ra khỏi chai mẫuBước 2: Dùng dao cấy cắt lá khỏi cuống lá

Bước 3: Dùng dao cấy cắt lá thành mảnh nhỏ có kích thước 1,0 em x 1,0 emBước 4: Đặt mẫu lá đã cắt vào chai thủy tinh 100 ml chứa 10 ml môi trườngnên bé sung các nồng độ 2,4-D, mỗi chai chứa 1 mẫu

Quy mô thí nghiệm

Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:

Theo dõi các chỉ tiêu trong 7 tuần, số liệu ghi nhận 7 ngày/lần:

- Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Số mẫu chết/ tổng số mẫu đưa vào) x 100

(*) Mẫu chết: là mẫu lá, mẫu lá đã tạo mô sẹo có dấu hiệu hoại tử màu đen

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = (Số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu đưa vào) x 100

- Ngày cảm ứng mô sẹo (ngày): ngày có mô sẹo đầu tiên hình thành ngày từ lúc

vào mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi ở 49 NSC:

- Trọng lượng mô sẹo (g): cân trọng lượng mô seo bằng cân điện tử chính xácđến 2 số lẻ, cân 10 mẫu/NT

- Quan sát, mô tả hình thái, màu sắc của mô sẹo

2.3.2 Thí nghiệm 2: Anh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâutây

Vật liệu: chỗi cây dâu tây có chiều cao trung bình 2 - 3 cm, còn sống va không

bị nhiễm nắm, khuẩn đã được chuẩn bị trước từ TN1

Mẫu cấy: đoạn chồi được làm sạch, cắt bỏ toàn bộ lá, chiều dai 1,0 - 1,5 emMôi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bồ sung 8g/1

agar, 30g/1 đường saccarose

Mục tiêu: xác định được nồng độ BA, IBA thích hợp cho quá trình nhân nhanh

chồi của mẫu cây dâu tây

Hình 2.3 Mau chỏi dâu tây da xử lý

mgiL) II I2 l3

BI BII BII2 BI

B2 B2II B2I2 B2I3

B3 B3II B3I2 B33

B3I2 | BIII | B3II | B2II | BII2 | Bill | B2I2 | BII3 | B313

B3II | B2I3 | B113 | B2I2 | BI | B2I3 | B2II | B3I2 | B313

B33 | B2I2 | B112 | Bill | B2II | B213 | B3II | B112 | B312

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2

Cách thực hiện:

Chai chứa chéi cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưavào trong tủ cấy vô trùng

Trong tủ cấy vô trùng:

Bước 1: Dùng pence cấy gap cụm chồi ra khỏi chaiBước 2: Dùng pence và dao cấy dé tách cụm chồi thành những chéi đơn

Bước 3: Dùng dao cấy dé làm sạch chỗi sau đó cắt thành đoạn dai 1,0 emđến 1,5 cm va cắm mẫu vào chai thủy tinh 500 ml chứa 50 ml môi trường nền bổ sungcác nồng độ BA và IBA Mỗi chai cay 2 mẫu

25

Quy mô thí nghiệm

Chỉ tiêu và phương pháp theo đõi:

Theo dõi các chỉ tiêu về chồi sau khi nuôi cấy, 7 ngày/lần, theo dõi trong 6 tuần,

10 mau/NT, các chỉ tiêu:

- Chiều cao chỗi (cm): đo ở ngoài chai từ mặt thạch đến điểm cao nhất của chồibằng thước đo mẫu

- Hệ số nhân chéi = Tổng số chéi tạo thanh/Téng số chồi đưa vào

(*) Chéi phát triển từ mẫu cấy vào môi trường và có thể nhìn thay bang mắt thường quachai cấy cao từ 0,5 em

- Số 1a/chdi (14): Tổng số lá/Tổng số chồi khảo sát

- Trọng lượng chồi tươi (g): dùng cân điện tử chính xác 2 số lẻ, cân 10 mẫư/NT,

được ghi nhận ở 42 NSC

2.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây Dâu tây

Vật liệu: Chồi cao 3 - 4 cm, có 3 - 4 lá được lấy từ TN1, TN2

Môi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bổ sung 8g/1

agar, 30g/1 đường saccarose

Mục tiêu: xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của mẫu

cây dâu tây

Hình 2.5 Chồi cây dâu tây từ cụm chồi thí nghiệm 2

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm một yếu tố gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoan toàn ngẫunhiên, ba lần lặp lại, trong đó:

Nồng độ NAA: 0 mg/L; 0,1 mg/L; 0,3 mg/L; 0,5 mg/L; 0,7 mg/L

Bang 2.4 Các nghiệm thức thi nghiệm 3

Nghiệm thức Nông độ NAA (mg/L)NTI 0,0 (BC) NT2 0,1

NT3 0,3 NT4 0,5 NTS 0,7

2]

NT3 NHI NT3 NT2 NT5 NT5 NT2 NT3 NT2 NT4 NT1 NT4 NTI NT5 NT4

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3Cách thực hiện:

Chai chứa chéi cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưavao trong tu cay vô trùng

Trong tủ cấy vô trùng:

Bước 1: Dùng pence cấy gap cụm chỗi ra khỏi chai

Bước 2: Dùng pence va dao cấy dé tách cụm chỗi thành những chéi đơn sau đócấy vào chai thủy tinh chứa môi trường nền có bồ sung các nồng độ NAA

Quy mô thí nghiệm

Chi tiêu và phương pháp theo dõi:

Theo dõi các chỉ tiêu về cây sau khi nuôi cấy, 7 ngày/lần, theo dõi trong 3 tuần:

- Tỷ lệ ra rễ (%) = (Tổng số mẫu ra rễ/Tổng số mẫu cấy) x 100

Theo dõi 10 mau/NT với các chỉ tiêu:

- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt thạch đến dém cao nhất của cây bằng thước đo

- Số lá/cây: Đếm số lá/cây theo dõi

- Số rễ tạo thành/cây = Đếm số rễ/cây theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi ở 21 NSC, 10 mau/NT:

- Đường kính cô rễ (mm): đo ở cô rễ bằng thước kẹp

- Chiều đài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ của rễ đài nhất

Chỉ tiêu theo đối ở 21 NSC, đo 1 lá/mẫu, 10 mau/NT:

- Chiều dai lá (cm): đo từ cuống lá theo chiều dọc của lá

- Chiều rộng lá (cm): đo chiều ngang rộng nhất của lá

(*) Rễ phát triển từ phần cây vào môi trường mà mắt thường có thé thay được

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập, tổng hợp tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel, phântích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phan hạng Duncan bằng phần mềm R 4.2.3

29

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Anh hưởng của nồng độ 2,4-D và thời gian chiếu sáng trong tạo mô seo từ mẫu

lá cay Dau tay

Mô seo là một cụm tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia mạnh, thườngđược tạo ra bởi các thay đổi trong quá trình tạo cơ quan thực vật (Bùi Trang Việt, 2000).Khi thân, lá, rễ có vết thương mô sẹo được hình thành ở tại vết thương Các cơ quankhác nhau của một cơ thé thực vật có khả năng tạo mô sẹo (Ochatt và ctv, 1986) Nuôicấy trong môi trường không có ánh sáng giúp giảm hiện tượng hóa nâu của mô bằngcách ức chế hoạt động của enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình oxy hóa mô (Titov

và ctv, 2006) Do đó, trong thí nghiệm ngày, việc kết hợp thời gian chiếu sáng và 2,4-Dvới nồng độ khác nhau nhằm khảo sát ty lệ tao mô sẹo, tỷ lệ chết mẫu cấy, thời điểmxuất hiện, trọng lượng và hình thái mô sẹo

Sau 14 ngày, các mẫu lá có hiện tượng uốn cong mặc dù chưa xuất hiện mô sẹo

do cảm ứng với môi trường nuôi cấy

Sau 28 ngày nuôi cấy, tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các nghiệm thức khác nhau

có sự khác biệt rat có ý nghĩa thong kê Mẫu lá đặt trong điều kiện tối có ty lệ hình thành

mô sẹo cao nhất (30%), khác biệt rất có ý nghĩa so với khi chiếu sáng 16 giờ/ngày (4%).Khi bổ sung vào môi trường với các nồng độ 2,4-D khác nhau cho tỷ lệ tạo mô seo làkhác nhau và có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê Trong đó nồng độ 2,0 mg/Lđạt ty lệ tạo mô sẹo cao nhất (20,0%), không khác biệt với nồng độ 1,5 mg/L, khác biệtrất có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại Sự tương tác giữa hai yếu tố có kết quả caonhất (36,0%) khi mẫu lá được đặt trong điều kiện tối có bổ sung 2,0 mg/L 2,4-D, khôngkhác biệt với khi bổ sung 1,5 mg/L va 2,5 mg/L trong cùng điều kiện chiếu sáng, khácbiệt có ý nghĩa với các sự kết hợp còn lại