2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: tháng 5/2023 đến tháng 10/2023
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di truyền - Giống, Trại thực nghiệm Khoa Nông Học, Trường Dai Học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
2.2 Vật liệu thí nghiệm
2.2.1 Giống
- Mẫu cây Dau tay (Fragaria x ananassa Duch.) giỗng Hana chịu nhiệt được cung cap từ Trung tâm nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa tại TP. Đà Lạt, tynh Lam Đồng.
- Vật liệu được sử dụng nghiên cứu là cây Dâu tây có lá màu xanh, rõ gân lá, sạch
nam, khuẩn được cấy chuyên từ bịch nilon chứa mẫu chồi sang chai thủy tinh chứa môi trường MS bồ sung 30 g/L đường saccarose, 8 g/L agar.
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị: Cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, máy chưng cất nước, buồng cây vô trùng, tủ sấy, máy khuấy gia từ nhiệt.
Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, chai thủy tinh (loại 100 ml, 500 ml), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, pen cấy,
kéo.
2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro các thí nghiệm Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối
Nhiệt độ: 25 + 2°C
Độ ẩm: 50 - 60 %
Cường độ ánh sáng: 2000 lux
2.2.4 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường dinh dưỡng khoáng MS cải tiến theo nghiên cứu của Murashige va Skoog (1962), có bổ sung các chat điều tiết sinh trưởng theo bang
sau:
Bảng 2.1 Thành phần các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
Thành phần Nông độ (mg/L)
Khoáng đa lượng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H20 440 MgSOu.7HaO 370
KH:PO¿ 170
Khoáng vi lượng MnSOx.4H2O 23.3 ZnSO4.7H20 8,6
H3PO3 6,2 KI 0,83 Na2Mo04.2H20 0,25 CuSO4.5H20 0,025
CoCl2.6H20 0,025
Sat EDTA Naz.EDTA 37.3
FeSO4.7H20 27,8 Vitamin Myo-Inositol 100
Thiamin (Bì) 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine (Be) 0,5 Glycine 5
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng:
- 2,4-D độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada) - BA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada) - IBA độ tinh khiết > 98% (hãng BioBasic - Canada) - NAA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic - Canada)
BÀI
Các thành phần khác:
- Đường saccarose: 30 g/l - Agar: 8 g/l
Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 + 0,05 (bằng NaOH 1N va HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng 6 121°C, 1 atm trong 15 phút.
2.3 Bồ trí thí nghiệm
2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ 2.4-D và thời gian chiếu sáng trong tạo mô
sẹo cây Dâu tây.
Vật liệu: chồi cao 3 - 4 em được cấy chuyền qua chai thủy tinh
Mẫu cấy: lá được cắt thành hình vuông có kích thước 1,0 cm x 1,0 em
Môi trường nền: Môi trường được sử dụng là môi trường MS có bồ sung 8g/1
agar, 30g/1 đường saccarose
Mục tiêu: Xác định được nồng độ 2,4-D và thời gian chiếu sáng thích hợp
Hình 2.1 Mẫu lá dâu tây sau khi cắt Bồ trí thí nghiệm
Thí nghiệm hai yếu tố gồm 8 nghiệm thức được bé trí theo kiểu hoan toản ngẫu nhiên (Completely Randomized Degign), ba lần lặp lại, trong đó:
Yếu tô D (nồng độ 2.4-D): 1 mg/L (D1); 1,5 mg/L (D2); 2 mg/L (D3); 2,5 mg/L (D4) Yếu tố T (thời gian chiếu sáng): tối hoàn toàn (T1), 16 giờ sáng/ 8 giờ tối (T2)
Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm 1
Nong độ 2.4-D (mg/L)
Thời gian
tiie DI D2 D3 D4
dại TIDI TID2 T1D3 TID4
T2 T2DI T2D2 T2D3 T2D4
TIDI | TID2| 12D3 | T2DI| 12D4| T2D2| T1D2[ T1D4 TID4[ T2DI| TID3 | TIDI[ TID4| T2D4|[ T1D3 | T2D2
TI1D3 | T2D3 | 12D2| T2D3| TI1D2| T2DI | TIDI| T2D4
Hình 2.2 So đồ bé trí thí nghiệm 1
Cách thực hiện:
Chai chứa mẫu cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưa vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
Bước 1: Dùng pence gắp cây ra khỏi chai mẫu Bước 2: Dùng dao cấy cắt lá khỏi cuống lá
Bước 3: Dùng dao cấy cắt lá thành mảnh nhỏ có kích thước 1,0 em x 1,0 em Bước 4: Đặt mẫu lá đã cắt vào chai thủy tinh 100 ml chứa 10 ml môi trường nên bé sung các nồng độ 2,4-D, mỗi chai chứa 1 mẫu.
Quy mô thí nghiệm
- Tổng số nghiệm thức: 8 - Số LLL: 3
- Số ô cơ sở: 24 - Số chai/ô cơ sở: 25 - Số mau/chai: 1
- Tổng sé chai: 25 x 8 x 3 = 600 (chai) - Téng s6 mau: 1 x 25 x 8 x 3 = 600 (mau)
23
Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:
Theo dõi các chỉ tiêu trong 7 tuần, số liệu ghi nhận 7 ngày/lần:
- Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Số mẫu chết/ tổng số mẫu đưa vào) x 100
(*) Mẫu chết: là mẫu lá, mẫu lá đã tạo mô sẹo có dấu hiệu hoại tử màu đen - Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = (Số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu đưa vào) x 100 - Ngày cảm ứng mô sẹo (ngày): ngày có mô sẹo đầu tiên hình thành ngày từ lúc vào mẫu
Các chỉ tiêu theo dõi ở 49 NSC:
- Trọng lượng mô sẹo (g): cân trọng lượng mô seo bằng cân điện tử chính xác đến 2 số lẻ, cân 10 mẫu/NT
- Quan sát, mô tả hình thái, màu sắc của mô sẹo
2.3.2 Thí nghiệm 2: Anh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu
tây
Vật liệu: chỗi cây dâu tây có chiều cao trung bình 2 - 3 cm, còn sống va không bị nhiễm nắm, khuẩn đã được chuẩn bị trước từ TN1
Mẫu cấy: đoạn chồi được làm sạch, cắt bỏ toàn bộ lá, chiều dai 1,0 - 1,5 em Môi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bồ sung 8g/1
agar, 30g/1 đường saccarose
Mục tiêu: xác định được nồng độ BA, IBA thích hợp cho quá trình nhân nhanh
chồi của mẫu cây dâu tây
Hình 2.3 Mau chỏi dâu tây da xử lý
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm hai yếu tổ gồm 9 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Degign), ba lần lặp lại, trong đó:
Yếu tố B (nồng độ BA): 0,5 mg/L (B1); 0,75 mg/L (B2); 1 mg/L (B3).
Yếu tổ I (nồng độ IBA): 0,1 mg/L (11); 0,3 mg/L (12); 0,5 mg/L (13).
Bảng 2.3 Các nghiệm thức thi nghiệm 2
; Nong độ IBA (mg/L)
Nông độ BA
mgiL) II I2 l3
BI BII BII2 BI
B2 B2II B2I2 B2I3
B3 B3II B3I2 B33
B3I2 | BIII | B3II | B2II | BII2 | Bill | B2I2 | BII3 | B313 B3II | B2I3 | B113 | B2I2 | BI | B2I3 | B2II | B3I2 | B313
B33 | B2I2 | B112 | Bill | B2II | B213 | B3II | B112 | B312
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Cách thực hiện:
Chai chứa chéi cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưa vào trong tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng:
Bước 1: Dùng pence cấy gap cụm chồi ra khỏi chai
Bước 2: Dùng pence và dao cấy dé tách cụm chồi thành những chéi đơn Bước 3: Dùng dao cấy dé làm sạch chỗi sau đó cắt thành đoạn dai 1,0 em đến 1,5 cm va cắm mẫu vào chai thủy tinh 500 ml chứa 50 ml môi trường nền bổ sung các nồng độ BA và IBA. Mỗi chai cay 2 mẫu.
25
Quy mô thí nghiệm
Tổng số nghiệm thức: 9 Số LLL: 3
Số ô cơ sở: 27 Số chai/ô cơ sở: 13 Số mẫu/chai: 2
Tổng số chai: 13 x 9 x 3 = 351 (chai) Tổng số mẫu: 2 x 13 x 9 x 3 = 702 (mẫu)
Chỉ tiêu và phương pháp theo đõi:
Theo dõi các chỉ tiêu về chồi sau khi nuôi cấy, 7 ngày/lần, theo dõi trong 6 tuần, 10 mau/NT, các chỉ tiêu:
- Chiều cao chỗi (cm): đo ở ngoài chai từ mặt thạch đến điểm cao nhất của chồi bằng thước đo mẫu
- Hệ số nhân chéi = Tổng số chéi tạo thanh/Téng số chồi đưa vào
(*) Chéi phát triển từ mẫu cấy vào môi trường và có thể nhìn thay bang mắt thường qua chai cấy cao từ 0,5 em.
- Số 1a/chdi (14): Tổng số lá/Tổng số chồi khảo sát
- Trọng lượng chồi tươi (g): dùng cân điện tử chính xác 2 số lẻ, cân 10 mẫư/NT,
được ghi nhận ở 42 NSC
2.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây Dâu tây Vật liệu: Chồi cao 3 - 4 cm, có 3 - 4 lá được lấy từ TN1, TN2
Môi trường nền: môi trường được sử dụng là môi trường MS được bổ sung 8g/1
agar, 30g/1 đường saccarose
Mục tiêu: xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của mẫu
cây dâu tây
Hình 2.5 Chồi cây dâu tây từ cụm chồi thí nghiệm 2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoan toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, trong đó:
Nồng độ NAA: 0 mg/L; 0,1 mg/L; 0,3 mg/L; 0,5 mg/L; 0,7 mg/L.
Bang 2.4 Các nghiệm thức thi nghiệm 3
Nghiệm thức Nông độ NAA (mg/L)
NTI 0,0 (BC) NT2 0,1
NT3 0,3 NT4 0,5 NTS 0,7
2]
NT3 NHI NT3 NT2 NT5 NT5 NT2 NT3 NT2 NT4 NT1 NT4 NTI NT5 NT4
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Cách thực hiện:
Chai chứa chéi cây Dâu tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trước khi đưa vao trong tu cay vô trùng
Trong tủ cấy vô trùng:
Bước 1: Dùng pence cấy gap cụm chỗi ra khỏi chai
Bước 2: Dùng pence va dao cấy dé tách cụm chỗi thành những chéi đơn sau đó cấy vào chai thủy tinh chứa môi trường nền có bồ sung các nồng độ NAA.
Quy mô thí nghiệm
- Tổng số nghiệm thức: 5 - Số LLL: 3
- Số ô cơ sở: 15 - Số chai/ô cơ sở: l5 - Số mẫu/chai: 2
- Tổng số chai: 15 x 5 x 3 = 225 (chai) - Téng số mẫu: 2 x 15 x 5x 3 = 450 (mau)
Chi tiêu và phương pháp theo dõi:
Theo dõi các chỉ tiêu về cây sau khi nuôi cấy, 7 ngày/lần, theo dõi trong 3 tuần:
- Tỷ lệ ra rễ (%) = (Tổng số mẫu ra rễ/Tổng số mẫu cấy) x 100 Theo dõi 10 mau/NT với các chỉ tiêu:
- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt thạch đến dém cao nhất của cây bằng thước đo
- Số lá/cây: Đếm số lá/cây theo dõi
- Số rễ tạo thành/cây = Đếm số rễ/cây theo dõi
Chỉ tiêu theo dõi ở 21 NSC, 10 mau/NT:
- Đường kính cô rễ (mm): đo ở cô rễ bằng thước kẹp - Chiều đài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ của rễ đài nhất Chỉ tiêu theo đối ở 21 NSC, đo 1 lá/mẫu, 10 mau/NT:
- Chiều dai lá (cm): đo từ cuống lá theo chiều dọc của lá - Chiều rộng lá (cm): đo chiều ngang rộng nhất của lá
(*) Rễ phát triển từ phần cây vào môi trường mà mắt thường có thé thay được 2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thu thập, tổng hợp tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel, phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phan hạng Duncan bằng phần mềm R 4.2.3
29
Chương 3