Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ và tỷ lệ ánh sáng led đỏ, xanh dương đến sinh trưởng, khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chồi ba kích (Morinda officinalis) in vitro

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ và tỷ lệ ánh sángLED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng, khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chồi Bakích Morinda officinal

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 3k 3k 3k 3k 2k sk

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA NÒNG ĐỘ IBA DEN SỰ TẠO RE VÀ TỶ

LE ANH SÁNG LED ĐỎ, XANH DUONG DEN SINH

TRUONG, KHA NANG TAO THANH CAY HOÀN CHỈNH CUA CHOI BA KÍCH(Morinda officinalis) IN VITRO

SINH VIÊN THUC HIEN : VO VAN QUÍNGANH : NONG HOCKHOA : 2018 - 2022

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 2/2023

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ IBA DEN SU TẠO RE VÀ TỶ

LE ANH SANG LED DO, XANH DUONG DEN SINH

TRUONG, KHA NANG TAO THANH CAY HOÀN CHỈNH CUA CHOI BA KÍCH(Morinda officinalis) IN VITRO

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 2/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường đại học Nông lâmthành phố Hồ Chí Minh, toàn thể quý Thầy Cô của khoa Nông học đã tạo điều kiệnthuận lợi, tận tình chỉ bảo, truyền đạt các kiến thức quý báu cho em trong những năm

học qua.

Em xin chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo của Viện Sinh họcNhiệt đới, thầy Trần Trọng Tuấn cùng các chị Trang, Trâm, Hằng, Thúy của phòngCông Nghệ Tế Bào Thực Vật đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trongsuốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Tuyết Nhung Tường đã hướng dan, giúp

đỡ, góp ý cho em đề em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp của mình hơn

Em xin cảm ơn cô van học tập thay Nguyễn Văn Phu và tập thé lớp DH1ISNHA

đã giúp đỡ em/tôi rất nhiều trong suốt 4 năm học đại học Tôi cũng xin gửi lời cảm on

đến các bạn Anh Huy, Hồng Gam, Thiện Nhu đã luôn giúp đỡ và đồng hành cùng tôi

trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Lời cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ và tất cả mọi người thân tronggia đình đã luôn yêu thương, động viên và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho con

Thành phó Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2023

Sinh viên thực hiện

il

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ và tỷ lệ ánh sángLED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng, khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chồi Bakích (Morinda officinalis) in vitro” đã được tiễn hành tại Phòng Công Nghệ Tế BaoThực Vật — Viện Sinh học Nhiệt đới từ tháng 8/2022 đến tháng 12/2022 Mục tiêu củanghiên cứu là xác định được nồng độ IBA và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương thíchhợp cho chéi Ba kích in vitro tạo rễ mạnh, sinh trưởng và khả năng tạo thành cây hoàn

chỉnh tôt, tỷ lệ sông cao khi đem ra ngoài vườn ươm.

Hai thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố (RCD) với

3 lần lặp lại Thí nghiệm khảo sát nồng độ IBA có 5 nghiệm thức gồm 4 nồng độ: 0,25mg/L; 0,50 mg/L; 0,75 mg/L; 1,00 mg/L và 1 nghiệm thức đối chứng không bé sungIBA Thi nghiệm khảo sat ánh sáng LED có 12 nghiệm thức gồm 11 ty lệ ánh sáng LED

đỏ, xanh đương khác nhau va 1 nghiệm thức đối chứng là ánh sáng đèn huỳnh quang

Kết quả đạt được như sau:

Thí nghiệm khảo sát nồng độ IBA, chồi Ba kích tạo rễ mạnh nhất trên môi trường

MS bổ sung 0,25 mg/L IBA Tỷ lệ ra rễ đạt 92,59%, số rễ 3,7 (rễ/chồi), chiều dài rễ 10,0(mm) sau 45 ngày nuôi cấy, các rễ tạo ra có chất lượng tốt: rễ to và hình thành nhiều rễ

phụ.

Thí nghiệm khảo sát ánh sáng LED, chéi Ba kích sinh trưởng và tạo thành câyhoàn chỉnh tốt dưới ánh sáng LED có tỷ lệ 80% D + 20% XD Chiều cao chỗi đạt 3,46(cm), số lá 5,4 (14/chéi), chiều dài lá 17,8 (mm), chiều rộng lá 6,8 (mm), hàm lượng diépluc a đạt 6,5 (mg/g lá), diệp lục b 3,3 (mg/g lá), diệp lục a + b 9,8 (mg/g lá), khối lượngtươi 132,5 (mg/chéi), tỷ lệ ra rễ đạt 88,88%, số rễ 3,6 (ré/chdi), chiều dài rễ 8,1 (mm)sau 45 ngày nuôi cấy Cây in vitro nuôi cây đưới ánh sáng LED có tỷ lệ 80% Ð + 20%

XD thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, dat ty lệ sống cao với 85,18%

MỤC LỤC

Trang TEAS TƯ bsessgtaaassilntstlSIitsltsvstiiDEEESKGIOSOSdSRC8rAbSSVDDSGSSEBSSiBMSSVI3À0faSEteisslslioiasiiddeas 1 ELC ALAN GI rote soars sartetve sures tne namin etter tr aries 1

¡on 1 iii

Me i17 iv

Damnh sach chit viét tat NA . .(‹-ÄäậẬHÄAH.HẬHH VI

Danh sách: 66t ĐẤT Tổ csessesersooileivsbEBEOAG14905355030905938222133991401800024 3EESPESEN S331 35880084 vill

1.1.3 Bộ phan sử dung va thành phần HOA: HQ vere secre eee 8

1.1.4 Gia tri cla cay Ba Kich 2 9

BC Gia so Số 9

1.1.4.2 Gia tri ái 7a 10

DA AD, TNS THẾ sci stmt oncnawon tetraacetate 10 Vel PSD DTS G) TAN) ¥ocasswenecenenemsnsenmiaeseestenaivyn eeneransene ce entanessenaeseremcree meaeene aeuareaumemmeneet 10

IEÐ)) g 12

1.1,5,1 Phương pháp gieo hat Và giâm CaObisccsissccccssmmmmnne mannan 12

1.1.5.2 Phương pháp nuôi cấy môÔ 2-22 222S22E22EE22E222E2212212212211221 22.22 re 13

1.2 Sử dụng auxin ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh - 55555 cS<c+scsssereereersee 14

1.2.1 Co sO Khoa cv a5 14

1.2.1.3 Nghiên cứu nồng độ IBA thích hợp dé tao cây Ba kích hoàn chinh 14

le 0/0009 07 -.a Ả 151.3.1 Cau tạo và đặc tính phat sáng -¿- ¿525225 2r 2x2 2E 2E rrkrrrree 151.3.2 Ưu và nhược điỀm 2 2-52 +s+Ss+E2ESEEEE12571221212111211111211111 2111121 erce 16

1.3.3 Co sở sử dung anh sang LED đỏ và xanh dương - - -++-c+<c+<ces+ 17

1.3.3.1 Quang phổ hấp thu của U6 ÌHCuosttatrtosttftibgbltBllÐtti6tSHSINGGSSHGREBS-IESGISESEZBBS8E 17

1.3.3.2 Tác động ánh sáng LED đỏ và xanh dương -5-=<<c<+c+<c+xccez 18

1.3.3.3 Kết hợp ánh sáng LED đỏ và xanh đương -2 2+22++22++2z++cszz 19

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU 22 21

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 2- 2 22 SSS£2EEE£EE£EE£EEEEEZEZEzEezrerrez 212.2 Điều kiện thí nghiệm - 2-2 2SSE+SE+EE2E22E2122112112112112112112112112112112122.2Xe2 21

DS Vial WOU, grssyseensorvsgg2g00159005919580.DS)SGGH310/5G05D103800G15E0.HG S.9-1BD01013EM2490/D07G015EI2G01EGH.200/83003H 21

ALC (| ee 212.3.2 Hóa chat và môi truONg oo cecceccececcessecsessessessessessessessessessessessessessessessessessesseeaeeees Zã2.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ và hệ thống các phòng -2- 22©22222+22z22z2>+2 22

2,4 Phuong phapNghien CtWicscccmecmccmpemeaen se 23

2.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ của chéi Ba kích in vitro

cốc cn acc Cố cổ ca ổ ca an acc Ca 23

2.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng

và khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chỗi Ba kích in vi/ro . - 242.4.3 Thiết kế hệ thống đèn LED trong nghiên cứu -2-©22222++22+z+czzzz 282.4.4 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu - 2-2 22222222+22+2EE2Ez22xzzzzzzxeex 29Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -22-2222222222222221 2222 czEcrxee 303.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ của chéi Ba kích in vi/ro 30

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ của chồi Ba kích in vi/ro 303.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến số rễ và chiều dài rễ của chồi Ba kích in vitro

— ÔỎ 31

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến hình thái rễ của chéi Ba kích in vitro 333.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng và khả năng taothành cây hoàn chỉnh của chéi Ba kích i Vitro 222-5522522222222c22x>zszssez 353.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng của chồi Ba

FECT 18 ME ti seksssgssbibtdiltobdgsdbisgicsibbliilGicheotkkgl0isiiu0clilkziqgd50.gg4 2042nq42gg02.<40g8043d0xeg0setskzsacesossu2

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến khả năng tạo thành câyhoàn chỉnh của chồi Ba kích i7 vifrO -2- 5252-5222 2222222223221211212212112121121121 2212262 453.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến tỷ lệ sống của cây Ba kích

1 VIO: KHL:GGTTTG.HEGAT VƯỜN WOM sees cscs nsonweenemnaseneensamnemunsanesnamuneenanies soneuuneeneoneenennnese’ 48

RET DUAN 8 HCNuaeaaaeseanaoaeenratreoioirsraororiatsastraSgorengosnassnai 50TÀI LIỆU THAM KHẢO - 2 ©222222222222223222122122312212732221221221221 22.2 xe $1

DANH SÁCH CHU VIET TAT

ANOVA Analysis of Variance (phan tich phuong sai)

Ctv Cộng tác viên

CV Coeficient of Variation (hệ số biến động)

DNA Deoxyribonucleic acid

D Anh sáng đỏ

ĐC Đối chứng

IAA Indol - 3 - acetic acid

IBA Indol - 3 - butyric acid

LED Light Emitting Diode (di-6t phat quang)

T1: Lần lặp lại

MS Murashige va Skoog, 1962

NAA Naphthalene Acetic Acid

NSC Ngày sau cay

NT Nghiệm thức

OD Optical Density (mật độ quang)

RCD Randomized Completely Design

RGB Red Green Blue (m6 hinh mau do - xanh luc - xanh duong)

TNHH Trach nhiệm hữu hạn

UV Ultraviolet (tia tử ngoại)

XD Ánh sáng xanh đương

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sé rễ và chiều dài rễ của chỗi Ba kích tại cácene.Bang 3.2 Anh hưởng của nồng độ IBA đến hình thái rễ của chéi Ba kích in vitro 34Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến chiều cao và số lá củachồi Ba kích in vitro tại các thời điểm theo đối -2-5255+2szzszserszeerserseeee.e.3/7Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến chiều dài lá, chiều

rộng lá, hàm lượng diệp lục a, diệp lục b, diệp lục a + b, tỷ lệ diệp lục a/b và khối lượng

tươi của chéi Ba kích in vitro tại thời điểm 45 NSC 5-5555Scscseseeee 3ØBảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến hình thái của chồi Ba

KG 477 Vit 0 tung gà Ga HN KI QGH43XIGAETXÀGHHANSS3YSSKSXSLSSEESSSSNEEESSSSthSSGSSS.C038CHQ4AEGEESSASIASExiötgiasgtosl 42

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến tỷ lệ ra rễ, số rễ vàchiều dai rễ của chỗồi Ba kích in vitro tại các thời điểm theo dõi 255-552 46Bang PL 2 Thành phan của môi trường MS (Muraghige va Skoog, 1962) 64

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình.1:1 Fra thấi cầu BS, KHGHasssneennsnbiendualiiittil8E100B038G8.0808040GHSISB-SRSESHGSSEELSHESHSHSGAHSMSS.3H820010 3

Hình 1.2 Ba kích tim và Ba kích trắng - 2: 222222E22E22212212221221222222122122 xe 4Hình 1.3 Rễ của một khóm Ba kích 7 năm tuôi được thu hoạch và rửa sạch 7

Hình 1.4 Quả Ba kích dạng quả rời Va quả TỤ - cece cee 2+ S21S2 S22 re 7

Hình 2.1 Mẫu chéi Ba kích -252-2222+ 22222 re 21Hình 2.2 Sơ đồ bảng thiết kế hệ thống đèn LED -2222-52222222222E222E222222zzz+2 28Hình 2.3 Vi dụ phối hợp màu của phần mềm Smartcolor 2-2 2252222zz2+2 29Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ của chồi Ba kích in vitro tại các

Hình 3.2 Cây Ba kích ở các nồng độ IBA khác nhau tại thời điểm 45 NSC 34Hình 3.3 Chéi Ba kích ở các nghiệm thức khác nhau tại thời điểm 45 NSC 43Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến tỷ lệ sống của cây Ba

kích in vitro khi đem ra ngoải VUON ƯƠIM cee 5 ce 552 +22 122 E232 re 49

Hình PL 1.1 Đất hữu cơ LaVamix -+-©222+222++t2EEEtEErrrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrre 61Hình PL 1.2 Túi nhựa trồng cây 2-2-2 S2SS22E£2E2EEEEE22EE2E21212121 212122 zxe2 61Hình PL 1.3 Máy đo quang phổ .- 2-2-5252 2222222E2EE£EE£EE£EEE2EEEEEErErrErrrrrrrrree 61

Hinh PL: 1:4 ACC1ONG sccvscnctssevsvssasenasanaeceasenesvsosneersnemawennsonsunencyesmmunsuassoeneremseenessseousenss 61

Hình PL 1.5 Cây Ba kích sau 2 tuần trồng ngoài vườn ươm -:-2z=5: 61Hình PL 1.6 Cac bước thực hiện do ham lượng diép lục VỐ Q 2.2222 22 2 ae 62Hình PL 1.7 Chéi Ba kích được nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau .63

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Ba kích (Morinda officinalis) là cây thuốc quý, có nhiều công dụng chữa bệnh va

đã được sử dụng trong dân gian từ lâu Tại Việt Nam, các nghiên cứu về Ba kích chủ

yếu là xây dựng quy trình nuôi cấy mô từ khâu vào mẫu đến khâu thích nghi cây ngoàivườn ươm (V6 Châu Tuan và Huỳnh Minh Tư, 2010; Hoàng Thị Thế và ctv, 2013; Phạm

Thuy Dung và ctv, 2020) Phương pháp nuôi cấy mô cho hệ số nhân cao (10,14 lần), có

thể nhân giống ở quy mô công nghiệp, tạo ra số lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồngđều, 6n định về mặt di truyền, cho năng suất và chất lượng cao; so với các phương phápnhân giống truyền thống (gieo hạt và giâm cành) có nhược điểm về hệ số nhân và chấtlượng cây giống (Phạm Thuỳ Dung và ctv, 2020) Trong quy trình nuôi cấy mô Ba kích,các yêu tố mà tác giả nghiên cứu chủ yếu là nồng độ chất khử trùng, nồng độ chất điềuhòa sinh trưởng và loại giá thể khi đem cây ra vườn ươm (Hoàng Thị Thế va ctv, 2013).Trong khi đó, nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố ánh sáng trong quy trình nhân

giông in vitro loài cây này van còn khá hạn chê.

Ánh sáng là nhân tố quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây trồngtrong điều kiện in vitro Hiện nay, đèn LED đang được quan tâm nghiên cứu lam nguồnsáng nhân tạo trong nuôi cấy mô, vì có nhiều ưu điểm nổi trội so với đèn huỳnh quangđang được sử dụng phổ biến: kiểm soát được bước sóng sử dụng, tiết kiệm điện năng, ítphát nhiệt, tudi thọ cao và có thé kết hợp các loại ánh sáng LED với nhau dé tao ra nguồnsáng có chất lượng mong muốn Ánh sáng LED đỏ và xanh dương thường được sử dụng

và kết hợp theo tỷ lệ, do bước sóng của 2 vùng sáng này gan trùng với quang phố hapthu của diệp lục nên các loài thực vật sẽ hấp thụ được tối đa năng lượng từ ánh sángLED (Hoàng Minh Tấn và ctv, 2006) Tuy nhiên, tỉ lệ giữa ánh sáng LED đỏ và xanhdương sẽ rất khác nhau ở từng loài thực vật và từng thời kỳ sinh trưởng Do đó, đã cónhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra tỷ lệ giữa ánh sáng LED đỏ vàxanh dương phù hợp với sinh trưởng và phát triển của từng loại cây trồng (Duong vàctv, 2002; Wongnok và ctv, 2008; Lê Thế Biên và ctv, 2021) Một số nghiên cứu đã ghinhận ánh sáng LED có tác động tích cực đến sự hình thành và phát triển rễ bất định (ĐỗThị Gắm và ctv, 2017; Lê Thế Biên và ctv, 2021) Tuy nhiên, ánh sáng LED chỉ có vai

1

trò kích thích, trong khi đó các auxin mới có vai trò lớn để cảm ứng tạo rễ bất định.Chính vì vậy, việc xác định nồng độ IBA và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương thíchhợp cho chồi Ba kích in vitro tạo rễ mạnh, sinh trưởng và khả năng tạo thành cây hoàn

chỉnh tot, tỷ lệ sông cao khi dem ra ngoài vườn ươm là việc cap thiệt cân thực hiện.

Với những vấn đề và nhu cầu trên, đề tài: “Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sựtạo rễ và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinh trưởng và khả năng tạo thành câyhoàn chỉnh của chồi Ba kích (Morinda officinalis) in vitro” được thực hiện

Mục tiéu

Xác định được nồng độ IBA và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương thích hợpcho chéi Ba kích in vitro tạo rễ mạnh, sinh trưởng và khả năng tạo thành cây hoàn chỉnhtốt, tỷ lệ sống cao khi đem ra ngoài vườn ươm

Yêu cầu

Bồ trí thí nghiệm trong phòng, theo dõi các chỉ tiêu về sự tạo rễ, sinh trưởng vakha năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chéi Ba kích in vitro, tỷ lệ sống khi đem ra ngoàivườn ươm với 4 nồng độ IBA và 11 tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương khác nhau

Ghi nhận nồng độ IBA và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương có ảnh hưởng tốtnhất đến sự tạo rễ, sinh trưởng va khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi Ba kích in vitro,

tỷ lệ song khi đem ra ngoài vườn ươm

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ được thực hiện từ tháng 8/2022 - 12/2022 với 4 nồng độ IBA và 11 tỷ

lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương khác nhau cho các mẫu chồi Ba kích tím (Morinda

officinalis) nuôi cấy in vitro trên môi trường khoáng cơ bản MS (Murashige và Skoog,1962) tại phòng Công Nghệ Tế Bao Thực Vật — Viện Sinh học Nhiệt đới trực thuộc Viện

Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Giới thiệu chung về cây Ba kích

Cây Ba kích còn có tên gọi khác: Ba kích thiên, day ruột ga, chau phóng xi, thaytay cay (Tay), say cay (Thai), chày kiang doi (Dao), chéi hoàng kim, liên châu Ba kích

Có tên tiếng Anh là Medicinal Indian Mulberry Trong y học cô truyền TrungQuốc, rễ Ba kích (Radix Morindae) được biết đến với tên gọi là Bajitian

Có tên khoa học là Morinda officinalis thuộc:

GIỚI: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)

Bộ: Long dom (Gentianales)

Ho: Ca phé (Rubiaceae)

Chi: Nhau (Morinda)

Loài: Ba kích (Morinda officinalis)

Hình 1.1 Hình thái cây Ba kích

(Bùi Xuân Chương, 2006)

1.1.1 Phân loại, phân bố và sinh thái

1.1.1.1 Phân loại

Ba kích có hai loại là Ba kích tím và Ba kích trắng (xem Hình 1.2).

Ba kích tím: ngọn có màu tím, vỏ rễ non có màu tím hồng sau già có màu vàngsậm, phần thịt bên trong có màu hanh tím Khi ngâm rượu làm cho màu rượu chuyênthành màu tím sậm Loại này khá hiếm trong tự nhiên chỉ chiếm 10 — 20% và có hàm

lượng dược liệu trong rễ tốt hơn Ba kích trắng nên được quan tâm sử dụng nhiều(Nguyễn Quỳnh, 2022).

Ba kích trắng: ngọn có màu xanh, vỏ rễ vàng nhạt, phần thịt bên trong có màutrắng trong, không có sắc tím Khi ngâm rượu chuyên màu tím nhạt Loại này chiếmkhoảng 80 — 90% số lượng Ba kích trong tự nhiên (Nguyễn Quỳnh, 2022)

Kết quả nghiên cứu dau hiệu di truyền DNA trong quan thé Ba kích cho thấy giữa

Ba kích tím và trắng chỉ có sự sai khác nhỏ nên vẫn thuộc dấu hiệu của cùng một loài

Morinda officinalis tuy có sự khác biệt về hình thái (Phạm Văn Kién va ctv, 2020)

(Bùi Thị Huong Phú, 2012; Nguyễn Thị Thu Hà và ctv, 2018)1.1.1.2 Phân bố

Trên thế giới, Ba kích phân bố tự nhiên ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như:Lào, Việt Nam, Ấn Độ, các tỉnh phía nam Trung Quốc (Quảng Đông, Phúc Kiến, QuảngTây, Hải Nam, Vân Nam, Tứ Xuyên) (N guyễn Tap va ctv, 2007; Zhang va ctv, 2018)

Ở Việt Nam, cây Ba kích mọc hoang, phân bồ nhiều ở vùng đồi núi thấp và trung

du phía Bắc như: Quảng Ninh (Cẩm Phả, Yên Tử), Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai (SaPa), Tuyên Quang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây (Hà Nội), BắcGiang (Nguyễn Chiều và Nguyễn Tập, 2007) Ba kích cũng được tìm thấy trong tự nhiên

ở một số tỉnh miền trung như: Quảng Bình (Hóa Sơn), Quảng Trị (Bắc Hướng Hóa),Thừa Thiên — Huế, Da Nẵng (Bà Nà), Quảng Nam (Tây Giang, Phước Sơn)

1.1.1.3 Sinh thái

Ba kích là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng khi còn non Trong tự nhiênthường thấy Ba kích trong các kiểu rừng thứ sinh hoặc rừng xen tre nứa (ít) Độ caophân bố phô biến thường dưới 300 m, trên các loại đất feralit đỏ vàng hay vàng đỏ vahơi chua (Nguyễn Tập, 2006)

Cây sinh trưởng, phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và âm Yêu

cầu về sinh thái là nhiệt độ trung bình năm 22°C — 24°C, độ âm không khí trung bìnhnăm từ 82% — 89% và lượng mưa hang năm khoảng 2000 mm (Nguyễn Chiều, 2001;

Nguyễn Tập và ctv, 2007) Ba kích là cây thường xanh, sinh trưởng mạnh vào mùa hè

đến mùa đông nếu gặp sương muối nhiều cây bị rụng lá; cây ra hoa quả hàng năm, mùahoa tháng 5 — 6, mùa qua tháng 7 — 10 Trong điều kiện trồng trọt cây có giá thé leo vàđược chiếu sáng day đủ sẽ ra hoa quả nhiều, những cây giá thé leo bị đỗ mặc dù có hoanhiều nhưng lượng kết quả thấp Ba kích mọc tự nhiên thường có ít hoa quả hơn trồng(Nguyễn Tập, 2006) Ba kích tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt, cây bị chặt phá vẫn cókhả năng mọc chỗi từ phần còn lại của thân và gốc (Nguyễn Tập và ctv, 2007)

non dạng bốn cạnh, màu xanh (Ba kích trắng) hoặc tím (Ba kích tím), có lông bao phủ;

thân cành gia tròn, màu nâu, nhẫn, không lông.

1.1.2.2 Lá

Lá dạng đơn nguyên, mọc đối hiếm khi mọc vòng ba; khi non mau xanh (Ba kíchtrắng) hoặc màu tím (Ba kích tím), khi già màu trắng mốc Cuống lá ngắn 4 - 8 mm,không phân nhánh chỉ mang một phiến lá, khi lá rụng cả cuống và phiến cùng rụng một

lúc Lá kèm màu nâu (Ba kích trắng) hoặc tím (Ba kích tím) dạng mo, có xu hướng tạo

thành ống ôm sát vào thân Phiến lá dày và cứng, có các dạng: hình mác thuôn nhọnhoặc bau dục, elip thuôn dải hoặc hình mác ngược hay hình trứng, hiểm khi thấy hìnhmác hẹp dài Phiến lá dài 3 — 16 em, rộng 1,9 — 6,5 cm, đầu lá thuôn nhọn hay nhọn sắc,gốc lá nhọn, hình nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm dang tim Phién lá có cau tạolung bụng với chức năng quang hợp và có hệ thống gân lá nỗi rõ, tương ứng với các bódẫn ở bên trong làm nhiệm vụ vận chuyền Gan lá hình lông chim, lá non có lông ở gân

và mép lá, thường tập trung dày hơn ở mặt dưới, sau già ít lông hơn hoặc không lông.

1.1.2.3 Hoa

Hoa tập trung thành cụm tán tròn ở đầu cành, cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ítkhi là cụm hoa tan đơn, ở cum xim tán kép hoa hầu như không cuống, ở cụm tán đơn

hoa có cuống rõ ràng Hoa nhỏ, dai 0,3 — 1,5 cm, gồm 8 — 10 hoa, lúc non màu trắng sau

hơi vàng Lá đài hình chén hay hình ống gồm 4 lá đài nhỏ hình tam giác đều phát triểnkhông đều nhau Trang hoa màu trắng, dính liền ở dưới thành ống ngắn 2 — 3 mm, họng

có lông, ở đầu có 3 — 4 cánh tràng dạng tam giác nhỏ Mỗi hoa có 3 — 4 nhị, đính ở đáycủa ống tràng; bao phan nhọn dau, hai 6; chỉ nhị cực ngắn Bau nhụy có dang hạ, hợp;vòi nhụy ngắn chẻ đôi ở đỉnh, đầu nhụy hai thuỳ

1.1.2.4 Rễ

Rễ có dạng rễ củ hình trụ tròn, mập, cong queo phân nhánh nhiều cấp thành bộ

rễ phân bố tỏa tròn quanh gốc cây, nhìn ngoài có vết thắt thành từng đoạn như ruột ga

(nên còn gọi là dây ruột gà) (xem Hình 1.3) Vỏ ngoài màu nâu nhạt (Ba kích trắng) hoặc hồng nhạt (Ba kích tím), nhám, có vân dọc Bên trong là lớp thịt dày mau trắng (Ba kích trắng) hoặc tím (Ba kích tím), không mùi, vi ngọt nhưng hơi chat, trong cùng

là lõi củ, thông thường khi chế biến phần lõi được loại bỏ Rễ Ba kích xoắn dài từ 20 —

60 cm, cây lâu năm có thé có rễ dai hơn, đường kính từ 1 — 3 em

Hình 1.3 Rễ của một khóm Ba kích 7 năm tuổi được thu hoạch và rửa sạch

(Nguyễn Chiều và Nguyễn Tập, 2007)

1.1.2.5 Quả, hạt

Quả tạo thành chùm, có hai loại là chùm quả đơn (quả rời) và chùm quả kép (quả

tụ) (xem Hình 1.4) Chùm quả đơn, các qua rời nhau, có cuống rõ rang Chùm quả kép

do nhiều quả dính liền nhau đính trên các cuống xim nhỏ tạo thành một khối Cả hai loạiquả này đều có thé thấy ở cả cây Ba kích trang và Ba kích tím Thậm chí trên một câyhay trên một chùm quả vừa có quả tụ lẫn quả rời Quả hình cầu, kích thước 6 — 10 mm,

quả non màu xanh khi chín có màu đỏ, mang dai tôn tại ở đỉnh.

(Nguyễn Chiểu và Nguyễn Tập, 2007)

Mỗi quả có 4 hạt Hạt có dạng gần giống hạt đậu tròn nhưng vác, có kích thước

3 — 3,5 x 3 mm, có lông ngắn thô màu hồng, khi khô màu trang ngà hoặc trắng vàng, vỏ

hạt nhám.

1.1.3 Bộ phận sử dụng và thành phần hóa học

Bộ phận sử dụng của cây Ba kích là rễ Trong số hơn 100 hợp chất hóa học đã

được phân lập, các iridoid glycoside, anthraquinon, oligosaccharid, polysaccharid là

thành phan chính và quan trọng trong rễ Ba kích

Bảy iridoid glycoside cụ thé là monotropein, asperuloside, axit asperulosidic, axit

deacetyl asperulosidic, morofficinaloside, morindolide, asperuloside tetraacetate da

được phân lập từ dich chiết ethanol của rễ Ba kích (Yoshikawa va ctv, 1995; Chen và

ctv, 2009).

Theo Zhang và ctv (2018), có tổng cộng 28 hợp chất anthraquinon được phân lập

từ rễ Ba kích Con số này ngày càng tăng lên khi các hợp chất anthraquinon mới đượctim thấy trong rễ Ba kích như: 3-hydroxy-2-hydroxymethyl-1-methoxyanthraquinon

(Yang va ctv, 2019); 2,8-dihydroxy-1-methoxyanthracene-9,10-dione (Luo va ctv,

2021) Một số anthraquinon đã được kiểm tra tác dung dược lý va có hoạt tính sinh học

cao như: rubiadin; rubiadin-l-methyl ether; 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinon; physicion; 1,3,8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinon (Wu và ctv, 2009; Bao va ctv, 2011; Lee va ctv, 2017).

Ré Ba kích chứa nhiều loại oligosaccharid như: bajijiasu (Chen va ctv, 1999; Wu

va ctv, 2015); mannose (Chen va ctv, 1999); nystose, 1F-fructofuranosyl nystose, inulintype hexasaccharid va heptasaccharid (Cui va Yang, 1995; Li va ctv, 2004; Chen, 2009); sucrose, trisaecharid, mulotriose, inulotetraose, inulopentaose (Feng và ctv,

2012); 1-kestose, 1F-fructofurano-syinystose (Deng va ctv, 2012).

Một số polysaccharid đã được phat hiện trong rễ Ba kích như: MOHP-I (Yang

và ctv, 2011); MOHP-II, MOHP-II, MOHP-IV (He và ctv, 2005; He và ctv, 2006); MOP-60, MOP-100, MOP-60-100 (Xu va ctv, 2019); MP-1, MP-2, MP-3 (Zhang và ctv, 2009); MOPI-3 (He va ctv, 2009).

Ngoài ra, một số loại hợp chất khác cũng đã được phân lập từ rễ Ba kích như:axit hưu cơ (Cui va Zhang, 1995; Chen, 2009; Zhang và ctv, 2010); tinh dau (Liu va ctv,

2005; Yi va ctv, 2009); cac phytosterol, coumarin (Zhang va ctv, 2010); scopoletin (Wu

va ctv, 2009); flavonoid (Kang va ctv, 2015); cac chat v6 co va axit amin

1.1.4 Gia trị của cay Ba kích

Việc người dân đồ xô vào rừng tìm kiếm và khai thác rễ Ba kích đem bán cho

thương lái Trung Quốc, đã khiến cho số lượng Ba kích mọc tự nhiên suy giảm một cách

nghiêm trọng Ba kích đã được nước ta ban hành chế độ khai thác hạn chế và cần đượcbảo vệ (Nghị định Chính phủ, 2002) Do đó, ở nhiều địa phương đã phát triển trồng Bakích với mục đích vừa bảo tồn cây thuốc quý, vừa mang lại nguồn thu nhập, góp phầnxóa đói giảm nghéo cho người dân trung du và miền núi Điển hình tại Quảng Ninh, nơi

có diện tích Ba kích trồng lớn nhất cả nước thì việc phát triển trồng Ba kích đã đem lạihiệu quả kinh tế cao (hàng tỷ đồng) cho người nông dân, đặc biệt trồng Ba kích với quy

mô vừa và lớn (trên 2 ha) đạt hiệu quả kinh tế cao hơn so với quy mô nhỏ (dưới 1 ha)(Dương Hoài An và Trần Việt Dũng, 2021)

Ngoài là cây trồng chính, Ba kích cũng có thể trồng bán tự nhiên trong các mô

hình vườn gia đình nhằm làm nguồn thu phụ trong vườn này Nguyễn Chiều và Lê Thanh

Sơn (2001), đã báo cáo rằng trên điện tích 1 sào Bắc Bộ trồng xen Ba kích vào các

khoảng dat trống trong vườn gia đình sau 3 năm trừ phần dau tư chi phí lãi thu được là1,788,000 đồng Hàng năm, ngoài việc thu hoạch từ các cây trồng chính, phần còn lạikhu vườn bỏ trống không thu được mối lợi nào, trồng xen Ba kích đem lại lợi ích thiếtthực cho nông dân ở trung du và miền núi Ba kích trong vườn tham gia vào hệ thốngnông - lâm - được liệu kết hợp Đó là hệ thống sử dung đất dé trồng đồng thời các câylay gỗ, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lương thực thực phẩm, cây lấy thuốc trêncùng một mảnh đất với mục dich cho ra sản phẩm tối đa và duy trì sức sản xuất lâu dai

9

1.1.4.2 Giá trị sử dụng

1.1.4.2.1 Theo Đông y

Theo Đoàn Thị Nhu và ctv (2006), Ba kích có một số tính vị và công dụng sau:

Ba kích là cây thuốc quý đã được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền ởTrung Quốc và Việt Nam Ba kích có vị ngọt, hơi cay, tính ấm vào kinh thận Có tácdụng ôn thận trợ đương, cường gân cốt, chữa đương ủy di tinh, phong thấp cước khí,gân cốt yếu mềm, lưng gối mỏi đau Là một vị thuốc bổ trí não và tinh khí, Ba kích cònchữa các bệnh liệt đương, xuất tinh sớm, di mộng tinh, phụ nữ kinh nguyệt không đều,bệnh phong thấp

Trong dân gian, Ba kích được dùng phổ biến làm thuốc bổ, tăng lực Qua điều trịthử nghiệm đạt kết quả sau: đối với nam giới có hoạt động sinh dục yếu, Ba kích có tác

dụng làm tăng kha năng giao hợp, đặc biệt đối với trường hợp có khả năng giao hợp yêu

và thưa Tuy không làm tăng đòi hỏi tính dục, nhưng Ba kích có tác dụng tăng cường

sức déo dai, không thay có tác dụng giống androgen trên lâm sàng Có tác dụng hỗ trợ

và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạngthái vô sinh tương đối nhẹ và suy nhược thé lực

Đối với người cao tuôi bệnh nhân thường có biéu hiện mệt mỏi, kém ăn ít ngủ,

người gầy yếu mà không thay có những yếu tố bệnh ly gây nên, một số trường hợp cóđau mỏi các khớp, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thé hiện qua những cảm giác chủ

quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon và những dấu hiệu khách quan như tăng cân,tăng cơ lực Còn đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp, sau khi dùng Ba kích dài ngày

các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt.

Kiêng ky: đối với bệnh nhân âm hư hỏa vượng, đại tiện táo kết không nên dùng

Ba kích (Đoàn Thị Nhu và ctv, 2006).

1.1.4.2.2 Theo Tây y

Trong y học hiện đại, các nghiên cứu đã chỉ ra Ba kích có nhiều tác dụng dược

lý quan trọng được thử nghiệm trên chuột và có tiềm năng điều trị cho con người như:

Tác dụng chống trầm cảm: trên mô hình gay căng thang cho chuột, các inulintypeoligosaccharide từ Ba kích với liều dùng 25,0 — 50,0 mg/kg đã được chứng minh có hiệu

quả trong điều trị trầm cảm (Qiu và ctv, 2016)

Tác dụng chống loãng xương: một số hợp chất anthraquinon chiết xuất từ Ba kích

có tác dụng tăng sinh nguyên bào xương, ức chế tế bào hủy xương và tiêu xương (Wu

và ctv, 2009; Bao và ctv, 2011); polysaccharide từ Ba kích với liều dùng 100 — 300mg/kg cho chuột sau 30 ngày đã làm tăng nồng độ khoáng trong xương (Zhu và ctv,

2008); bajijiasu một loại oligosaccharide từ Ba kích được chứng minh làm giảm sự hình

thành tế bào hủy xương và tiêu xương (Hong và ctv, 2017) Ngoài ra, monotropein từ

Ba kích với liều dùng 40 — 80 mg/kg/ngày cho chuột có tác dụng bảo vệ xương, tăngchất khoáng của xương (Zhang và ctv, 2016)

Tac dụng cải thiện khả năng sinh san: bajijiasu từ Ba kích giúp làm tăng rõ rệt

nồng độ testosterone, giảm nồng độ cortisol, cải thiện chất lượng tinh trùng trên cả chuột

bình thường và chuột bị thiếu thận (Wu và ctv, 2015)

Tác dụng chống bức xạ: trên mô hình cho chuột đực tiếp xúc bức xạ, Ba kích vớiliều dùng 40 g/kg có khả năng chống lại suy giảm khả năng sinh sản do bức xạ gây rathông qua biểu hiện như cải thiện đáng kế hoạt động tình dục, tang testosterone, tangđáng kề số lượng tinh trùng trong mao tinh và tinh hoàn (Song và ctv, 2015)

Tác dụng cải thiện trí nhớ và chống bệnh Alzheimer: dùng phương pháp gây độcthần kinh cho chuột bằng cách tiêm Abeta 25 — 35, oligosaccharide từ Ba kích có tácdụng cải thiện chứng mat trí nhớ nhờ khả năng chống oxy hóa, kích thích chuyền hóanăng lượng não, cải thiện tốn thương của hệ thống cholinergic (Chen va ctv, 2013) Cácantharaquinon chiết xuất từ Ba kích đã chứng minh hiệu quả phòng ngừa và điều trị của

với bệnh Alzheimer (Lee và ctv, 2017).

Tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi: bằng phương pháp cho chuột bơi có gắn vậtnang, các polysaccharide từ Ba kích với liều dùng 50 — 200 mg/kg giúp kéo đài thời gian

bơi, chống mệt mỏi, hạ urê và axit lactic trong máu, tang mức độ hoạt động glycogen ởgan (Zhang va ctv, 2009).

lãi

Tác dụng chống viêm: trên mô hình gây phù chân cấp tinh bang carrageenan,monotropein từ Ba kích dùng với liều 20 — 30 mg/kg có tác dụng chống viêm rõ rệtthông qua sự ức chế và giảm phù nề chân chuột (Choi va ctv, 2005).

Tác dụng hạ đường huyết: dùng phương pháp làm tăng đường huyết cho chuột

bằng streptozotocinind, Ba kích với liều dùng 50 mg/kg có tác dụng hạ và chống tăng

đường huyết (Soon và Tan, 2002)

Tác dụng chống oxy hóa: các polysaccharide từ Ba kích đã được chứng minh là

có khả năng chống lại các tác nhân oxy hóa như loại bỏ các gốc tự đo, chelat hóa cácion sắt và ức chế sự tan máu của hồng cầu chuột được xử lý bằng HaO› (Zhang va ctv,

2013) Ngoài ra, các oligosaccharide từ Ba kích giúp bảo vệ DNA của tinh trùng người khỏi bị hư hại bởi H202 (Chen va ctv, 2014; Wu va ctv, 2015).

1.1.5 Nhân giống Ba kích

Ba kích là một cây thuốc quý có nhiều công dụng do đó mà nhu cầu sử dụng loàicây này làm dược liệu ngày càng gia tăng Việc người dân khai thác 6 ạt cùng với vùngphân bố của Ba kích dần thu hẹp và bị tàn phá khiến cho số lượng trong tự nhiên suygiảm đáng kể, thậm chí có nguy cơ bị tuyệt chủng Ba kích đã được đưa vào Sách ĐỏViệt Nam (Nguyễn Tiến Bân và ctv, 1996) và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (NguyễnTập 2006) Năm 2002, Ba kích được xếp vào nhóm 2A thực vật hoang dã hạn chế khaithác, sử dụng và cần được bảo vệ (Nghị định Chính phủ, 2002) Do đó, cần có phươngpháp nhân giống thích hợp dé bảo tồn và phát triển trồng Ba kích

1.1.5.1 Phương pháp gieo hạt và giầm cành

Phương pháp gieo hạt có ưu điểm: cây sinh trưởng khỏe, hạt của cây mẹ ở vụtrước có thé tận thu dé gieo cho vụ sau Tuy nhiên, việc nhân giống bằng hạt không phảibao giờ cũng thuận lợi và hợp lý khi hạt Ba kích có thời gian nảy mầm dài (30 — 60 ngàyhoặc hơn), tỷ lệ nảy mầm thấp; quả thu hái xong phải ngâm ủ, đãi lấy hạt và phơi khô,hạt phơi xong cần gieo ngay không bảo quản được lâu (Nguyễn Viết Khoa và Trần NgọcHải, 2008) Mặt khác, cây giống đem trồng có nguồn gốc từ hat không đảm bảo do hiện

tượng phân ly trong sinh sản hữu tính nên cây giống không đồng đều, không còn giữđược phẩm chất ưu việt của nguồn giống đem trồng Ngoài ra, cây Ba kích trồng sau 22

tháng khoảng 15 — 40% số cây có hoa quả, sau 3 năm tỷ lệ này cũng chỉ đạt khoảng 45

— 50% (tuỳ thuộc vào điều kiện canh tác) và hệ số nhân giống bằng hạt chỉ đạt 1,1 lần

(Nguyễn Chiều, 1999: Nguyễn Chiều, 2001)

Phương pháp giâm cành cũng không may khả quan khi hệ số nhân giống rất thấp

chỉ đạt 0,61 lần mặc dù đã sử dụng các chất kích thích sinh trưởng (Nguyễn Chiều và

Lê Thanh Sơn, 2002) Cây trồng bang hom có sức sông kém, dé mang mam bệnh từ cây

mẹ, chất lượng rễ thu được kém Qua thời gian giống bị thoái hóa dẫn đến năng suất vàphẩm chất bị giảm sút, nguồn gốc giống không được kiểm soát, không có xuất xứ rõràng Tóm lại, các phương pháp nhân giống truyền thống như gieo hạt, giâm cành khôngthé đáp ứng nhu cầu về số lượng và chất lượng cây giống dé phát triển trồng Ba kích.1.1.5.2 Phương pháp nuôi cay mô

Dé kiểm soát được nguồn gốc giống, nâng cao chất lượng cây giống đem trồng,đồng thời nhân giống cây Ba kích theo quy mô công nghiệp nhằm tiến tới cung cấp

giống tại chỗ thì cần phải áp dụng phương pháp nhân giống hiện đại là nuôi cấy mô Ưuđiểm nỗi trội của phương pháp này là khắc phục cơ bản những nhược điểm của cácphương pháp gieo hạt và giâm cành, đồng thời sản xuất ra số lượng lớn cây giống theohướng công nghiệp, ôn định về mặt di truyền, cho năng suất và chất lượng cao

Tại Việt Nam, cho đến nay quy trình nhân giống Ba kích in vitro đã được một sốtác giả nghiên cứu thành công từ khâu vào mẫu đến khâu thích nghi cây ngoài vườnươm (Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010; Hoàng Thị Thế va ctv, 2013; PhamThuy Dung va ctv, 2020) Môi trường thích hợp cho sự nhân nhanh chồi Ba kích là MS

+ 3,5 mg/L BAP + 0,2 mg/L IBA + 10 mg/L Riboflavin, hệ số nhân chéi đạt 10,14 lần

(Pham Thuy Dung va ctv, 2020) Môi trường thích hợp dé tao cây hoàn chỉnh Ba kích

là MS + 0,2 mg/L IBA + 0,4 g/L than hoạt tính (Hoàng Thị Thế va ctv, 2013) Cây invitro có khả năng sống sót cao và sinh trưởng tốt khi trồng trên cơ chất đất cát pha (VõChâu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010)

13

1.2 Sử dụng auxin ở giai đoạn tạo cay hoàn chỉnh

1.2.1 Cơ sở khoa học

Tạo cây hoàn chỉnh là một trong các khâu của quy trình vi nhân giống thực vật

Ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin nhằm tạo rễ chocác chéi đã đạt đủ kích thước lấy từ giai đoạn nhân nhanh Auxin có tác dụng hoạt hóacác tế bảo vùng xuất hiện rễ đề tạo nên mầm rễ bắt định, sau đó các mầm rễ sinh trưởngdài ra, chui ra khỏi vỏ và hình thành rễ bất định Các auxin như IAA, IBA, NAA được

sử dung khá phô biến dé tạo rễ bất định trong nghiên cứu và sản xuất

Theo Ninh Thị Thảo và ctv (2016), sự hình thành rễ bất định bao gồm 4 giaiđoạn: tạo tế bào hoạt hóa, hình thành vùng tế bào mô phân sinh, hình thành sơ khởi rễ

và kéo dài rễ Bên cạnh vai trò của kiểu gen, loại mô, bản chất và nồng độ của auxin cóvai trò rất quan trọng trong sự hình thành rễ bắt định Giai đoạn hoạt hóa tế bào cần nồng

độ auxin khá cao Trong khi giai đoạn kéo dài rễ cần auxin ở nồng độ thấp hơn, nồng độ

auxin quá cao sẽ gây ức chê sự phát triên của rê.

Theo Deng va ctv (2015), trong số ba auxin được thử nghiệm khả năng tạo rễ củachéi Ba kích in vitro, IBA ảnh hưởng tích cực hơn so với NAA va IAA Tương tự trongnghiên cứu của Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010), IBA kích thích tạo rễ mạnhhon NAA thể hiện qua thời gian cảm ứng hình thành rễ và tỉ lệ mẫu hình thành rễ: kếthợp IBA và NAA thì hiệu quả ra rễ kém hơn nhiều so với môi trường chỉ có IBA HoàngThị Thế và ctv (2013), đã nhấn mạnh IBA có ảnh hưởng tích cực hơn so với NAA docác chỉ tiêu tỷ lệ chdi tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ đều cao hơn, các rễ tao ra có chất lượngtốt hơn, rễ trăng, nhiều rễ phụ

1.2.1.3 Nghiên cứu nồng độ IBA thích hợp để tạo cây Ba kích hoàn chỉnh

Nghiên cứu của Võ Châu Tuan và Huỳnh Minh Tu (2010), khi bổ sung IBA vào

môi trường MS với 4 nồng độ lần lượt 0,10 mg/L; 0,20 mg/L; 0,25 mg/L; 0,50 mg/L

Sau 30 ngày nuôi cấy, tỷ lệ chồi Ba kích ra rễ cao nhất (100%) trên môi trường chứa0,20 — 0,25 mg/L IBA Tuy nhiên, khi tăng nồng độ IBA lên đến 0,50 mg/L thì ức chế

hình thành rễ in vitro.

Nghiên cứu của Hoàng Thị Thế và ctv (2013), khi bổ sung IBA vào môi trường

MS với 7 nồng độ lần lượt 0,0 mg/L; 0,1 mg/L; 0,2 mg/L; 0,3 mg/L; 0,4 mg/L; 0,5 mg/L;1,0 mg/L Các chéi Ba kích hoàn toàn không tao rễ trên môi trường nền MS sau 30 ngàynuôi cấy Tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất (100%) trên môi trường chứa 0,2 — 0,3 mg/L IBA,

số rễ trung bình cao nhất (3,1 rễ/chôi), chiều dài rễ trung bình cao nhất (2,53 cm) trên

môi trường chứa 0,2 mg/L IBA và giảm dần khi nồng độ IBA tăng lên

Nghiên cứu của Deng và ctv (2015), khi bố sung IBA vào môi trường MS với 4nồng độ lần lượt 0,0 mg/L; 0,2 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L Sau 3 tuần nuôi cấy, tỷ lệ chổi

Ba kích tạo rễ cao nhất (100%) trên môi trường chứa 0,2 mg/L IBA Các cây con đượcchuyên ra trồng ngoài vườn ươm dat tỷ lệ sống cao 90%

1.3 Tống quan về đèn LED

Trong nuôi cay mô tế bào thực vật, ánh sáng là nhân tố quan trọng đối với sự sinh

trưởng và phát triển của cây trồng trong điều kiện in vitro Ánh sáng vừa là nguồn năng

lượng cung cấp cho quá trình quang hợp, vừa là tín hiệu ảnh hưởng lên sự phát sinh hìnhthái ở thực vật Hiện nay, đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến làm ánh sáng nhântạo trong nuôi cay in vitro thực vật Tuy nhiên, ánh sáng trắng tạo ra bởi đèn huỳnhquang là một tô hợp các ánh sáng có bước sóng khác nhau từ 320 — 800 nm (Dương TanNhựt và Nguyễn Bá Nam, 2014) Trong số các bước sóng này, tia hồng ngoại có bướcsóng đài thực vật không có khả năng sử dụng và tia UV có bước sóng ngắn có thể gâyton thương đến thực vật Ngoài ra, đèn huỳnh quang còn có nhược điểm ở chỗ tuổi thọthấp, tỏa nhiệt trong thời gian vận hành, tiêu tốn nhiều điện năng nên chỉ phí sản xuấttăng cao Với nhiều ưu điểm nổi trội và giải quyết được nhược điểm của đèn huỳnhquang, đèn LED có thể trở thành nguồn sáng nhân tạo day hứa hẹn thay thé đèn huỳnh

quang trong lĩnh vực vi nhân giống thực vật

1.3.1 Cấu tạo và đặc tính phát sáng

Một đèn LED cơ bản với công suất nhỏ được cấu tạo bởi 2 khối bán dẫn là khốibán dẫn loại p chứa nhiều lỗ trống tự do mang điện tích dương và khối bán dẫn loại nchứa các điện tử tự do, tương ứng với 2 khối bán dẫn là 2 cực: dương (cathode) và âm(anode); toàn bộ được lắp trong một vỏ nhựa có tác dụng như một thấu kính để hướng

[5

ánh sáng phát ra ngoài Đối với đèn LED có kích thước và công suất từ trung bình đếnlớn được cấu tạo từ các chip LED, chip LED là trái tim dùng dé sinh ra bức xạ ánh sáng

và được gắn vào mạch in; thành phan khác trong các loại đèn LED này là bộ phận tan

nhiệt giúp hạ nhiệt độ của các tinh thé phát sáng Đèn LED sử dụng dòng điện một chiều,

do đó cả đèn LED công suất nhỏ đến trung bình và lớn đều cần bộ nguồn nhằm cung

cấp nguồn điện, cũng như ồn định về điện áp tránh tình trạng chập, cháy bóng

Đèn LED hoạt động giống với nhiều loại điết bán dẫn, ở biên giới hai mặt tiếpgiáp một số điện tử từ khối bán dẫn n bị lỗ trống của khối bán dẫn p thu hút và khi chúngtiến lại gần nhau, chúng có xu hướng kết hợp với nhau tạo thành các nguyên tử trunghòa Quá trình này có thé giải phóng năng lượng dưới dạng ánh sáng (hay các bức xạđiện từ có bước sóng gần đó) Màu sắc của ánh sáng LED đo chất liệu của liên kết bándan p — n quyết định Khi khoảng trống giữa liên kết p — n với các chất liệu khác nhau,khoảng trồng càng lớn, năng lượng do điện tử và lỗ trống kết hợp với nhau tạo ra nănglượng ánh sáng càng lớn Năng lượng dưới dạng ánh sáng cũng chính là màu mà mắtthường thấy được, ánh sáng xanh đương và tím mang năng lượng nhiều nhất, ánh sáng

đỏ và cam mang năng lượng ít nhất Các nhà sản xuất ứng dụng các chất liệu cho liên

kết p — n khác nhau sẽ nhận được các LED có màu sắc mong muốn khác nhau

1.3.2 Ưu và nhược điểm

Đèn LED tạo ra ánh sáng đơn sắc với nhiều dải màu, đo đó dễ dàng kiểm soát

vùng quang phô sử dụng Ánh sáng đỏ và xanh dương tao ra từ đèn LED có thé kết hợptheo tỷ lệ phù hợp với sinh trưởng, phát triển của từng loài thực vật (Nguyễn Bá Nam

và ctv, 2012; Nguyễn Khắc Hưng và ctv, 2016) Ngoài ra, ánh sáng LED có thể phốihợp thành các dạng màu sắc khác nhau, trong đó ánh sáng trắng sử dụng rộng rãi đượctạo ra khi kết hợp ánh sáng LED đỏ, xanh dương và xanh lục

Đèn LED có tuổi thọ cao, thấp nhất cũng đạt mức 30,000 giờ và cao nhất lên đến100,000 giờ (Bula và ctv, 1991) Với tuổi thọ này thì đèn LED có thê sử dụng để chiếusáng lên đến 35 năm khi mỗi ngày hoạt động 8 giờ Trong khi đó, đèn huỳnh quang cótuổi thọ chỉ đạt tới 10,000 — 15,000 giờ Vì vậy, khi sử dụng đèn LED các chi phí thay

thê, sửa chữa đèn được hạn chê.

Theo Dương Tan Nhựt (2011), có hai van đề chính liên quan đến giá thành điệnnăng trong các phòng nuôi cấy mô đó là cần 65% điện năng đề thắp sáng phòng nuôi và

25% điện năng được sử dụng đề làm mát phòng nuôi Đèn LED với hiệu suất phát quang

lớn giúp tiết kiệm điện năng khoảng 30 — 40% so với đèn huỳnh quang Ngoài ra, vớiđặc điểm phát nhiệt ít, sử dụng đèn LED chỉ cần một lượng điện năng nhỏ dé làm mát

phòng nuôi cây.

Đèn LED được làm bang vật liệu bán dẫn không chứa dây tóc hay thuy tinh nên

có độ bền cao, an toàn rất khó bị hư hỏng do tác động ngoại lực, ánh sáng bị mờ dầntheo thời gian không gây cháy nỗ hay hư hỏng bất ngờ Đèn huỳnh quang chứa thuỷngân, đèn LED thì không, vì thế sử dụng đèn LED không gây hại môi trường và conngười Ngoài ra, đèn LED còn có ưu điểm kích thước nhỏ dé bố tri, không tạo ra tia UVlàm tổn thương các mô thực vật, có khả năng làm giảm độ sang, ánh sáng tức thời, khởi

động êm, hoạt động trên điện thế thấp.

Nhược điểm của đèn LED là nhạy cảm với nhiệt độ cao và hiệu điện thế Nhiệt

độ môi trường cao và hiệu điện thế nằm ngoài ngưỡng yêu cau có thé khiến cho đèn

LED giảm hiệu suất chiếu sáng, thậm chí hư hỏng vĩnh viễn Ngoài ra, chi phi đầu tư

ban đầu cao cũng là nhược điểm của đèn LED Tuy nhiên, đèn LED lại tiêu thụ rất ít

điện năng, độ bền, tuổi thọ cao, chi phí sửa chữa, bảo trì, thay thế thấp hơn đèn huỳnhquang Do đó, mặc dù tiền đầu tư ban đầu có cao hơn, nhưng về lâu dài lại giúp ngườidùng tiết kiệm được nhiều khoản chi phí hon han

1.3.3 Cơ sở sử dụng ánh sáng LED đỏ và xanh dương

1.3.3.1 Quang phố hấp thu của diệp lục

Theo Hoàng Minh Tan và ctv (2006), bằng cách sử dụng quang phổ kế ta quansát được khả năng hấp thu ánh sáng của dung địch điệp lục, một số vùng ánh sáng đơnsắc được diệp lục hấp thu mạnh nhất, một số vùng được hấp thu ít hơn và có vùng hầunhư không bị hấp thụ Sự hấp thu ánh sáng có tính chọn lọc đã tạo nên quang phô hấpthu của điệp lục Trong quang phố hấp thu đó, có hai vùng ánh sáng mà diệp lục hap thumạnh nhất tạo nên hai đỉnh hấp thu cực đại Đó là vùng ánh sáng đỏ với cực đại là 662

nm (chlorophyll a), 650 mn (chlorophyll b) và vùng anh sáng xanh tím với cực đại là

430 nm (chlorophyll a), 470 mn (chlorophyll b) (Lichtentaler và Wellburn, 1985; Hoang

17

Minh Tấn va ctv, 2006) Ở mức độ phân tử, diệp lục hấp thu mạnh nhất 2 vùng ánh sáng

đỏ và xanh dương do ở thực vật có các thụ quan nhận ánh sáng đỏ (phytochrome) và các

thụ quan nhận ánh sáng xanh dương (cryptochrome, phototropin), các thụ quan này đóng

vai trò là nơi tiếp nhận tín hiệu, nơi truyền (khuếch đại) và đáp ứng tín hiệu ánh sáng(Schafer và Nagy, 2006; Dương Tan Nhựt, 2011)

Với đặc tính của đèn LED có thé tạo ra ánh sáng đơn sắc đỏ và xanh dương vớivùng bước sóng tương ứng là 610 — 720 nm và 400 — 520 nm Khi đó quang phố đènLED sé gan trùng với quang phé hấp phụ của diệp lục nên các loài thực vật sẽ hap thụ

được tối đa năng lượng từ ánh sáng đèn LED

1.3.3.2 Tác động ánh sáng LED đỏ và xanh dương

Trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, ánh sang LED đỏ có vai trò thúc day hình

thành rễ và kéo dài rễ đã được báo cáo trên cây lê (Bertazza và ctv, 1995), lan Lí (Duong

Tan Nhut và ctv, 2001), lan Hồ Điệp (Wongnok và ctv, 2008), Tử linh lan (Lê Thế Biên

và ctv, 2021), khoai tây (Elsabaa va ctv, 2022) nhân giống in vitro Ngoài ra, ánh sángLED đỏ còn có tác động đến sinh trưởng cây con như làm tăng kéo dài thân (NguyễnThanh Sang và ctv, 2014; Duong và ctv, 2018), hình thành và làm tăng chiều dài lá(Tanaka và ctv, 1998), diện tích lá (Trần Thị Mỹ Trâm và ctv, 2019) Ánh sáng đỏ đápứng với phytochrome, các phytochrome này tham gia điều hòa quá trình quang phát sinh

hình thái, cũng như kiểm soát sự tăng trưởng lá và thân (Dương Tan Nhựt, 2011)

Li và ctv (2012), đã báo cáo rằng ánh sáng LED xanh dương có lợi cho tổng hợp,tích luỹ các sắc tố quang hợp như điệp lục và carotenoid Tương tự trước đây, người ta

cũng đã biết rằng ánh sáng LED xanh dương có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp

và phát triển điệp lục tố (Senger, 1982; Saebo va ctv, 1995; Tanaka và ctv, 1998; Poudel

ctv, 2008; Kurilcik ctv, 2008) Ngoai ra, anh sang LED xanh duong con duge ghi nhan

có tac động đến độ đóng mở của khí khổng (Tibbitts va ctv, 1983) Các khí khổng mở

dé đáp ứng với môi trường bên ngoài và các tín hiệu bên trong, bao gồm ánh sáng, độ

am, CO2, phytohormone và các phản ứng oxy hóa Người ta đã chứng minh rằng khíkhổng chịu sự kiểm soát của ánh sáng LED xanh dương nhiều hơn so với ánh sáng LED

do (Sharkey và Raschke, 1981; Zeiger, 1984).

Giữa ánh sáng LED đỏ và xanh dương đơn sắc được ghi nhận có tác động trái

ngược nhau đến hình thái cũng như sinh trưởng của nhiều loài thực vật Trong khi ánh

sáng LED đỏ đơn sắc có khả năng kích thích tạo rễ, kéo dài thân và rễ thì ánh sáng LED

xanh dương đơn sắc lại ức chế tạo rễ, kéo đài thân và rễ (Lee và ctv, 2014; Hung và ctv,2016; Đỗ Thi Gam va ctv, 2017) Theo Tanaka va ctv (1998), dưới ánh sáng LED đỏdon sac cây Dia lan được thúc day sự tăng trưởng lá nhưng làm giảm hàm lượng diéplục tố, điệp lục lại được phục hồi dưới ánh sáng LED xanh dương Tuy nhiên, tác độngthúc đây hay ức chế của ánh sáng LED đỏ hay xanh dương chỉ mang tính tương đốikhông hoàn toàn giống nhau ở từng loài thực vật Theo Hahn và ctv (2000), ghi nhậntác động ngược của ánh sáng LED đỏ lên sự phát triển thân của cây Rehmanniaglutinosa; chiều cao của cây Paphiopedilum delenatii Guillaumin là cao nhất khi đượcnuôi cấy dưới ánh sáng LED xanh đương va bị ức chế dưới ánh sáng LED đỏ (Vu vàctv, 2015) Tác động thúc đây hay ức chế là do sự tương tác phối hợp khác nhau của các

thụ quan nhận anh sang đỏ và xanh theo từng loài thực vật (Kim va ctv, 2004) Dù tác

động thúc day hay ức chế có khác nhau, nhưng có thé thay ánh sáng LED đỏ hoặc xanhdương đơn sắc đều không tối ưu cho sự sinh trưởng của thực vật

1.3.3.3 Kết hợp ánh sáng LED đỏ và xanh dương

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự kết hợp giữa ánh sáng LED đỏ và xanh dươnggiúp cho hầu hết tất cả các loại cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt so với ánh sángLED đỏ hoặc xanh dương don sắc Thiếu ánh sáng LED đỏ cây con tăng trưởng chậm,trong khi thiếu ánh sáng LED xanh dương cây con xuất hiện thân kéo đài thất thường,chất lượng kém và hàm lượng diệp lục giảm đi (Nguyễn Thanh Sang và ctv, 2014; ĐỗThị Gam va ctv, 2017) Ánh sáng LED đỏ và xanh dương bố sung cho nhau tạo ra một

tỷ lệ thích hợp có tác dụng thúc day tốt nhất sự sinh trưởng ở thực vật, ở các loài thựcvật khác nhau thì tỷ lệ này là khác nhau và thông thường tỷ lệ LED đỏ nhiều hơn LEDxanh Cây dâu tây tăng trưởng khỏe mạnh khi được nuôi cấy dưới nhiều tỷ lệ đỏ/xanhkhác nhau, nhưng chúng tăng trưởng tốt nhất ở điều kiện 70% ánh sáng LED đỏ và 30%

ánh sáng LED xanh dương (Duong và ctv, 2003) Cây chuối, sâm dây tăng trưởng tốtdưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ va 20% ánh sáng LED xanh dương (Duong và

ctv, 2000; Nguyễn Khắc Hưng và ctv, 2016), đối với cây việt quất tỷ lệ này là 50% ánh

19

sáng LED đỏ và 50% ánh sáng LED xanh dương (Hung va ctv, 2016) Theo Dương Tan

Nhựt (2011), những nghiên cứu trước đây đã cô gang tìm ra mối quan hệ giữa ty lệ ánhsáng LED đỏ và xanh dương cho sự sinh trưởng, phát triển va tong hợp diệp lục ở thựcvật nhưng vẫn chưa xác định rõ ràng mối liên hệ của 2 loại ánh sáng này Tuy nhiên, sựsinh trưởng và phát triển của thực vật được thúc đây có thê là do tốc độ quang hợp được

gia tăng đưới vùng quang phổ là đỉnh hấp thu của các sắc tố quang hop, vùng quang phổ

này thường là giao thoa giữa hai loại ánh sáng LED đỏ (660 nm) và LED xanh dương

(450 nm) Ánh sáng LED đỏ và LED xanh dương phối hợp tạo ra bước sóng có ngưỡngphù hợp cho quá trình hap thu năng lượng thông qua diép luc a và b nên đã làm tăng tốc

độ quang hợp cho thực vật (McCree, 1972).

Tóm lại, đèn LED đã được nghiên cứu thành công trên nhiều cây trồng, tuy nhiêntrên cây Ba kích vẫn còn hạn chế Nhận thấy tiềm năng của đèn LED như: kiểm soát

được bước sóng sử dụng, tiết kiệm điện năng, ít phát nhiệt, tuổi thọ cao và có thê kết

hợp theo tỷ lệ để tạo ra nguồn sáng có chất lượng mong muốn Vì vậy, đề tài “Ảnhhưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinh

trưởng va kha năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chỗồi Ba kích (Morinda officinalis) in

vitro” được thực hiện nhằm xác định nồng độ IBA và tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanhdương thích hợp cho chéi Ba kích nuôi cấy in vitro tạo rễ mạnh, sinh trưởng và tạo thành

cây hoản chỉnh tôt, tỷ lệ sông cao khi đem ra ngoài vườn ươm.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2022 đến tháng 12/2022 tại phòng Công Nghệ

Tế Bào Thực Vật — Viện Sinh học Nhiệt đới trực thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và

Công Nghệ Việt Nam.

2.2 Điều kiện thí nghiệm

Các chai chứa mẫu thí nghiệm được chiếu sáng với thời gian 10 gl1ờ/ngày, cường

độ chiếu sáng 40 pmol/m?.s (đối với đèn huỳnh quang) và 20 — 26 pmol/m?.s (đối với

đèn LED) Nhiệt độ trung bình trong phòng nuôi cấy 25 + 2°C, độ âm tương đối trung

bình 55 — 60% Ánh sáng LED đỏ và xanh dương đơn sắc có bước sóng lần lượt là 662

nm và 462 nm.

2.3 Vật liệu

2.3.1 Mẫu thí nghiệm

Mau sử dụng trong thí nghiệm là các chồi đỉnh Ba kích tím có chiều cao đồng

đều là 1,5 cm và có 2 cặp lá Tat cả các mẫu chéi in vitro này được Phòng Công nghệ

Tế bao Thực vật — Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp

21

2.3.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chat

Các hóa chất dùng để pha môi trường: khoáng đa lượng và vi lượng theo côngthức MS (Murashige và Skoog, 1962), vitamin, Fe-EDTA, đường, agar Thành phần củacác hóa chất này được trình bày ở Bảng PL 2

Chất điều hòa sinh trưởng: IBA (loại chứa 99% hoạt chất của Merck, Đức).Các hóa chất khác: acetone 80%, cồn 70°, cồn 96°, NaOH, HCI

Môi trường thí nghiệm

Môi trường nên là môi trường khoáng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

bồ sung 30 g/L đường và 8 g/L agar Tùy thuộc vào thí nghiệm mà IBA được bổ sung

vào môi trường với các nông độ khác nhau Tat cả các môi trường déu được điêu chỉnh

về pH = 5,8 (NaOH hay HCl), sau đó hap khử trùng 6 121°C, 1 atm trong 20 phút.2.3.3 Trang thiét bi, dung cu va hé théng cac phong

Trang thiét bi

Tủ cấy vô trùng (Ads Laminaire, Pháp); nồi hấp khử trùng (Hirayama, Nhật);máy đo pH (Thermo, Mỹ); cân phân tích (Sartorius, Đức); máy cất nước 2 lần(AQUATRON A8000); máy đo cường độ ánh sáng; máy đo quang phổ V-730 (Jasco,

Nhật Bản) (xem Hình PL 1.3).

Dụng cụ

Đèn LED: loại dây đán 5050 RGB, cuộn 5 m, 60 đèn/m, điện áp 12 V, công suất

4 W/h (công ty TNHH Điện Tử Elek, Việt Nam).

Đèn huỳnh quang: chiều đài 1,2 m, công suất 36 W/h (công ty bóng đèn Rạng

Đông, Việt Nam).

Dụng cụ cấy: kẹp cấy, kéo, dao cấy, nhíp cấy, nhíp mở nắp, dia cấy, đèn con.Dụng cụ pha môi trường: ca đong, ống đong, phéu, chai thuỷ tinh 500 mL

Dụng cụ đo chỉ tiêu: cân điện tử, thước điện tử.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến sự tạo rễ của chồi Ba kích in

vitro

Bồ trí thi nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yêu tố (Randomized

Completely Design, RCD), 3 lần lặp lại gồm 5 nghiệm thức với 4 nồng độ IBA và 1nghiệm thức đối chứng không bồ sung IBA vào môi trường:

Tổng số chai trong một thí nghiệm: 5 x 5 x 3 = 75 chai

Tổng số mẫu trong một chai: 3

Tổng số mẫu trong một thí nghiệm: 3 x 75 = 225 mẫu

23

Phương pháp tiến hành

Các chéi Ba kích được cấy vào chai thuỷ tinh có thể tích 500 mL chứa 50 mLmôi trường Các chai nuôi cay được đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang

Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Trên mỗi nghiệm thức chọn ngẫu nhiên 9 chai, dùng bút lông đánh dấu các chai

đo chỉ tiêu.

Các chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ, số rễ chính, chiều dài rễ chính và hình thái rễ được bắtđầu theo đối 15 NSC, 3 lần, định kỳ 15 ngày/lần và theo dõi 9 mẫu/NT/LLL

- Tỷ lệ ra rễ (%): đếm tat cả các chỗi hình thành ré/NT/LLL tại thời điểm theo

dõi Ré được tính khi có chiều dai từ 1 mm trở lên Được xác định bằng công thức:

(Tổng số chi ra rễ / Tổng số chỗồi cấy) x 100%

- Số rễ chính (rễ/chồi): đếm tat cả số rễ chính hình thành trên chồi Rễ được tínhkhi có chiều đài từ 1 mm trở lên Tính trung bình

- Chiều đài rễ chính (mm): dùng thước điện tử đo từ cổ rễ đến đỉnh rễ chính Dotat cả các rễ chính hình thành trên chdi Ré được tính khi có chiều dai từ 1 mm trở lên

Tính trung bình.

- Hình thái rễ: quan sát, ghi nhận màu sắc của rễ trên từng chồi

2.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng LED đỏ, xanh dương đến sinhtrưởng va khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh của chồi Ba kích in vitro

Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yêu tô (CompletelyRandomized Design, RCD), 3 lần lặp lại gồm 12 nghiệm thức với 1 nghiệm thức sửdụng ánh sang LED đỏ đơn sac, 1 nghiệm thức sử dụng ánh sáng LED xanh dương donsắc, 9 nghiệm thức sử dụng ánh sáng kết hợp giữa LED đỏ, LED xanh dương với các tỷ

lệ khác nhau và 1 nghiệm thức đối chứng sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang:

Nghiệm thức 1: ánh sáng đèn huỳnh quang (ĐC)

Nghiệm thức 2: 100% ánh sáng LED đỏ

Nghiệm thức 3: 90% ánh sang LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 4: 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 5: 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 6: 60% ánh sáng LED đỏ + 40% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 7: 50% ánh sáng LED đỏ + 50% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 8: 40% ánh sáng LED đỏ + 60% anh sang LED xanh dương

Nghiệm thức 9: 30% ánh sang LED đỏ + 70% ánh sang LED xanh dương

Nghiệm thức 10: 20% ánh sáng LED đỏ + 80% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 11: 10% ánh sáng LED đỏ + 90% ánh sáng LED xanh dương

Nghiệm thức 12: 100% ánh sáng LED xanh dương

Quy mô thí nghiệm

Tổng số chai/NT/LLL: 5

Tổng số chai trong một thí nghiệm: 5 x 12 x 3 = 180 chai

Tổng số mẫu trong một chai: 3

Tổng số mẫu trong một thí nghiệm 3 x 180 = 540 mẫu

Khoảng cách giữa các chai: 5 cm x 5 cm

Phương pháp tiến hành

Chéi Ba kích được cấy vào chai thuỷ tinh 500 mL chứa 50 mL môi trường Chainuôi cấy được đặt dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau (xem Hình PL 1.7)

Sau 45 ngày nuôi cây, các cây in vitro hoàn chỉnh được chuyên ra vườn ươm,

trồng vào túi nhựa đen (số lượng 1 cây/túi) với giá thé sử dụng là đất hữu cơ Lavamix

Cây được đặt trong nhà lưới che phủ bằng nylon và lưới che răm Lưới che râm có khảnăng ngăn cản 70% ánh sáng Tưới nước giữa âm 3 lần/ngày

25

Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS bổ sung 30 g/L đường va 8 g/L agar Nong độ IBA bồ sung vàomôi trường nuôi cấy là nghiệm thức cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1

Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Trên mỗi nghiệm thức chọn ngẫu nhiên 9 chai, dùng bút lông đánh dấu các chai

đo chỉ tiêu.

Các chỉ tiêu về sinh trưởng

Các chỉ tiêu chiều cao chéi và số lá được bắt đầu theo doi 15 NSC, 3 lần, định kỳ

15 ngay/lan và theo déi 9 mau/NT/LLL

- Chiều cao chồi (em): dùng thước điện tử do từ gốc đến đỉnh chop cao nhất củachoi Tính trung bình

- Số lá (lá/chồi): đếm tắt cả số lá hình thành trên chéi Lá được tính khi nhìn thay

rõ cuống lá và phiến lá Tính trung bình

Các chỉ tiêu chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lượng tươi, hình thái chồi và hàmlượng điệp lục tố được theo đõi 1 lần, 45 NSC và theo dõi 9 mau/NT/LLL

- Chiều đài lá (mm): dùng thước điện tử đo từ vị trí cô lá đến chóp lá của lá ở vịtrí số 1 tính từ đỉnh cây Lá được đo khi nhìn thấy rõ cuống lá và phiến lá Tính trung

bình.

- Chiều rộng lá (mm): dùng thước điện tử đo từ vị trí rộng nhất của lá ở vị trí số

1 tính từ đỉnh cây Lá được đo khi nhìn thấy rõ cuống lá và phiến lá Tính trung bình

- Khối lượng tươi (mg/chồi): dùng cân điện tử cân khối lượng chồi tươi

- Hình thái chéi: quan sát, ghi nhận mau sắc của lá trên từng chéi

- Hàm lượng diép lục tổ (chlorophyll): được đánh giá bằng phương pháp phantích quang phô hap phụ của địch chiết lá trong dung dich acetone (xem Hình PL 1.6)

Trên mỗi cây cắt lấy 1 lá ở vị trí số 1 tính từ đỉnh cây Lá được lấy khi nhìn thấy

rõ cuống lá và phiến lá Cân khối lượng lá tươi (g/1á) sau đó cắt nhỏ, cho vào ống nghiệm

có chứa 10 ml acetone 80%, bọc kín bằng giấy bạc Các ống nghiệm được đặt ở điềukiện phòng trong vòng 96h dé dung dịch chiết hoàn toàn lượng điệp lục tố trong mau,sau đó dùng máy đo quang phô V-730 đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 663 và 645

nm Hàm lượng diệp lục a và b được tính theo công thức của Arnon (1949):

- Diệp lục a (mg/g lá) = [(12,7 x ODs«) — (2,6 x ODax4s)] x 10 / (khối lượng lá)

- Diệp lục b (mg/g lá) = [(22,9 x ODous) — (4,68 x ODoo3)] x 10 / (khối lượng lá)

- Diệp luc a + b (mg/g lá) = diệp luc a + diép luc b

- Diệp luc a/b = diệp luc a / diệp lục b

Các chỉ tiêu về khả năng tạo cây hoàn chỉnh

Các chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ, số rễ chính và chiều dài rễ chính được bắt đầu theo đõi 15NSC, 3 lần, định kỳ 15 ngày/lần va theo dõi 9 mẫu/NT/LLL

- Tỷ lệ ra rễ (%): đếm tat cả số chồi hình thành ré/NT/LLL tại thời điểm theo dõi

Ré được tính khi có chiều dai từ 1 mm trở lên Được xác định bằng công thức: (Tổng sốchôi ra rễ / Tổng số chdi cấy) x 100%

- Số rễ chính (ré/chéi): đếm tat cả số rễ chính hình thành trên chéi Rễ được tínhkhi có chiều đài từ 1 mm trở lên Tính trung bình

- Chiều dai rễ chính (mm): dùng thước điện tử đo từ cổ rễ đến đỉnh rễ chính Dotat cả các rễ chính hình thành trên chồi Rễ được tính khi có chiều đài từ 1 mm trở lên

Tính trung bình.

Chỉ tiêu tỷ lệ sống ngoài vườn ươm

-Tỷ lệ sống (%) = (Tổng số cây sống) / (Tổng số cây trồng) x 100% Theo dõi

sau 2 tuân trông ngoài vườn ươm.

Di

2.4.3 Thiết kế hệ thống đèn LED trong nghiên cứu

Đèn LED loại dây dán 5050 RGB, cuộn 5 m, được sử dụng kèm theo bộ nguồn

12 V với 1 bộ điều khiển và thu phát tín hiệu (xem Hình 2.1) Mỗi kệ đựng mẫu cấyđược thiết kế 4 dãy đèn LED song song với nhau, cách nhau 10 cm, nối với nguồn điện

và bộ thu phat tín hiệu Khoảng cách từ các day đèn LED xuống bình nuôi cấy là 30 cm

Mau sắc của đèn được điều khiến bằng phần mềm Smartcolor (được thiết kế bởi công

ty ELEK, Việt Nam).

Kệ đựng mẫu cấy: có 5 tầng, mỗi tầng có kích thước 1500 x 550 x 550 mm, nền

kính trong suốt được ngăn cách ánh sáng và hệ thống đèn chiếu sáng tự động được gan

bên trên.

Phần mềm Smartcolor được lập trình dựa vào mô hình mau RGB trong đó cácloại ánh sáng như ánh sáng đỏ, áng sáng xanh lục và ánh sáng xanh lam được tô hợp

theo nhiều phương thức khác nhau dé tạo thành các màu khác nhau

Khi biểu diễn dưới dạng só, giá trị RGB trong mô hình 24 bpp thông thường đượcghi bằng ba cặp số nguyên giữa 0 và 255, mỗi số đại điện cho cường độ của mau đỏ,xanh lục, xanh lam (xem Hình 2.2) Số lượng màu tối đa sẽ là: 256 x 256 x 256 =

16.777.216 Ví dụ: (0, 0, 0) là màu đen; (255, 255, 255) là mau trang; (255, 0, 0) la mau

do; (0, 255, 0) là màu xanh lục; (0, 0, 255) là màu xanh lam; (255, 255, 0) là màu vàng

Edit Colors bá

Basic colors:

mí mmị MBE

| ree ae Fe BEE EERE BEEBE EEE BEEBE EEE

Tất cả số liệu trong các thí nghiệm được thu thập, thống kê bằng phần mềm

Microsoft Excel, sau đó phân tích ANOVA bang phần mềm R 4.2.0 dé phát hiện sự khác

biệt giữa các nghiệm thức Tiến hành trắc nghiệm phân hạng (nếu có)

29

đã được khảo sát và ghi nhận được kết quả sau đây:

3.1.1 Anh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ của chồi Ba kích in vitro

Tỷ lệ ra rễ phản ánh phần trăm số mẫu hình thành rễ trên tổng số mẫu cấy, tỷ lệ

này càng cao đồng nghĩa với số mẫu cấy hình thành rễ cảng nhiều Kết quả trình bày ở

Hình 3.1 cho thay sự thay đôi về tỷ lệ ra rễ của chồi Ba kích giữa các nghiệm thức trong

thí nghiệm.

Tại thời điểm 15 NSC, tỷ lệ ra rễ của chồi Ba kích dat cao nhất là 52,25% tạinghiệm thức có nồng độ 0,25 mg/L, khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức đốichứng với tỷ lệ ra rễ đạt 44,44% và nghiệm thức có nồng độ 0,50 mg/L với 29,62%,nhưng khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại Tỷ lệ ra rễ giảm dần khinồng độ IBA tăng lên và đạt thấp nhất ở nồng độ 1,00 mg/L là 0,00%