Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, nước dừa, IBA, BA đến sự tạo sẹo, nhân nhanh chồi và tạo rễ cây hoa Dạ Yến Thảo (Petuinia hybrida) trong nuôi cấy mô in vitro

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, nước dừa, IBA, BA đến sựtạo sẹo, nhân nhanh chdi và tạo rễ cây hoa Dạ yến thao Petunia hybrida trong nuôi cay mô in vitro” đã được

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

3k 2s 3k 2K 3k 2k sk

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ 2,4-D, NƯỚC DUA, IBA, BA DEN SU TAO SEO, NHAN NHANH CHOI VA TAO RE

CAY HOA DA YEN THAO (Petuinia hybrida)

TRONG NUÔI CAY MO IN VITRO

SINH VIEN THUC HIEN: KHUU THI TU TRINH

NGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 — 2023

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2023

ANH HUONG CUA NONG DO 2,4-D, NUOC DUA, IBA, BA DEN SU TAO SEO, NHÂN NHANH CHOI VA TẠO RE

CAY HOA DA YEN THAO (Petuinia hybrida)

TRONG NUOI CAY MO IN VITRO

Tac gia

KHUU THI TU TRINH

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Con xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng vàdạy dỗ con nên người, cảm ơn anh chị và gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ cũng nhưtạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt quá trình học tập

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phó

Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông học, Bộ môn Di truyền - Chọn giống câytrồng cùng với quý thầy cô đã truyền đạt cho em những kiến thức bồ ích trong suốt thời

gian học tập tại trường.

Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Thanh Duyên đã tận tình hướng dẫn,

quan tâm, chỉ dạy và cho em những góp ý quý báu trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng xin cảm ơn An Khang, Nhật Hào, Kim Thoa, Minh Đức, Thúy Vy,Anh Hào cùng với các bạn trong lớp DHI9NHB đã luôn động viên, đồng hành, nhiệttình giúp đỡ, chia sẻ những kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập cũng như quá trìnhthực hiện khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Khưu Thị Tú Trinh

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, nước dừa, IBA, BA đến sựtạo sẹo, nhân nhanh chdi và tạo rễ cây hoa Dạ yến thao (Petunia hybrida) trong nuôi cay

mô in vitro” đã được tiến hành tại phòng nuôi cay mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn

Di truyền - Giống Khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

từ tháng 05/2023 đến tháng 11/2023 Các thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên đơn yếu tố và hai yếu tố với ba lần lặp lại với mục tiêu là xác định nồng độ2,4-D, môi trường va liều lượng nước dừa, sự kết hợp của nồng độ IBA, BA tác độngđến quá trình tạo sẹo, nhân nhanh chéi, tạo rễ của cây Dạ yến thao in vitro Kết qua thu

duoc nhu sau:

Sau 28 NSC, môi trường MS bô sung 1,5 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

tốt nhất (98,7%) với khối lượng mô sẹo cao nhất (489,1 mg) cho mô sẹo cứng, chắc có

màu vảng xanh.

Môi trường MS bổ sung 150 ml/L nước dừa thích hợp cho quá trình nhân nhanhchéi với các kết quả tốt nhất về số chdi (4,2 chồi), chiều cao chéi (4,4 em), số lá/cụmchỗi (22,3 lá), trọng lượng cụm chồi (1,4 g)

Môi trường MS kết hợp bổ sung 0,7 mg/L IBA + 0,3 mg/L BA cho kết quả tốt

về tỷ lệ ra rễ (95,6%), chiều cao cây (6,0 cm), số lá/cây (25,8 lá), số rễ (28,1 rễ) và chiềudai rễ (7,8 cm).

MỤC LỤC

Trang TRANG TUA 0 i

LOI CAM 09) ii,_ ETE EEE iti

MỤC LUC oes oc socsossssssesssssessesssssessessessstssssnsssssssssssnssssietsnsssssssussssesstssessessnssessessesansaeeees iv

DANH SÁCH CHU VIET TẮTT 2-©2¿22222S2EE£EE22E+£EE2EE+2EE2EEE2EE22EZEE22Erzrrerree VvDANH SÁCH CAC BẢNG -:- 2: ©22222222222222122112212231221221221221211211 21.2 xe viTHÁNH SAL A TAIN sa ngang ng nh senso css areca cana Vii

Oo |

Đặt vấn đề scTx 1 11111121111 2111121111121111211111 2111111211121 1111 2111211112111 2111111 ee 1

In ai aAˆn 2

2

CIIÚI Wath si nøgn1 go 0n Từ Dhy GESELI535G01E.SEENGISSSESUSELSSIRSSEOENINSSĐSSAEHNSESSANERCRUISNSERSIGSGSESSKESSEBQSiirsstBt 2

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU SĂSSSSEiikesr.see 3

1.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo 2 2-52222222E22E1221221122122112112212112212122 xe 3

1.1.1 Nguén géc va phan b6 181 4H,.ĂHĂHĂH

lãi PSY A ce ốỐốỐẺốỐỐẺốỐẺẺốẺẻ.ố.ốẻốẻốẻố.ốẻẽẻẽẻẻẽ de dsp cpesse eee eed 3

1.1.3 Dac diém thyre vat HOC 1 41.1.4 Một số loại hoa Da yến ¡0 41.2 Tình hình trồng và nhân giống Dạ yến thảo ở Việt Nam -2-2255255z5s2 4

1.3 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật -2¿ 2-22 2222+2E+2x+2xzzxzxzzxzxez 5

lã-1 ay rae TÍN Wt sua angnggoiHõgggì gi gio giốnGtEQg30G8/q636380 0002380csaai 5

1.3.2 Tính toàn năng của tế bảo 2-22 ©22222222222122112212212112212112112211211211 22c xe 6

1.3.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bảo - 2-2 ©52©22+2E+2E22EE22E+2E+zzEzzzzeex 71.3.4 Lich sử nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thé giới 2 2+22+s+2z+zzzzzzxzzxe- 71.3.5 Lịch sử nuôi cấy mô tế bao thực vật ở Việt Nam 2-2 2+2z+2z+£z+zxzzxzed 91.4 Nhân giống i WifO 2: 2+22+2222222252212222122122121112112121211212121121212112 11 ca lãi

1.4.1 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nhân giống int vi/ro - 11

1.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cây mô tế bào thực vật 121.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Dạ yến thảo 2- 225525522552 16Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -2- 182.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu - 2 2+22+2222+2E2+2E2222222222212221222222222e 18

232: Vial LIỆU: hShien CU orenccenencenmemnenr mineral ere ee EEE 18

ee a 182.2.2 Môi trường nuôi cấy trong thi nghiệm -2- 2222 2S+S22E2EE2E22E£E2E22E222z2zz2, 192.2.3 Điều kiện nuôi cấy i7 vifrO + 52 5+ S2 22222212211211211212212121222 222cc 202.2.4 Thiết bị và dụng cụ 2-2 5221221221221221221221221221112121212121112121 212 xe 20

2.3 Phuong phap nghién 000) 2 20

2.3.1 Thi nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tao mô seocủa mẫu cây Dạ yến thảo 2-52 222221222122122122512212112112211211221 211211212111 eEcre 202.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năngnhân nhanh chỗồi Dạ yến thảo int Vi/rO 2-©2222222222222EE22222EE222222122222222232222222e2 232.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ IBA va BA đến khả năng ra rễ của cây Da

YO tha G70 VIEPO occ <iiI 252.4 Phương pháp xử lý số liệu ¿2222552 ©2222SEEEEEEEEEEEEE2EEEEEEEEEErErrrrrree 27

Chương 3 KẾT QUA VA THÁO LUẬN xeescecesseeessbseeioeesiidedeocbiigsecboisgescgai 28

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tao mô sẹo của mẫu cây Da

| Ta cv AC co vn r cU 0/0/70 0 VÔ VY Ni C Yn 283.2 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi

Tự vốn 'DHỀU ẤN VÍNNG nnn: L3.3 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến khả năng ra rễ của cây Dạ yến thao in vitro

C12 1122112211221122112112211211121112111 1111211112112 1111 1111211121112 ea 38

KET LUAN VA DE NGHD an <5 48TÀI LIEU THAM KHAO co cccccccescesessesesceseseeseeseesecseesecssessecsessessessessesseeseeees 49

TT TT Enggeraeeeetrenraearaeaetbinteoiceeideeseertriosbnltorertthdckeivdsgtibifuirfidsesu 52

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

GA3 Gibberellin Acid

IAA 3 - Indoleacetic acid

IBA 3 -Indolebutyric acid

LLL Lan lap lai

MS Musrashige and Skoog, (1942)

NAA 1 - Naphthalene acetic acid

NaOCl Natri hypochlorite

NSC Ngày sau cay

NT Nghiệm thức

PL Phụ lục

TDZ Thidiazuron

TN Thí nghiệm

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Thành phan môi trường được sử dụng trong thí nghiệm - 19

Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm Ì - 5 <5 <2 222 E£*£E£*EE+eEeeEsreeekerrreexes 22 Bảng 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm 2 5 2 + +22 * SE S*E£*E£eeeEerrrrrrrrrrrreree 24 Bang 2:4 Các nghiệm thức thí nghiệm 3 vesccsessesssssessneossssnnessessesasensusssesseasessavsen 113584583836 26

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) của mẫu cây

08200) 29

Bang 3.2 Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D đến khối lượng và hình thái, màu sắc môsẹo của cây Dạ yến thảo 28 NSC - 2-2-2222 2 222221223122122121122122.221 21c 30Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến số chéi (chồi) cây hoa

Bang 3.4 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến chiều cao chồi (em)

cây hoa Dạ yến thảo 2-2-5 Ss2222E521221211212212112121211211112112112121121111121121211 2121 xe, 34

Bảng 3.5 Anh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến số lá/cụm chồi (lá)gãy hoa Da yên THẾ esessseeoorsnoihordsrttikisinhitosgiiont200310000501010810 90060005 0ipnusssrroso SỔBảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến trọng lượng cụm chồi(g) của cây hoa Dạ yến thảo 42 NSC 22522252 2222222222E2EEE.zrrrrrrrrre 3f7Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến tỷ lệ ra rễ (%) của cây hoa Dạ yến

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nông độ IBA va BA đến chiều cao cây (cm) của cây hoa Dạ

yếu tháo qua cao thôi ERE sen screams tomentosa oun 42

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến số lá (lá) của cây Dạ yến thảo quacác thời điểm -:-22++222x+222 2272122211 44Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến số rễ (rễ) và chiều dài rễ (cm) củacay hoa Da yén thao 0e 46Bang PL1 Số liệu chuyên đổi arcsinVx tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) cây hoa dạ yến thảo 52Bang PL2 Số liệu chuyên đổi arcsinVx tỷ lệ ra rễ (%) cây hoa Dạ yến thảo 53

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

lýi11, Lh Cy Tees Try cội 5“ Y 3Hình 2.1 Cây và lá của cây Dạ yến thảo - 2 52225222222222122122212212211221 221.222 c2e 18Hình 2.2 Vật liệu khởi đầu cho thí TỊE HIGTH ls-xessssesoosrsenovoeosozsnroiggoiigttrtrrZotdgdmtsu2tesi0m00 d6E00 21Hình 2.3 So đồ bố trí thí nghiệm Looe ccc cccccccccessessessessecsecsessessessessessessecsessessesseeaes py

Hinh 2.4 Vat ligu thi nghiém 2 0 23

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 2- 2-22 5S+SE+SE+EE£EE+EE2EE22E22E22E222222222222222e2 24

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ IBA và BA đến chiều dài rễ và số rễ của cây Dạ yến

CAO assertion ieee poem ine ee ee ee 47

Hinh PLI Toàn cảnh khu thí ñghiỆHm Ì ccc cascnse cavsavssnssnensenennonveenseeneanenvexeencennneneveoseonnns 54

Hình PL2 Quá trình hình thành mô sẹo của mau lá Da yến UH AO sonyykzscttggaotssatstiaszae 54

Hình PL3 Toàn cảnh khu thí nghiệm 2) x sccssesssszssucssouasvsssansesaraseasesnsvnssvesseasenvesveseesessese 55

Hinh PL4 Qua trinh phat triển của chéi Da yến thao oo cece eeeceeseeseeeeeeeeeteeeeeees 55

Hình PLS Toàn cảnh khu thí nghiệm 3 ceeeeeeeeeseeseeseeseeseeseeseeseeseeeeeees 56

Hình PL6 Mẫu cây Dạ yến thảo bổ sung 0,7 mg/L IBA + 0,3 mg/L BA sau 14 NSC

SS ELST NE hr al te a a a a tl 56

Hình PL7 Mẫu cây Da yến thao bổ sung 0,7 mg/L IBA + 0,3 mg/L BA sau 42 NSC

¬ Ô 56

này mang lại nhiêu lợi ích cho người sản xuât.

Hiện nay, ở Việt Nam cây hoa Dạ yến thảo được trồng chủ yếu từ hạt với giá hạt

tương đối đắt (từ 1.000 đến 5.000 đồng/hạt tùy thuộc vào dạng cây và màu sắc hoa),đồng thời tỷ lệ nảy mầm chỉ khoảng 60 - 65%, tỷ lệ chết cao, hạt nhỏ nên giá thành cây

giống khá cao Dạ yến thảo còn có thể nhân giống bằng phương pháp giâm cành nhưng

có nhược điểm là cần lượng cây mẹ lớn, hệ số nhân giống thấp, cây con sinh trưởng kém

va dé nhiễm các loại bệnh (Bùi Thị Cúc va ctv, 2017).

Đề đáp ứng nhu cầu sản xuất cũng như tiêu thụ cần áp dụng phương pháp nhângiống mới dé nâng cao chất lượng, nhân nhanh số lượng giống Nuôi cây mô tế bào thựcvật là phương pháp khá phổ biến có thé khắc phục được những nhược điểm của việcnhân nhanh cây hoa Dạ yến thảo Trong quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôicay mô tế bao thực vật, việc tao seo, nhân nhanh chồi va tạo rễ là một trong những bướcquan trọng để tạo được một cây con hoản chỉnh

Môi trường MS (Murashige và Skoog) là môi trường nuôi cấy mô thực vật được

sử dụng phô biến nhất, tùy vào nhu cầu từng loại cây, mục đích nuôi cấy có thé sử dụng

môi trường 1⁄2 MS là môi trường MS có nồng độ khoáng chất giảm đi một nửa Ngoài

ra, việc b6 sung chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy cũng mang lại nhiềulợi ích Auxin và cytokinin là hai chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến trongnuôi cấy mô (Hussain và Khan, 2007) BA là chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhómcytokinin có tác dụng kích thích sự hình thành đỉnh sinh trưởng, IBA là chất điều hòa

phân chia tế bào, có thé kết hợp với các cytokinin dé tăng sự tạo rễ Đồng thời, auxincũng có vai trò quan trọng trong việc hình thành mô sẹo, được sử dụng phô biến nhất là

2,4-D.

Bên cạnh chất điều hòa sinh trưởng, dịch chiết hữu cơ cũng được sử dụng rộng

rãi trong nuôi cấy mô thực vật dé kích thích sự phát triển của tế bào, mô và cơ quan có

thé kề đến như nước dừa với những ưu điểm: an toàn, dễ tìm kiếm và tiết kiệm chi phí.Tuy nhiên, tùy vào nhu cau của từng loại cây khác nhau cần tiễn hành thí nghiệm dé tìm

ra môi trường phù hợp nhất

Chính vì những lý do trên, dé tài “Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D, nước dừa, IBA,

BA đến sự tạo sẹo, nhân nhanh chỗi va tạo rễ cây hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida)

trong nuôi cây in vitro đã được tiến hành

trường thích hợp cho việc nhân nhanh giống cây Dạ yến thảo bằng phương pháp nuôi

cay mô in vitro

Giới hạn

Đề tài chỉ thực hiện nuôi cấy mô giống cây Dạ yến thảo ở giai đoạn tạo sẹo, nhân

nhanh chồi và tạo rễ (4 tháng) tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Di Truyền - Giống,Trại thực nghiệm khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng

05 năm 2023 đến tháng 10 năm 2023

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Dạ yến thảo vốn là loài đặc hữu của Nam Mỹ, phân bồ chủ yếu ở vùng cận nhiệt

đới với nhiệt độ từ 22°C - 39°C Sự đa dạng về loài chủ yếu tìm thấy ở vùng Serra của

Brazil, nơi tìm thấy loài Petunia integrifolia và Petunia axillaris được xem là nguồn gốccủa Petunia hybrida (Dạ yến thảo), ngoài ra Petunia còn được tìm thay ở nhiều Argentia,

Uruguay, Paraguay va Bolivia (Joao và ctv, 2009).

Ngày nay, các loài thuộc chi nay đã có nhiều phân hóa về đặc điểm hình thái vađiều kiện thích nghi Nhiều loài có thể sống tốt ở các điều kiện khí hậu khác hoàn toàn

so với tổ tiên nó Do quá trình thuần hóa của con người và di thực nên các loài thuộc chiPetunia đã phân bố ngày càng rộng rãi tiêu biểu như loài Petunia hybrida (Joao và ctv,

Tên tiếng anh: Petunia

Tên khoa học: Petunia hybrida

1.1.3 Đặc điểm thực vật học

Dạ yến thảo là cây hang năm, ưa sáng, thân cao từ 15 - 30 cm có lông min baoquanh, phân nhánh từ nách lá Lá đơn hình oval, mọc đối hay luân phiên, có phủ lớp

lông mịn mềm mại, mép lá không có răng cưa Hoa lưỡng tính , hình phễu Ngày nay,

do sự lai tạo đã cho ra đời nhiều dạng hoa như cánh đơn, cánh kép với mép có viền và

gon sóng hoặc mép đúng có hình cung nhọn ở giữa Hoa có đa dang mau tím, trang, đỏ,cam, xanh nhạt pha đỏ, có mùi thơm dịu (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006)

Dạ yến thảo thích nghi được với hầu hết các loại đất, pH từ 6,0 - 7,0 Cây thích

hợp với khí hậu ôn hòa, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng, không chiuđược ngập lụt hay khô han, đa số các loài thuộc chi này ưa nhiệt độ lạnh, ưa độ ẩm

nhưng không được ngập, cây nhạy cảm với ánh nắng trực tiếp (Lê Hồng Thủy Tiên,

2006).

1.1.4 Một số loại hoa Dạ yến thảo

Dựa vào hình dạng hoa có thể chia hoa Dạ yến thảo thành 2 loại:

Dạ yến thảo hoa đơn (Multiflora): loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam, cũng

là loại phố biến nhất Hoa đơn sắc, có hình đáng giống như chiếc loa nhỏ, hoa nở dày

và liên tục Cây thân thảo chiều dai được khoảng 80 - 100 cm, phát triển bò ngang, thích

lên đến 5 - 7,5 cm

Dạ yến thảo kép (Grandiflora): có màu sắc sặc sỡ, hoa to gồm nhiều lớp cánh xếpchồng lên nhau, có sự hòa trộn màu sắc trên cùng một hoa Cây thân bụi, cứng cáp hơn

dạ yến thảo đơn, phát triển thang đứng, chiều cao từ 30 - 50 cm

1.2 Tình hình trồng và nhân giống Dạ yến thảo ở Việt Nam

Cây Dạ yến thảo với màu sắc và kiêu dáng hoa đa dạng, bắt mắt nên đã được ưachuộng dùng làm hoa cảnh trang trí trong nhiều kiêu không gian khác nhau như phòngkhách, ban công, vườn hoa, tiểu cảnh sân vườn Trong những năm gan đây, các nhàvườn trồng cây cảnh đặc biệt quan tâm đến loại cây này vì nó mang lại hiệu quả kinh tếcao, được thị trường ưa chuộng Ở Việt Nam, Dạ yến thảo được trồng nhiều nơi như ĐàLạt, Thành phố Hồ Chí Minh, Sa Déc (Đồng Tháp) chủ yếu là các giống có thé thích

nghi với điều kiện khi hậu ở nước ta Tuy nhiên, để có giống hoa đẹp các nhà vườn

thường nhập các giống mới từ các nước như Trung Quốc, Đức, Nga hoặc Ba Lan có hoa

nhiều loại màu Mặc khác người dân cùng nhân giống cây hoa này bằng cách giâm cành

và sử dụng cây con từ quá trình nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, trồng được cây Dạ yếnthảo dé cây khỏe mạnh đến khi ra hoa yêu cầu nhà vườn có nhiều kinh nghiệm Da sốcác giống Dạ yên thảo trên thị trường rất khó dé canh tác, khâu xử lý hạt giống cho naymầm khá khó, phương pháp giâm cành thì đòi hỏi nhiều kĩ thuật của người trồng (Lê

Hồng Thủy Tiên, 2006)

Dạ yến thảo là cây ưa mát, ưa ẩm, những không ưa được ngập úng, cây khôngchịu được khi thời tiết khô nóng, cây sau khi mất nước có tưới lại cũng khó hồi phục dothân cây rỗng xốp, lá mỏng (Lê Hồng Thủy Tiên, 2006) Dé phục vụ cho nhu cầu thưởnghoa cũng như phát triển ngành trồng hoa cảnh ở Việt Nam, cần có những giống Dạ yếnthảo đa dang về màu sắc với khả năng thích nghỉ tốt, dé chăm sóc hon

1.3 Tổng quan về nuôi cay mô tế bào thực vật

1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cây mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả nuôi cấy tất

cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi trường

dinh dưỡng thích hợp (Bùi Bá Bồng, 1995) Tế bao nuôi cấy phải là các tế bào có nhân

hoàn chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích hợp cóthé phân hóa thành cây hoản chỉnh Các hệ thống nuôi cay mô thực vật thường đượcdùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa, di

truyền học và cấu trúc thực vật Hiện nay, kỹ thuật này cũng được sử dụng nhiều trong

nhân giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh, đặc biệt là các loài thực vật quý, có giátrị cao (Bùi Bá Bồng, 1995; Nguyễn Đức Thành, 2000; Nguyễn Quang Thạch, 2009)

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm một số phươngpháp như sau:

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chéi bên Sau khi vôtrùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có

thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu

sẽ phát triển thành một chéi hay nhiều chồi Chi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và

rễ dé trở thành một cây hoàn chỉnh

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, phát triển nhanh trên môi trườnggiàu auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiệnmôi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cây trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độđiều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ, gọi là tế bào đơn Sau đó, tế

bao đơn được chọn lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp dé phát triển, tăng sinh

khối

Nuôi cấy Protoplast

Protoplast (tế bao tran) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiệnnuôi cấy thích hợp Protoplast có khả năng tái sinh màng tế bảo, tiếp tục phân chia và táisinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật) Khi tế bào mắt vách và tiến hànhdung hợp, hai Protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính nàycho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp Protoplast có thé được thực hiệntrên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

Nuôi cấy bao phan va hạt phan

Kỹ thuật nuôi cay bao phan và hạt phan là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH,

double haploid) Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo

giống có hiệu quả cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra biến đị đitruyền như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo Đây là kỹ thuật có hiệu quả cao trongchọn giống cây trông, nhất là với cấy trồng cho hạt như lúa

1.3.2 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt G (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ

của một cơ thé sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé

hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bảo riêng rẽ đã phân hóa đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thé sinh vật đó Khi

gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh

Đó là tính toàn năng của tế bào

1.3.3 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bao thực vật in vitro thực chat

là kết quả của sự phân hóa và phản phân hóa tế bao

Quá trình phân hóa tế bào gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào, giai đoạn giãn

và giai đoạn phân hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyên các tế bảo phôi sinh thành các

tê bao mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau cua cơ thê.

Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy tế bao thực vật là các tế bào đã phân hóachức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo Sau đó, các tế bào mô sẹo táisinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó tái tạo thành cây hoàn chỉnh

- Tế bào phân hóa chức năng > Tế bào giãn —> Tế bảo mô sẹo (Nguyễn Bao

Toản, 2004).

1.3.4 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cây mô thực vật gồm các sự kiện

nôi bật như:

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật déchứng minh tính toàn năng của tế bao thực vật Tuy nhiên, ông đã gặp thất bại khi cố

găng nuôi cây các tê bao đã chuyên hóa được tách ra từ lá một sô cây một lá mâm.

Năm 1922, Kotte và Robins đã lập lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành

công trong việc nuôi cay đỉnh sinh trường của rễ một cây họ hòa thảo

Năm 1934, White nuôi cây thành công đầu rễ cà chua trong môi trường lỏng có

chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nam men trong một thời gian dai Sau đó, ông

đã thay thé hoàn toàn phù hợp dịch chiết nam men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhómB: Thiamin (B1), Pyridxin (B6) va Nicotinic acid Kê từ đó, việc nuôi cay dau ré trong

Trong cùng khoảng thời gian này, Went và Thimann đã phát hiện ra chất điều

hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid)

Năm 1939, Nobecourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng

mô sẹo cà rôt trên môi trường thạch agar.

Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được tác dụng kích thích sinh trường của

nước dita trong nuôi cấy cây thuộc họ ca

Năm 1948, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhân tạo đuọc nghiên cứu

và tông hợp thành công như Naphthy acetic acid (NAA) và 2,4 Dichloruaphenoxy

acetiic acid (2,4-D) Nhiều nhà nghiên cứu nhận ra rang NAA va 2,4-D cùng với nướcdừa sẽ giúp cho sự tạo mô sẹo, cảm ứng được sự phân chia tế bào ở nhiều đối tượng mà

trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1954, Skoog tìm ra được chất điều hòa sinh trưởng từ tinh dich cá be là

6-Furfurylaminopurine va đặt tên là Kinetin do có tác dụng kích thích sự phân bào Việc

phát hiện vai trò của NAA, IAA, 2,4-D va Kinetin cùng với các vitamin và nước dừa có

ý nghĩa rất quan trọng giúp cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy thực vật có thànhphần hóa học được xác định rõ ràng, ôn định dẫn đến bước phát triển tiếp theo của lĩnh

vực khoa học này.

Năm 1957, Skoog và Miller đã ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo

thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ kệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy Khi giảm

thấp tỷ lệ kinetin/auxin sẽ xảy ra sự tạo rễ từ mô sẹo, ngược lại dẫn dến sự tạo chỗồi ở

mô sẹo.

Năm 1954 đến 1959, kĩ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được tiến hành

Muir, Hildebrandt và Riker đã tách tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách

sử dụng máy lắc

Năm 1960, Bergman cho rằng có thé dùng phương lọc đơn giản dé thu được hauhết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường,tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman,nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh

men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bàotròn, không vỏ bọc, gọi là protoplast.

Vào đầu những năm 1970, Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các

protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia va tạo nên một quan thé tế

bào trong môi trường lỏng.

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội bằng cáchnuôi cấy túi phan cây cà độc được Năm sau, Bourgin và Nitsch tạo thành công cây đơnbội từ túi phấn cây thuốc lá

Từ năm 1980 đến năm 1992 có nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệgen thực vật đã được công bồ

Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn

giông, nhân giông, vào việc sản xuât các chât thứ câp có hoạt tính sinh học và vào nghiên

cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.

1.3.5 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được sử dụng trong các chương trình chọn giốnghiện đại Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cay mô đã trở thanh một trong

những lãnh vực được quan tâm rất nhiều trong ngành trồng trọt Nuôi cay mô đã và đang

có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân giống và chọn giống cây trồng,góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Nguyễn Đức Lượng,

2006).

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến

kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học,Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiêncứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy baophan, nuôi cay mô sẹo và protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao 6 phan lúa vàthuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thi Muội va ctv, 1978) Tiếp đó là thành côngnuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978) Phòng thí

đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt

Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã có rất nhiều phòng thínghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền NôngNghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), ma có cả ở một số tỉnh và cơ

sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật

phát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giốngkhoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm

Nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào

kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mat nước (NguyễnTường Vân va ctv, 1994; Dinh Thị Tong va ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bao

trần, chuyền gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993)

Nuôi cay bao phan dé tao dong thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ SinhHọc và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồnnguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đangđược phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi

thu hoạt chất phục vụ nganh mỹ phẩm và y dược Tạo thành công mô seo/ré bất định haicây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thất nhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuấthợp chất thứ cấp Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu của Việt Nam (Bích

Diệp, 2014).

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay được sử dụng trong các chương trình chọn

giống hiện đại Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đã trở thành mộttrong những lãnh vực được quan tâm rất nhiều trong ngành trồng trọt Nuôi cay mô đã

va đang có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân giống và chọn giống câytrồng, góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Nguyễn Đức

Lượng, 2006).

1.4 Nhân giống in vitro

1.4.1 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro có những ưu điểm vượt trội hơn so với phương

pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép ) như:

- Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ

- Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thé ban đầu trong một thời gian ngắn

ra các cây con sạch bệnh.

- Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết cũng như kiện

ngoại cảnh.

- Một giống cây quý có thé được nhân ra nhanh chóng đưa vào sản xuất

- Việc trao đôi giông quôc tê các nguôn gen sạch bệnh nuôi trong ông nghiệm

được thực hiện dễ dàng

- Thông qua nuôi cây mô có thể ứng dụng việc chuyên gen cho những thực vậtbậc cao đề chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bồng, 1995)

Bên cạnh những ưu điểm được ké trên, phương pháp nhân giống in vitro cũng có

một sô nhược điểm như sau:

- Phương pháp nhân giống in vitro là một kỹ thuật phức tạp đòi hỏi kỹ thuật cao

và trang thiết bị hiện đại dẫn đến chi phí đầu tu ban đầu khá cao, bao gồm chi phí chotrang thiết bị, môi trường nuôi cấy và nhân công

- Quá trình nhân giống in vitro gồm nhiều giai đoạn thường mat nhiều thời gianhơn so với các phương pháp nhân giống truyền thống

- Dễ xảy ra đột biến do sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng vào môi trườngnuôi cấy dẫn đến cây giống ít đồng nhất về kiểu hình

1.4.2 Các giai đoạn của quá trình nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), quá trình nhân giống in vitro được chia thành

các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở giai đoạntăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu cấy Một phần thích hợp của thực vật được khử trùngchuyên vài môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Những mẫu cấy còn sống saukhi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3

Giai đoạn 3: Tăng sinh Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thểbang sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bat định Các chỗi tăng trưởngmạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyên sang giai đoạn 4

Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro Những chổi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyênsang môi trường kích thích ra rễ Trong môi trường này cần phải bé sung auxin dé cảm

ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh

Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vivo Với những cây không ra rễ in vitro sẽ được

chuyên ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh

1.4.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô gồm:

Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cay mô - tế bao

thực vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng.

- Các nguyên tố đa lượng:

Nitơ (N): thường được sử dụng ở hai dạng nitrat (NO*) hoặc muối amoni (NH¿”)

riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SOx?

Photpho (P): Mô và tế bao thực vật nuôi cay có nhu cầu về photpho rất cao Chính

vì vậy photpho là một nguyên tổ cần thiết của môi trường và thường được đưa vào môi

trường ở dạng orthophotphat hoặc đường photphat Ngoài ra khi photpho ở dạng HaPOa

và HPO, còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ồn định pH của môi trường trong

quá trình nuôi cấy

- Các nguyên tố vi lượng: Ngoài các nguyên tố khoáng đa lượng, trong môi

trường còn cần các nguyên tố vi lương là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co

Nguồn cacbon

Hầu hết các mô nuôi cấy là di dưỡng, không có khả năng tổng hợp cacbon Vì

vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Trong

phan lớn các môi trường, nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là saccarosevà glucose

là nguồn cacbon tốt nhất Ở một số mô thì có thé ding mantose, fructose va galactose

Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bảo thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tựtong hợp được hau hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng do đó phải bổsung thêm vào môi trường một số vitamin, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B nhưvitamin B1, B3, B5, B6, axit nicotinic, mesoinosit Vitamin B1 được coi là vitamin thiết

yếu đối với sự sinh trưởng của tế bao thực vật (Riley, P S và ctv, 1972)

Các nhóm chất bỗ sung

Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng nhiều dung dịchhữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như: nước dừa, dịch chiết nắm men nhằm

tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy Trong nuôi cấy có trường hợp

người ta sử dụng cả than hoạt tính như một chat phụ gia, kết quả nghiên cứu của Fridborg

và cộng sự (1978) cho thấy than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất tiết ra từ mô cấy,

vỏ bao phan và làm tăng hiệu suất sinh phôi (G Fridborg va ctv, 1978)

Chất độn (thạch - agar)

Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường Theo nghiên cứu

của Bhojwani va Razdan (1983), khi nồng độ của agar cao, môi trường trở nên cứng, sựkhuếch tán của các chất dinh dưỡng như hap thụ của mô gặp khó khăn Da số nuôi cấy

phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào loài cây mà sử dụng

cho phù hợp.

1.4.3 Các chất điều hòa sinh trường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nước dừa

Công bồ đầu tiên về sử dụng nước dita trong nuôi cay mô thuộc về Van Overbeek

và ctv, (Van Overbeek và ctv, 1941; Van Overbeek và ctv, 1942) Sau đó, tác dụng tích

cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả

ghi nhận.

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chấtkích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa đã được sử dụng dékích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bao thành công ở nhiều đối tượngthực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh, 2004)

Một lit nước dừa có 40 g glucid, 2 - 3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meqkalium, 2 meq natrium, 45 meq clor, 7 meq calcium, 6 meq magie va các yếu té viluong nhu sat, mangan, lithium), vitamin, hau nhu không có lipid va có rất ít sinh tố.Nước dừa thường được lấy từ qua của các giống và cây chọn lọc dé sử dụng tươi hoặc

sau bảo quản.

Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến

và bảo quản Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó đượclọc qua mang lọc dé khử trùng trước khi bảo quản lạnh

T6n dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô

hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thé dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất

cặn có thê được lọc bỏ hoặc đề lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thườngđược sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v)

Auxin

Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa học là C¡oHsOaN, auxin tựnhiên được tìm thay ở nhiều thực vat là indol axetic acid (IAA) IAA có các dan xuất là

1- Naphthalene axetic acid (NAA) va 2,4 - Dichlorophenoxyaxetic acid (2,4D) NAA

được Went và Thimann phát hiện năm 1937 va là một Auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh

hơn auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đangphát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mam (Trinh Xuân Vũ va ctv, 1976)

Ung dung:

Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bat định trên cành giâm, cành chiết và trên

mô nuôi cấy Trong nuôi cay mô, auxin (NAA, IBA) cũng có tác dụng tao tạo rễ rat tốt

Dé tăng đậu qua, tăng sinh trưởng của quả và tao quả không hạt, người ta xử lý

auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho

một số cây trồng như ca chua, cam, chanh

Dé kéo dai sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dich NAA(10-20 ppm) (Nguyễn Văn Uyên, 1989)

Cytokinin

Năm 1955, Skong va Miller tách ra từ 500g DNA (acid deoxyribo nucleic) của

tinh dich cá trích (Clupea) một chat kết tinh và có hoạt tính đối với mô tủy cây thuốc lá

và đặt tên là Kinetin Cytokinin là chất điều hòa tăng trưởng có tác dụng làm tăng sựphân chia tế bào Cytokinin thường gặp là Kinetin và Benzyl adenine (BA) Cytokinin

được vận chuyền từ mô phân sinh đỉnh rễ (nơi tổng hợp nhiều Cytokinin trong cây) Do

đó, Cytokinin có hàm lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976)

Ứng dụng:

Cytokinin là một chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế

bào Cac cytokinin thường gặp là Kinetin, 6-Benzyl aminipurin (BAP) (Nguyễn Đức

1.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Dạ yến thảo

Theo nghiên cứu in vitro của Vũ Thị Thu Trang (2019), giống Dạ yến thảo képmàu đen và hồng viền trắng thích hợp với môi trường chứa 0,3 mg/L BAP, hệ số nhânchôi lần lượt là 3,4; 3,6 còn giống màu hồng thích hợp tại môi trường 1⁄2 MS Thí nghiệmvới đường và nước dừa không cho hệ số nhân chéi cao trong cả ba giống Dạ yến thaokép, môi trường 1⁄2 MS bồ sung 10% nước dừa tốt nhất cho chiều cao chéi giống Dạ yếnthảo kép màu den là 5,4 cm, đối với hai giống Dạ yến thảo kép mau hồng có chiều caochi tốt nhất (4,2 em) và Dạ yến thảo kép viền hồng có chiều cao chồi tốt nhất (4,0 cm)tại môi trường 1⁄2 MS Môi trường 1⁄2 MS không bổ sung NAA cho bộ rễ 6n định nhấtđối với ba giống Dạ yên thảo kép Giống màu hong viền trắng có khả năng sinh trưởng

và thích nghỉ tốt nhất, tỷ lệ ra cây sống sau khhi ra ngôi đạt hơn 93%

Theo Habas và ctv (2019) cho thấy số lượng rễ cao nhất được ghi nhận khi bốsung 0,3 mg/L BAP + 0,5 mg/L IBA (15 rễ/ mẫu) Rễ dai nhất (2,6 cm) được ghi nhậntrên môi trường MS có bồ sung 0,6 mg/L BAP + 0,1 mg/L IBA

Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị cúc va ctv (2017), môi trường MS có bổsung 30 g/l succrose, 6 g/l agar, 0,75 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA với hệ số nhân chéi

đạt 73,11 lần, chiều cao trung bình đạt 2,63 cm sau 5 tuần nuôi cay

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thùy Vân (2015) đã cho thấy khi xử lýmẫu sơ bộ dưới vòi nước sạch, rửa bằng cồn 70% trong 2 phút, lắc mẫu với Javen 5%trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất 2-3 lần, làm khô mẫu trên giấy lọc khử trùng cho

18 hiệu quả khử trùng đạt 38%, môi trường MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l agar +

Img/L BAP với hệ số nhân chồi là 103, môi trường MS + 30 g/l đường saccarose + 8g/lagar + 5%, 10%, 15% nước dừa tạo mẫu cấy nhiều chồi hơn môi trường MS cơ bản

Theo nghiên cứu Thenmozhi M và Sivaraj R (2011), bô sung nồng độ 1,5 mg/L

2,4-D vào môi trường MS thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo với tỷ lệ cảm ứng mô sẹo

là 100%.

Năm 2010, Phạm Văn Lộc đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Dạ yến thảokết quả cho thấy tỷ lệ mẫu sống tốt nhất được khử trùng bằng javel nồng độ 40%, môitrường thích hợp cho quá trình hình thành chồi của lá Dạ yến thảo là môi trương MS b6sung 1,5 mg/L BA, nồng độ 1,0 mg/L 2,4-D cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất ở mẫu lá, môi

trường tái sinh chôi tốt nhất là môi trường MS có bé sung 0,8 mg/L BA, môi trường có

bồ sung 0,8 mg/L IBA kết hợp với 0,1 mg/L GA: tốt nhất dé tăng trưởng chéi và tạo rễ

Như vậy, việc nhân giống Dạ yến thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro

đã được nghiên cứu và có cơ sở khoa học Căn cứ vào điều kiện thực tế và nhu cầu thực

tiễn, đề tài: “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và môi trưởng đến sự hình thànhseo, chi và rễ cây hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida) trong nuôi cay mô in vitro ” đã

được thực hiện.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 05 năm 2023 đến 10 năm 2023 tại PhòngNuôi cấy mô Bộ môn Di truyền - Giống - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông LâmThành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Giống

Giống được sử dụng đề thực hiện thí nghiệm là cây hoa Dạ yến thảo kép đã phân

cành dải 10 - 15 cm và chưa ra hoa được mua từ Công ty cô phần Sài Gòn Hoa

Hình 2.1 Cây và lá của cây Dạ yến thảo

2.2.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

Môi trường dinh dưỡng khoáng MS cải tiến theo nghiên cứu của Murashige vàSkoog (1962), có bé sung các chất điều tiết sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.1 Thành phần môi trường được sử dụng trong thí nghiệm

Môi trườngKhoáng chất Thành phần ‘Geka alee Y% MS (N ong độ

wer khoang chat mg/L) NH4NOs3 1650 825

KNO3 1900 950

Khoang da luong CaCl2.2H20 440 220

MgSOx.7HaO 370 185 KH2PO4 170 85 MnSOq.H20 23,3 11,65 ZnSO4.7H20 8,6 4,3 H3PO3 6,2 yl Khoáng vi lượng KI 0,83 0,415

Na2Mo04.2H20 0,25 0,125 CuSO4.5H20 0,025 0,0125 CoCl2.6H20 0,025 0,0125 , Na2.EDTA 37,3 18,65

Sat EDTA

FeSO4.7H20 27,8 13,9 Myo-Inositol 100 50 Thiamine (B1) 0,1 0,05 Vitamin Nicotinic acid (B5) 0,5 0,25

Pyridoxine HCl (B6) 0,5 0,25

Glycine 2 1

Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5,8 bằng NaOH IN va HCI IN trướckhi hấp khử trùng Môi trường nuôi cấy thường được hấp khủ trùng trong nồi hấp(autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa Thời gian hấp từ 15 phút ở ápsuất hơi bão hòa là 13,4 kPa (1 atm) tương đương với nhiệt độ 121°C Ở nhiệt độ 121°C,

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng:

- BA độ tinh khiết > 99% (hãng Biobasic - Canada)

- IBA độ tinh khiết > 98% (hãng Biobasic - Canada)

- 2,4-D độ tinh khiết > 99% (hãng Biobasic - Canada)

- Nước dừa: sử dung trong thí nghiệm là nước dừa non của giông dừa Xiêm xanh

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối

Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, chai thủy tinh (loại 100 ml và

500 ml), đĩa petri, nút bông, giấy báo, giấy thâm, giấy bạc, túi nilon, đao, khay cấy,

panh, kéo

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo

mô sẹo của mẫu cây Dạ yến thảo

Mục tiêu: Xác định được nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo mô sẹo

Vật liệu thí nghiệm: mẫu lá của cây Dạ yến thảo được khử trùng được cắt với

kích thước 1,0 cm x 1,0 cm.

Môi trường nền: Môi trường được sử dụng là môi trường MS có bổ sung 8 g/lagar, 30 g/l đường saccarose.

Quy trinh khir tring mau

Mau được rửa sạch nhiêu lân dưới vòi nước may, tiép đó rửa trong dung dich

nước xà phòng và rửa lại bằng nước cat 2 — 3 lần, đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng

Bước 1: Rửa chéi bang nước cat vô trùng

Bước 2: Lắc mẫu với etanol 70% (v/v) trong 1 phút

Bước 3: Rửa lại bang nước cat vô trùng 3 lần

Bước 4: Lắc mẫu với NaOCl 5% trong 5 phút và 2 giọt Tween - 20/100ml nướccat dé tăng hiệu qua khử trùng

Bước 5: Rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng

Bước 6: Cắt rời từng lá và thấm khô bằng giấy thấm, sau đó tiến hành cắt mẫuvới kích thước 1 em x 1 cm, cấy vào môi trường nền bồ sung 2,4-D với nồng độ tương

ứng với thí nghiệm.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn

Tổng số mẫu: 1x 25 x 5 x 3 = 375 mẫu

Phương pháp va chỉ tiêu theo doi

Các chỉ tiêu được theo déi 7 ngày/ lần và theo dõi trong 4 tuần:

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = (số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu) x 100

Trọng lượng tươi của mô sẹo (mg): dùng cân điện tử dé cân trọng lượng tươi của

mô sẹo 28 NSC

Hình thái, màu sắc mô sẹo: đánh giá dựa vào cảm qua qua ba tiêu chí sau:

- Mô sẹo xấu: mềm, bở, mau vàng nâu

- Mô sẹo trung bình: cứng, chắc, màu vàng nhạt

- Mô seo tốt: cứng, chắc, màu vàng xanh

2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả

năng nhân nhanh chỗi Dạ yến thao in vitro

Mục tiêu: xác định được môi trường và liều lượng nước dừa phù hợp đến khảnăng nhân nhanh chồi Dạ yến thảo

Vật liệu: sử dụng đoạn chéi Dạ yến thảo được chuẩn bị sau khi thực hiện TNI

cao 1,5 cm.

Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm hai yếu gồm 8 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoản toan ngẫunhiên (CRD) với 3 lần lặp lại, trong đó:

Yếu tố A: môi trường (MS, 1⁄2 MS )

Yếu tố B: nước dừa (0 ml/L, 100 m1/L, 150 ml/L, 200 ml/L)

Bảng 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm 2

Nước dừa (ml/L) Môi trường

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi 5 chai/NT gồm 10 mẫu, các chỉ tiêu được theo déi 7 ngày/lần và theodõi trong 6 tuần

Số chéi (chdi): đếm tat cả các chdi trên cùng gốc

Số lá/cụm chỗi (1á): đếm tổng số lá/trên cụm chdi

Chiều cao chéi (cm): dùng thước do từ bề mặt thạch đến đỉnh chồi

Trọng lượng chồi (g): dùng cân điện tử dé cân trọng lượng chéi ở thời điểm 42

Bang 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm 3

Nang độ IBA Nong độ BA (mg/L)

NT6 | NII | NTS | NI7 | NI2 | NTO | NI8§ | NI2 | NT4

NT9 | NI4 | NT3 | NTO | NI4 | NT1 | NI7 | NTS | NT§

Phương pháp và chỉ tiêu theo dõi

Số liệu được thu thập, xử lý, tổng hợp tính toán sơ bộ bằng phần mềm Microsoft

Excel, phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phân hạng LSD bằng phần mềm

R (4.2.0).

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D thích hợp trong quá trình tạo mô sẹo của mẫucây Dạ yến thảo

Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin thường được bồ sung vào môi trường nuôi

cay dé tạo sẹo với nồng độ tùy thuộc vào đặc tính, nhu cầu của mẫu cấy, loại cây Auxin

có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình thành sẹo Loại auxin được sử dụng

phổ biến nhất là 2,4-D

Mô sẹo sau khi hình thành phải đảm bảo khả năng tái sinh, vì vậy các chỉ tiêu về

tỷ lệ tạo sẹo, hình thái, mau sắc và khối lượng mô sẹo là rất cần thiết dé đánh giá vàchọn lọc loại mô sẹo thích hợp Chính vì thế, ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự tạo

mô sẹo ở mẫu lá cây Dạ yến thảo được tiến hành Kết quả thu được như sau:

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

Ở thời điểm 7 NSC, các mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung 2,4-Dđều có sự hình thành sẹo, các mẫu nuôi cấy trên môi trường không có bồ sung 2,4-D laikhông có sự hình thành sẹo Điều đó chứng tỏ sự có mặt của 2,4-D là cần thiết cho sự

hình thành seo Cụ thé, nghiệm thức có bé sung 1,5 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ mẫu tạo mô

seo cao nhất đạt 49,3% tuy nhiên không có sự khác biệt so với nghiệm thức bồ sung 1,0mg/L (33,3%) và 2,0 mg/L 2,4-D (36,0%) nhưng sự khác biệt rất có ý nghĩa so vớinghiệm thức bồ sung 0,5 mg/L 2,4-D (21,3%)

Mẫu lá Dạ yến thảo đạt tỷ lệ tạo sẹo cao nhất được bố sung nồng độ 1,5 mg/L

2,4-D (69,3%), khác biệt không có nghĩa so với mẫu lá được bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D

(56,0%) và 2,0 mg/L 2,4-D (61,3%) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức

bồ sung 0,5 mg/L 2,4-D (37,3%) thời điểm 14 NSC

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) của mẫu cây

đạt 50,7% Đồng thời, mẫu lá bổ sung 0 mg/L 2,4-D ở thời điểm này vẫn không xuất

hiện mẫu tạo sẹo.

Tỷ lệ mẫu tạo sẹo ở các mẫu lá Dạ yến thảo sau 28 NSC được thé hiện rõ ràng,

tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất (98,7%) ở nghiệm thức bé sung 1,5 mg/L 2,4-D sự khácbiệt rat có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại

Kết quả này cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo phù hợp với nghiên cứu của Thenmozhi,

M và Sivaraj, R (2011) đã xác định môi trường MS bồ sung 1,5 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ

mẫu tạo sẹo la 100%.

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nồng độ 2.4-D đến khối lượng và hình thái, màu sắc môsẹo của cây Dạ yến thao 28 NSC

Nông độ 2,4-D Khối lượng mô sẹo :

Hình thái, màu sắc mô sẹo

CV (%) 12,6

F tinh 120,0”

Trong cùng một cột, các số có cùng kí tự đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, **: khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê; (-): không tạo mô seo

Khối lượng mô sẹo và hình thái, màu sắc mô sẹo

Thông thường, mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin Khối lượng

mô sẹo ở thời điểm 2§ NSC khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê, trong đó khối lượng

mô seo cao nhất (489,1 mg) ở nghiệm thức bồ sung 1,5 mg/L 2,4-D Khối lượng mô seo

có xu hướng tăng khi tăng nồng độ 2,4-D từ 0,5 mg/L đến 1,5 mg/L với khối lượng

tương ứng là 77,6 mg đến 489,1 mg cho mô sẹo cứng, chắc có màu từ vàng nhạt đến

vàng xanh Nhưng khi tiếp tục nồng độ 2,4-D thì khối lượng mô sẹo giảm xuống đáng

kể, cụ thể mô sẹo khi được bé sung 2,0 mg/L 2,4-D có khối lượng là 345,0 mg mô sẹo

có dấu hiệu chai, cứng và hóa nâu một phần trong khi xung quanh viền mềm, bở, cómảu trắng đục Điều này chứng tỏ, 2,4-D không chỉ có ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo macòn có những tác động khác nhau đến khối lượng, hình thái và màu sắc của mẫu lá Dạ

yến thảo

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến hình thái và màu sắc mô sẹo

Tóm lại, môi trường MS bồ sung 1,5 mg/L 2,4-D phù hợp cho quá trình tạo seo mẫu lácây Dạ yến thảo

3.2 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanhchéi Dạ yến thao in vitro

Nước dừa được sử dung cho nhiều loại cây trồng trong nuôi cấy mô in vitro, bỗ

sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy có ích cho việc nhân nhanh chdi Bên cạnh đó,

nước dừa là một chất phô biến, không có độc, an toàn, dé tìm kiếm, sử dụng nước ditagiúp giảm chi phí, giá thành cây giống in vitro

Ở thí nghiệm này, liều lượng nước dừa được bé sung từ 0 - 200 ml/L vào môitrường MS và 1⁄2 MS nhằm tìm được môi trường và liều lượng nước dừa thích hợp đápứng yêu cầu tạo được số chỗi cao, chéi khỏe, môi trường đơn giản, tiết kiệm nguyên liệu

sử dụng.

Qua theo dõi, nhận thấy ở tất cả các nghiệm thức 14 NSC bắt đầu xuất hiện chồi

ở các nách lá, mỗi nách mọc ra 1 - 2 chdi con Số lượng chồi và chiều cao chồi cũng bắtđầu có sự khác biệt giữa các nghiệm thức Theo đối và ghi nhận kết quả ở thời điểm 21

NSC.