Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả năng tái sinh từ lá và sự sinh trưởng của cây sâm cau in vitro (Curculigo orchioides Gaertn)

TÓM TATĐề tài nghiên cứu ‘Anh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả năng tái sinh chồi từ lá và sự sinh trưởng của cây Sâm cau in vitro Curculigo orchioides Gaertn’ đã được tiến hành tại phò

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 3k 3k 2s 3k sk 3k

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ BA, NAA DEN KHẢ NANG

TAI SINH TU LA VA SU SINH TRUONG CUA

CAY SAM CAU IN VITRO

(Curculigo orchioides Gaertn)

SINH VIEN THUC HIEN : PHAM THI THANH THUONGNGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 — 2023

Thanh phé Hồ Chí Minh, thang 08 năm 2023

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ BA, NAA DEN KHẢ NANG

TAI SINH TU LA VA SU SINH TRUONG CUA

CAY SAM CAU IN VITRO

(Curculigo orchioides Gaertn)

Tac gia

PHAM THI THANH THUONG

Khóa luận được đệ trình dé dap ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư Nông học

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

TS BÙI MINH TRÍ

TS PHAM MINH DUY

Thanh phố Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Con xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con và luôn ủng

hộ, tin tưởng, động viên cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi trên con đường thực hiệnước mơ của con.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ

Chí Minh đã giúp tôi hoàn thành con đường tri thức của minh.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa, các Thầy Cô khoa Nông học trườngĐại Học Nông Lâm Tp Hồ Chi Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trongsuốt thời gian học tập tại trường

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Thay Bùi Minh Trí và Thay Phạm MinhDuy, đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ em trongsuốt thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Sinh Lý — Sinh Hóa đã hỗ trợ vật tư, hóa chất,thiết bị để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến anh Thanh Hậu đã luôn cho em những lờikhuyên dé thực hiện đề tài, cảm ơn các bạn K19 Phi Yến, Quynh Chi, Minh Kha, ThànhThông, Minh Đức, Quyền Cước, Nhật Hào đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2023

Sinh Viên

Phạm Thị Thanh Thương

TÓM TAT

Đề tài nghiên cứu ‘Anh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả năng tái sinh chồi

từ lá và sự sinh trưởng của cây Sâm cau in vitro (Curculigo orchioides Gaertn)’ đã được

tiến hành tại phòng cấy nuôi mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý — Sinh hóaKhoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh từ thang 02/2023đến tháng 08/2023 Mục tiêu của nghiên cứu là xác định được nồng độ BA và NAAthích hợp đến khả năng tái sinh chồi từ lá cây Sâm cau, xác định được nồng độ NAA

thích hợp cho việc hình thành rễ của cây Sâm cau

Nghiên cứu đã tiến hành 2 thí nghiệm Thí nghiệm 1 là thí nghiệm tái sinh chéi từmẫu lá, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tổ gồm 12 nghiệm thức và 3lần lặp lại Yếu tố B là yếu tố nồng độ BA ở các mức: 0mg-L'1; 1,0 mg-L1; 2,0 mg-L;

ill

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮT -222¿225ccsccxkerrrrkkere Viiii

GIẾT TE ecsescxcecnnzssracsensenrsnncsnosnssa nce an es im ROR 1

Dat vấn AG ooo cecccccecccscsesecsesscecseseceescecsesececsucecsesececsusacsesesevsusacevsesersesevevsesecevsesevsesesesseseseees 1

ee 2

i TaanueeoaertoinsgBtopdttaggtrgtrtuoio0i0RISGEBDAIE0001H0AGbigiiforgfdidsyixigrrdiitgiraScimi 2Giới hạn đề tai eee eccececcececceececeeseesessesecseesesecsessssvsecesesescersssssessseseesassnsseeusatsaesaeaneeeeeees 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU 2222 2SSS2SE£2E£2E2E22E22522522522522222222222e, 31.1 TÔng quan về cũy SBI EĂNHsssseesseosesitonh chong 151 guibEGSSUERSEGSESSGGNNHEEGESEi00g808801800630.ag ni Ó

1.1.1 Danh pháp tên khoa học va phân loại thực vật học - -++e<+ex+xs+ 3

1.1.2 Ngudn gc va phan b6 n444 ẢẢ 31.1.3 Đặc điểm hình thái của cây Sâm Cau ccc cececcceccecseeseseeeseeseeseestesseesteseeseenteseeeesd1.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây sâm cau -2-©22©222222222E222E22EE22E2EE 2E crrrrrrree 41.1.5 Thành phần hóa học của cây sâm cau -2- 2¿©2++22++22++2E++2E++2Evsrrrsrrre 41.1.6 Gia tr] Của Gây SAM CÑU:isöc6s6n6 g1 10151040 001614615804010151681qẸC160161508133314 5661845614066 46 51.2 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật 2- 22 22222+222+222+2232273122112711221221221 22122 e2 51z2.1 Kiẩt HÌẾ HH caesesenensrrininsstietiGieGSEDIDSSGIEESNIGHSDEEDGISGSSNĐSSĐ0G4-01010100020133008000048030039/81580/04638 5

1.2.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vifro -: - 61.2.3 Các phương pháp nuôi cây mô tế bào thực vật -2- 22 2¿22z22z+2zzz2zz+2 71.2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 2 2©22+22222+E22E22E222122122122122221221121222222 2e 7

1.2.3.4 Nuôi cấy tế bào đơn 2©222222222222212212212212112112112112112112112112112112112121 xe 91.2.3.5 NuOi cay protoplast T:+ 91.2.3.6 Nuôi cấy hạt phan đơn bội 2 2+22+222EE+EE2EE2EE2E122122122122121121221222222222e2 9

1.2.4 Một số chất DHST trong nuôi cấy mô 2-22 22222++22+22++zztxvzzrrrzrrree 9122/461, l HC ÍÏLiasenesisesisedssinEcdtoDGiSSDH-AHA80AG GHHNSISGBEGESASEESEHSDIINHIGEESHEIG-SCBEGGS.1ã03080401228/81800D0n0.:30 9 L242 GWEOKIHIITT5setesgiBdite Si t8 4536158180033 0 G IGEGIIEDSLGHSNLSUĐXGEGRRSSISGHUESMSRSEAN83iRiBSsRiq8 101.2.5 Các bước chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật - 2-22 s+2sz5s2¿ 111.3 Một số nghiên cứu về Sâm cau trong và ngoài nước -: -2z-5+: 1213.1 Tỉnh.hình nghiền cứu ngoài HƯG¿¿:ssc<cissscsbozss114c611 0501036918 00212G60305861051638 1334338 38508 12 1.3.2) "Tinh bin 19 Hien Ci TONS THÔ as sen ss sai 62625138606 E266ã01466G638680ã00:053088040S828u.60260 15888 13Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU -+- 15đại NOI Guns tht TIEHIỂTẨHöscsoxøgias00000050100HG1NGGIGEGSERIDIGGEREEGEEQIGHISQQBE89-005G600-GGQAS4SQE8Đ38080186 152.2 Thời gian va địa điểm thí nghiQn 0.0.0 ccccccecceseessssseesessesseeseeseceessesseeseseeeseeseeees 153.3 miễn kiện Thí | ae 15

QUAN At liệu tht We NTS :ssz¿sii:12212:22812015600S01EA8ISSQGSHEĐLGSEGSIAgIGI1305040953B15GE2041005803B01018138033E 15

"8h ro 15

2.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm 2-2 22 2+2E22E+2EE22Ez+2xz2zz l6DAS Thí L bị, dung cụ vã Tiêu Chế kụccaadngteiciigigiiiGGLG0010001000600600048308338303608064024/2008 0 30:01 I

2.5 Phuong phap nghién cWU 1 17

2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến khả năng táisinh từ lá của cây Sâm cau ï7? ViÍfO : 2 S< St HH HH HH HH He 172.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự tạo rễ và sinh trưởng cây Sâm00/0/7220 20

Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -2-©22222222222222322212212222222 22c 233.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng táisinh từ lá của cây Sâm cau i7? VỈÍFO:: - «5< 25<<S<* E222 HH HH TH re 233.2 Thi nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành

ré va sinh trưởng cây Sâm cau IN VIẨTO 55+ S5 + *++*E*++EE++eEExrEEeseerrrerrrerrreerrrrre 39

Chương 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 22 22©22222xc2EEz2zEezrxrrrrrre 44TÀI LIEU THAM KHẢO 2-22 S22S2222S2SE22EE2EE2221223222122122122212212212221 21 45

6 - Benzyladenine

6 - Benzyle amino purine Cộng tác viên

Điều hòa sinh trưởng

Indole Butyric Acid Light-emitting diodeLần lặp lại

Murashige và Skoog

1 - Naphthalene acetic acidTuan sau cay

Nghiệm thức

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBảng 2.1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm (Murashige vàJ0 72017 16Bảng 2.2 Nồng độ BA va NAA bồ sung cho từng nghiệm thức trong thí nghiệm 1 18Bang 2.3 Các nghiệm thức với các nồng độ NAA tương ứng bổ sung vào môi trườngfrome: thí:rIphiŠ H2 -ecsss-zsesssessckaoicoinioieiabA1085280081565081855560001883038u860260is8G4a.480,5 880003060 EpdieklnGE0d8 20Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ BA và nồng độ NAA đến tỷ lệ mẫu lá Sâm cau hình thành

mô sẹo (%) ở các thời điểm khác nhau 2 22+ SE+SE£EE+E£EEEE+EEEE+EEEEEErEerErxrrxree 24Bang 3.2 Ảnh hưởng BA va NAA đến tỷ lệ mẫu chết của cây sâm cau từ mau lá in vitro

ee ea 26Bang 3.3 Anh hưởng của nồng độ BA va NAA đến kích thước mô seo hình thành từmẫu lá sâm cau thời điểm 10 TSC - 2-2 2+222222E+2EE2EE2EE2E22EE22122123222222222222.2e 29Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái mô sẹo hình thành từ lá cây Sâm cau sau 2 tuần, 4 tuần và

ni án 0 229

Bang 3.5 Ảnh hưởng nồng độ BA và nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi Sâm cau tại

%hỡi điềm Thiểp tham (99) reccrsccxactanesansassicsesnanasasissasinsinassansicsenssaascenonsseunaweusuaonninintasnanolBang 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BA đến số chéi của cây sâm cau từ

Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi của cây sâm cau từ mẫu

tý tiêi tiềm THỊ TP conser encase nernenmenereenncmmcennell TổBảng 3.8Ảnh hưởng BA và NAA đến khối lượng tươi của cụm chồi cây sâm cau từ mẫu1a in vitro thoi diém 10 TSC 11 38Bang 3.9 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến tỷ lệ ra rễ, chiều dài rễ, chiều cao cây, khốilượng tươi và khối lượng khô của cây sâm cau in vitro tại thời điểm 4 tuần sau cay 39Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến số lá của cây Sâm cau in vitro tại các thờiđiểm khác nhau 2-22-2333 SE2E5E2353585528232328535155555515512315125111111212121515151 511121555 ce2 42

Vil

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hinh 1:1 Cây SãƒH CA ceeeeiesesseiesienssssdisueieBstiiiliselSSSE56013885505E1S0019458383559800981107433558S84 3Hình 2 1 Sơ đồ bồ trí thí nghiệm L 22 222222222222E+2EE+2EE2EEzExzrrrrrrrre 18Hình 2.2 Mau lá Sâm cau trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy - - 19Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 2 2© 2+2222EE22EE22212271227122212271221122212221 e0 20Hình 53 Biff trường hồn HỆ eneeeueroedienndueennintoodaBurueil0013nugg6g0g060.3E.000/0ò%3.101448000d 28Hình 3 2 Mô seo Sâm cau ở tuần thứ 10 sau cấy 2-22 2222+22+22zc2x+zzxzzxcce 32Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến số rễ của cây Sâm cau in vitro 40Hình 3 4 Cây sâm cau ở tuần thứ 4 sau cấy, -2¿©2222+22+22+22E2E+22E2E+zzxcrrree 43Hình PL1.1: Mẫu cây Sâm cau 3 tháng tuôi ii 48

THấh PEL 2 Xiếu lÚi im cau Ti HIỂM ««eeeeeeeesninndinennediideinnooaniobinidortueoddgiskebiiiurestrsra 48

Hình PLI 3: Mau lá Sâm cau chết - 2-52 ©2222222E22E22EE22E222E222222122222122x re 48Hình PL1.4 May đo cường độ ánh sắng - - - +5 52+ * + E++vvereeerreerrerrrerrree 49

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là loài thảo được sống lâu năm, cóchứa nhiều hoạt chất được liệu quý và được dùng phố biến trong y học Nhiều nghiêncứu cho rằng trong cây sâm cau có chứa các polysaccharides, glycosides, sapogenin,alkaloid, v.v (Irshad và ctv, 2006) có thể được dùng làm thuốc trị ho, đau lưng, trĩ, vàng

da, đau bụng, lở loét (Đỗ Tất Lợi và ctv, 2004), chống loãng xương, làm thuốc bố tăngcường sinh lý (Cao và ctv, 2008), trị đái tháo đường, kháng khuẩn (Nagesh, 2008) Điềunày cho thấy, đây là loài thảo dược có giá trị cao và cần được phát triển

Trong khi đó sự đa dạng di truyền của cây sâm trên thế giới đang bị đe dọa ở mứcbáo động do các hoạt động thu hoạch và tàn phá quá mức phục vụ nhu cầu sản xuấtthuốc Ngoài ra, môi trường sống cho cây sâm cau đang ngày càng bị thu hẹp, suy thoái,

VL.

Cây sâm cau là loài thảo mộc chi phát triển trong tự nhiên vào mùa mua Cácphương pháp truyền thống như gieo hạt thường có tỷ lệ nảy mầm thấp, với kỹ thuật giâmthân rễ thì mỗi cây giỗng phải có một phan củ và phần ngọn mới đảm bao cây có thésống, nên hệ số nhân giống rất thấp, đây cũng chính là những yếu tố hạn chế cho việcnhân giống tự nhiên (Gupta và Chadh, 1995) Các kết quả nghiên cứu nhân giống invitro cây sâm cau từ các mau thân rễ, lá và chồi đỉnh đã được thực hiện và thành công ởmột số nghiên cứu (Suri va ctv, 1999; Thomas và Jacob, 2004; Nagesh, 2008; Nguyễn

Thị Lài và ctv, 2019; Trương Thị Bích Phượng và ctv., 2018) Trong khi đó, kĩ thuật

nhân giống in vitro từ lá thông qua tái sinh mô sẹo có tiềm năng tạo được nhiều chồi batđịnh hơn, cây có độ đồng đều cao hon và hệ số nhân chỗồi cao hơn nhiều so với cácphương pháp nhân giống truyền thống (Lê Văn Hòa và ctv,2012), hơn nữa, từ mẫu lácho phép thu thập mẫu cấy nhiều hơn đo đó ít gây hại cho cây mẹ Tuy nhiên, các ứngdụng kỹ thuật nuôi cay bang lá dé tạo ra mô sẹo trên Sâm cau còn hạn chế ở Việt Nam

Từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả năng

tái sinh từ lá và sự sinh trưởng của cây Sâm cau in vitro (Curculigo orchioides Gaertn)”

đã được thực hiện nhằm phục vụ nhu cầu cây giống duoc liệu trong nước

1

Thí nghiệm có phân tích thống kê.

Bồ trí thí nghiệm đúng nguyên tắc bồ trí thí nghiệm sinh học

Theo dõi sự sinh trưởng của Sâm cau in vitro thông qua chỉ tiêu về mô sẹo, sốchéi, chiều cao của chéi và số rễ, chiều dài rễ

Tạo được cây Sâm cau in vitro hoàn chỉnh, sinh trưởng đồng đều

Ghi nhận được hình ảnh trong các giai đoạn nuôi cấy

Giới hạn đề tài

Đề tải chỉ thực hiện chỉ thực hiện nuôi cây mô trên một giống sâm cau (Curculigoorchioides Gaertn) in vitro ở giai đoạn tái sinh va tạo rễ và đề tài chỉ mới sử dụng chấtđiều hòa sinh trưởng nhóm Auxin là NAA và nhóm Cytokinin là BA.Tại phòng nuôicay mô thuộc khu thực nghiệm bộ môn Sinh ly - Sinh hóa, Khoa Nông hoc, Trường Đạihọc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023

Chương 1

TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Tổng quan về cây sâm cau

1.1.1 Danh pháp tên khoa học và phân loại thực vật học

Theo Đỗ Tắt Lợi và ctv (2004) cây Sâm cau được phân loại như sau:

Loai: C orchiodes Hinh 1.1 Cay Sam cau

Nguồn: Cây thuốc Việt Nam (2006)

Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn

Tên Việt Nam: ngải cau, tiên mao, c6 nốc lan, thai lèng, Soọng cà (tiếng Tày), nam

sáng ton (tiếng Dao)

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Sâm cau phân bô ở một sô tỉnh phía nam Trung Quoc, Lào, An Độ và một vai nước

khác ở Đông Nam A Ở nước ta, Sâm cau mọc phô biên ở miền Bac và một sô huyện ở

tỉnh Lam Đồng (Đỗ Tat Lợi, 2006)

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây Sâm cau

Ré: Sâm cau là cây thân thảo sống lâu năm, chiều cao khoảng 20-30 cm Thân rễmập, hình trụ dài, mọc thang nhưng thóp lại ở hai dau, chiều dài rễ chính khoảng 5-25

cm, đường kính dao động trong khoảng 1,0 - 4,5 cm Bề mặt bên ngoài các rễ có màu

đen, mang nhiều rễ phụ có dạng giống thân rễ, bên trong có màu vàng nhạt, vị nhay va

hoi dang

Thân: Sâm cau thuộc loại thân ngầm hình trụ, dai

Lá: mọc thành túm từ thân rễ xếp nếp và có gân như lá cau, chiều dài dao động từ

15 - 45 cm, chiều rộng 2,5 - 3 cm Góc lá thuôn, đầu lá nhọn, hai mặt lá nhẫn, gân lá

song song, be lá to và dài Cuống lá dài khoảng 10 cm, hình dang gần giống lá cau

Hoa: Cụm hoa mọc trên một cán ngắn ở kẽ lá, mỗi cụm mang 3 - 5 hoa nhỏ, màuvàng Đài hoa có 3 răng, có lông, tràng 3 cánh nhẫn, nhị 6 xếp thành hai dãy, chỉ nhịngắn, bầu hình thoi, có lông rậm

Quả và hạt: quả nang, thuôn, dai 1,5 - 2cm, rộng 8 mm Bên trong quả có từ 1 - 4hạt, phình ở đầu, kích thước 1 - 2mm hạt màu đen Mùa hoa tré quả bat đầu từ tháng 5

- 7 (Đỗ Tat Lợi, 2006)

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây sâm cau

Sâm cau là loại cây ưa 4m, ưa sáng dù có thé hơi chịu bóng Sâm cau thường mọctrên những nơi đất còn tương đối màu mỡ trong thung lũng, chân núi đá vôi hoặc vennương rẫy Cây sinh trưởng tốt trong mùa mưa âm, phần thân rễ chính dạng củ, cắm sâuxuống đất, hoa quả hàng năm, khi già tự mở để hạt phát tán ra xung quanh

1.1.4 Thành phần hóa học của cây sâm cau

Thành phần hóa học của sâm cau với các nhóm chất chính bao gồm nhóm

phenolics, glycoside, Steroid, các Saponins thuộc nhóm cycloartane (Chauhan va ctv,

2010); flavons; alcaloids (Nie va ctv, 2013) Trong thân rễ sâm cau ở An Độ ghi nhậnchất khô chiếm 10,469%, ty lệ chất chiết trong côn là 3,036%, chất hòa tan trong nướcchiếm 22,666% (Yadav và ctv, 2016) Theo Wealth of India (1950) thân rễ sâm cau cóchứa đường tự do (7,56%), mucilag (8,12%), hemicellulose (12 - 15%), polysachharids(17,01%) Theo Trần Công Luận (2005), sâm cau Việt Nam có độ âm trung bình 8,26%,tro toàn phần chiếm 6,97%, hàm lượng tro tính trên chất khô kiệt là 7,63% Hàm lượng

tro không tan trong HCl là 0,8%, độ tro tính trên dược liệu khô kiệt là 0,86%.

Thanh phan hóa học của thân rễ sâm cau bao gồm các nhóm sau: Nhóm Steroid

va triterpenoid như curculigol (Chauhan và ctv, 2010); Nhóm Glycosid và saponin như

Curculigosid A, B, C, D (Valls va ctv, 2006); Orcinosid A, B, C (Wang va ctv, 2015;

Nhóm hop chat chứa Ni to như lycorin (Rao va ctv, 1978) Hàm lượng orcinol glucosidtrong sâm cau thu hai từ các vùng khác nhau ở Việt Nam đạt từ 0,14% đến 1,10%; Hamlượng curculigosid đạt từ 0,08% đến 0,48% (Nguyễn Thị Hà Ly và ctv, 2019) Hàm

lượng curculigosid ở sâm cau tại tỉnh Quảng Đông từ 0,1 1% to 0,35% (Lu và ctv, 2002).

1.1.5 Giá trị của cây sâm cau

Theo y học cô truyền Trung Quốc, nước sắc từ thân rễ sâm cau tán bột được dùngthuốc điều trị suy nhược cơ thể, đau lưng, viêm khớp, viêm thận mạn tính, chống oxyhóa, bảo vệ than kinh và kháng khuẩn Ngoài ra còn có thé làm thuốc huyết áp và điềukinh.

Ngoài ra thân rễ của sâm cau cũng có nhiều đặc tính chữa bệnh khác như lợi tiểu,kích thích tinh dục, chống hen suyễn, chống viêm phế quản và chống vàng da, v.v.(Ramchandani và ctv, 2014; Shanthamma, 2009).

Ở Án Độ, Nepal và Philippin, thân rễ Sâm cau được dùng cho mục đính làm lợitiểu, kích dục chữa một số bệnh ngoài da, loét dạ dày tá tràng, trĩ, lậu, bạch đới, hen,vàng da, tiêu chảy và nhức đầu, v.v

Ở Việt Nam sâm cau được dùng làm thuốc chữa ho, đau lưng, trĩ, vàng da, đaubụng, lở loét (Đỗ Tắt lợi và ctv, 2004)

1.2 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.1 Khái niệm

Nuôi cay mô tế bào thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bào đãtách rời ra khỏi cơ thé thực vật trong môi trường thích hợp dé chúng trở lại trạng tháichưa phân hóa có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triểnthành cây con mới Tất cả mọi tế bào của một cơ thể thực vật đều có tính toàn năng,nghĩa là chứa bộ gen tương tự nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể đều có khảnăng tông hợp những loại protein — enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡngtrong môi trường thích hợp đều có thé phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng choloài và ra hoa, kết quả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.2.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

- Cây con được trẻ hóa và nhìn chung sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng,

phát triên và năng suât cao

- Giúp tạo ra các cây con hoàn chỉnh từ những tế bào thực vật đã được chuyểnđổi gen và tạo ra các loài tốt hơn

- Có thể chọn lọc được các đối tượng thực vật có các tính trạng tốt để sản xuấtcác được phẩm sinh học

- Giúp cứu phôi của một số loài cây khó phát triển và sinh trưởng trong điều kiện

tự nhiên góp phan bảo vệ các giống cây quý hiếm có nguy cơ tiệt chủng hiện nay

- Có khả năng sản xuất cây giống quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhấtđịnh hoặc nảy mầm kém

Nhược điểm

- Phương pháp môi cay in vitro đòi hỏi trang thiết bị tương đối đắt tiền và kỹthuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giốngbằng các phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phương pháp này còn có nhữngbất lợi sau:

- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thướcnhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau phòng thí nghiệm

- Cần đội ngũ cán bộ kỹ thuật có tay nghề và kinh nghiệm chuyên môn nên tốn

chi phí đào tạo.

- Giá thành cây con còn khá cao.

- Ngoài ra, trong giai đoạn in vitro su nhiễm bệnh do vi khuẩn van có thé xay raxâm nhiễm va tôn tại trong mô cấy gây tôn hại khi tế bao bat đầu phân chia

- Cây nuôi cây mô chưa hoàn thiện vê mặt câu trúc nên trong giai đoạn thuân

dưỡng ( vivo) khả năng sông sót còn kém (Nguyễn Văn Ây, 2019)

1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp như

1.2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006), mô sẹo là một khối tế bàophát trién không có tô chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới cácđiều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật) Các tếbao thuộc các mô hoặc cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu sự phảnphân hóa trước lần phân chia đầu tiên Sự phản phân hóa này rất quan trọng, quá trìnhnày cho phép một tế bào trưởng thành trở lại trạng thái trẻ Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lậpkhả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987)

Trong điều kiện in vitro, mô sẹo thường được tạo trên môi trường đặc, theo ba quátrình: Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan): nhu mômộc va libe, nhu mô vỏ hay lõi; sự phân chia của tế bào tượng tang (tang phát sinh libe-mộc) Các tế bào tượng tang của phan lớn cây hai lá mầm dé phân chia dưới tác độngcủa auxin ngoại sinh như ở các cây cỏ hay dây leo; Sự xáo trộn của các mô phân sinh

sơ khởi (chéi hay rễ) Qua trình này được ưu tiên áp dụng ở cây một lá mam, vì các câynày không có tượng tầng điên hình như cây hai lá mầm và các tế bào nhu mô khó phảnphân hóa hơn (so với cây hai lá mầm) (Bùi Trang Việt, 2002)

Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới một tácđộng thích hợp nào đó, và có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện được khả năng này

Tùy vào môi loại mô và cơ quan, thường phải sử dụng các chât điêu hòa sinh trưởng với

loại và nông độ khác nhau theo từng mức độ nhạy cảm của các tê bào trong mô hay cơquan đó (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006).

Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo

mô sẹo Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả nang tạo mới cơ

quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, cây non (còn nguyên vẹn hay cắtđoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môitrường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin

Sự tạo mô sẹo từ các mẫu cây ban dau có thê chịu ảnh hưởng của các yêu tô bên

trong như: loại mâu, tuôi mẫu hay các yêu tô bên ngoài như: điêu kiện chiều sảng, nhiệt

độ, vết thương, chất điều hòa sinh trưởng

Độ tuôi của lá là yếu tô quan trọng có ảnh hưởng đến khả năng quang hợp và tạoseo.M6 sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường

được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Do đó, cây non hay những

mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy mô (BùiTrang Việt, 2000).

Chat điều hòa tăng trưởng thực vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình hìnhthành mô sẹo, đặt biệt là auxin Hiệu ứng của auxin tùy thuộc vào loại và nồng độ trong

mô thực vật hay trong môi trường nuôi cấy (Bùi Trang Việt,2000) Ngoài nồng độ với

tỉ lệ thích hợp áp dụng trong mục đích tạo sẹo, phải chú ý sự phối hợp giữa tỉ lệ auxin

và cytokinin Cytokinin kết hợp với auxin kích thích sự phân chia tế bào, thúc day sựphiên mã tạo Mrna, kích thích sự tổng hợp các protein và enzym đặc hiệu trong các môxác định để tạo sẹo (Scot, 1972) Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh cónguồn gốc từ sản phẩm trung gian của chu trình đường phân và có ảnh hưởng đến khảnăng tạo sẹo khi phối hợp với chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh (Hopkins, 1995)

Ngoài ra, cách đặt mẫu trên môi trường cũng ảnh hưởng ít nhiều đến khả năngtạo mô sẹo Việt đặt úp lá trên bề mặt môi trường tạo điều kiện cho sự hấp thu và chuyềnhóa các chất dinh dưỡng ở bề mặt trên và sự vận chuyên nước thông qua lực mao dan.Đồng thời bề mặt dưới của lá được tiếp xúc trực tiếp với không khí trong bình nuôi cấy,tạo điều kiện cho quá trình trao đôi khí và thúc đây chuyên chất dinh dưỡng Khi đặtngửa, lá sẽ có chiều hướng phát triển theo hướng bat lợi nhất cho sự hấp thụ và vận

chuyên các chất dinh dưỡng bằng cách hướng bề mặt trên của lá xuống môi trường, điềunay gây ra sự bẻ cong của mẫu lá (Duong Tan Nhựt và ctv, 2012).

1.2.3.4 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được muôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độđiều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn Sau đó, tếbào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp dé phát triển, tăng sinh khối

(Bui Trang Việt, 2000).

1.2.3.5 Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôicấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bao, tiếp tục phân chia và pháttriển thành cây hoàn chỉnh Khi tế bao mat vách và tiễn hành dung hợp, hai protoplast

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giốngcây trồng (Bùi Trang Việt, 2000)

1.2.3.6 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phan ở thực vat được nuôi cay trên môi trường thích hợp tạo thành mô seo

Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

1.2.4 Một số chat DHST trong nuôi cấy mô

Các chất ĐHST thực vật là những chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng,

mà chỉ với một hàm lượng nhỏ đã có thé kích thích, ức chế hoặc b6 sung bat kì quátrình sinh lý của thực vật Chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích nhưng khi

sử dụng vượt qua mức kích thích tối đa sẽ gây ảnh hưởng ức chế Mặc dù, chúng khôngtham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất, nhưng có tác dụng đến quá trình sinhtrưởng và phát triển của cây (Bùi Trang Việt, 2000)

NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một Auxin nhân tao có hoạttính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA, tập trung nhiều trong các mô non(chi, lá đang phát triển), trong hạt được hình thành, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân

Vũ và ctv, 1976).

Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động củatầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sinhtrưởng của quả và tạo ra quả không hạt Auxin điều hòa sự sinh trưởng của tế bào, đặcbiệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác độnglên sự giãn của thành tế bào: IAA làm giảm pH trong thành tế bào, hoạt hóa enzymephân hủy các polysaccharide liên kết giữa các sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo và

tạo điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thâm thấu không bào

trung tâm Bên cạnh đó, auxin còn ảnh hưởng lên sự phân chia của tế bào (Trịnh Xuân

Vũ và ctv, 1976).

Auxin gây ra tính hướng động của cây, gây ra hiện tượng ưu thế ngọn, điều hòa

sự hình thành rễ Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin, nếu nồng độ auxin cao

sẽ ức chế sự phát triển của rễ Vai trò của auxin trong sự phân hóa rễ thể hiện rất rõtrong vi nhân giống, việc sử dung auxin dé điều hòa sự ra rễ là cực kỳ quan trong vàbắt buộc Auxin điều hòa sự hình thành, sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt.Auxin kìm hãm sự rụng lá, tang sự tạo qua và phòng rung nụ, quả non, làm tang nangsuất cây trồng Auxin tác động lên sự vận động của nguyên sinh chất và làm tăng tốc

độ lưu động của nguyên sinh chất (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin tác động đến các hoạt động như quang hợp, hô hấp, vận chuyền các chấttrong cây Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được thực vật tổnghợp và auxin tổng hợp do con người tạo ra

mô tế bào thực vật Cytokinin giúp tế bào gia tăng kích thước và sinh tông hợp protein.Cytokinin tác động trên cả sự phân nhân và phân chia tế bào chất Trong thân và rễ,cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bảo.

Cytokinin cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành Cytokinincảm ứng sự hình thành chéi, loại bỏ ưu thế ngọn và hạn chế sự phát triển của rễ (BùiTrang Việt, 2000) Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cay mô thực vật: TDZ

(Thidiazuron), BA (Benzyl adenine), BAP (Benzyl-amino-purine), kinetin (6 — furfuryl amino purine) va Cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dung rộng rãi trong môi

trường tạo chỗi in vitro (Nguyễn Minh Chon, 2004)

Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin lớn hơn 1 thích hợphình thành rễ và nhỏ hơn 1 sẽ kích thích hình thành chồi Nếu tỷ lệ đạt mức cân bang thitạo điều kiện cho phát sinh mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2.5 Các bước chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Nguyễn Văn Ây (2019) nuôi cấy mô gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu sốc

Chọn cây mẹ dé lay mẫu thường là cây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh

va có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan dé lay mau thường là chon chéi, đoạn thân, cóhoặc không có chồi ngủ, hoa non, lá non Mô được chọn dé nuôi cây mô là các mô cónăng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ồn

định.

Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thé kéo dài từ 3 — 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (muôi cấy khởi động)

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cay in vitro Trong nuôi cấy mô, khửtrùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm khuan, tỷ lệsống cao, mẫu tôn tại và sinh trưởng tốt Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt,lọc, hóa chat và một số phương pháp khác dé khử trùng mẫu cấy

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

11

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây bằng phương pháp nuôi cấy

mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thê nhân giống Vật liệu nuôi cấy

là các thé chéi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo chồi, đôi khi nồng

độ sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiệnnuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình phát sinh chồi nhanh hơn

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có day đủ lá, thân, rễ dé chuẩn bị chuyên ravườn ươm Cây con phải khỏe mạnh dé năng sức sống khi ra môi trường bên ngoài.Các chất có tác dụng tạo chôi bị loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trìnhtạo rễ Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là một bước làmthích nghỉ trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự tạo rễ phụ thuộc vào nhiều yếu

tố, hàm lượng Auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu đi truyền.

Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điêu kiện tự nhiên

Dé đưa cây từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởngtốt cần đảm bảo một số yêu cầu về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiềucao cây Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch aga và đặt trong chậunơi có bóng râm, độ âm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắtđầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thé tăng cường độ chiếu sáng và hạ

âm độ.

1.1 Một sô nghiên cứu về Sâm cau trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Dhenuka và ctv (1999) sử dụng chéi ngủ Sâm cau là nguồn vật liệu nuôi cay.Kétquả cho thay môi trường MS có bô sung 9 uM BAP thích hợp cho việc tạo mô sẹo va

môi trường MS có bồ sung 1,1 uM BAP thích hợp cho việc tái sinh chdi từ mô sẹo.Sarabjeet và ctv (2000) nghiên cứu nuôi cây mô lá Sâm cau trên môi trường lỏng lắc.Kết quả ghi nhận có 95% mẫu cấy tạo chi trên môi trường Gamborg lỏng bé sung 2,2

uM BAP, 1,0 uM IBA, 0,11 M adenin và 250 mg-L'! PVP sau 6 tuần nuôi cấy

Salema Valencio Francis và ctv (2007) đã nghiên cứu quy trình nhân giống táisinh thông qua nuôi cay mô phân sinh ngọn Nhiều chồi được tạo ra từ mô phân sinh

ngọn trên môi trường MS có bồ sung 1,5 mg-L! BA, 100 ms/I adenine sulfat và 3%đường Trong môi trường MS bồ sung 1,5 mg-L! BA, 100mg-L! Ads, 0,25 IBA va

3% đường việc hình thành chồi lên cao nhất Sự ra rễ đạt ty lệ cao nhất trong môi

trường 1⁄2 MS bồ sung 1,5 mg-L'! IBA va 2% đường

Augustine và ctv (2008) đã nghiên cứu tạo phôi Sâm cau thông qua nuôi cây baophấn Kết quả cho thấy hạt phất đa bào đã được tạo ra trên môi trường MS bồ sung 0,5mg-L! BAP kết hợp 0,5-1,0 mg-L! NAA Các hạt phan này tiếp tục được nuôi cấytrên môi trường MS có bổ sung 0,2-1,0 mg-L"! 2,4-D và khi chuyển sang môi trường

MS không bồ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã cảm ứng và phát sinh phôisoma Các phôi soma được nuôi cấy trên môi trường này cho đến khi hình thành rễ vàtăng trưởng thành cây con khi chuyên sang môi trường chứa 0,5 mg-L”! BAP

Dhenuka.S và ctv (2012), đã nuôi cay mô seo từ mau lá của Sâm cau Các mẫu

lá cho thấy việc tạo ra mô sẹo trên môi trường MS có bé sung BAP 9uM tối ưu nhất.Các chéi được tái sinh từ mô sẹo khi cấy truyền trong môi trường MS có bồ sung 1,1

uM BAP là nồng độ tối ưu cho sự nhân lên củ chồi Sự tạo rễ đạt tỷ lệ cao nhất trongmôi trường MS có bồ sung 5,3 uM NAA và 1,2 1M IBA

Shende va ctv (2012) nghiên cứu nuôi cấy chỗồi đỉnh Sâm cau in vitro Kết quacho thấy chỗi phát triển tốt trên môi trường MS có bồ sung BAP 0,25 mg-L và Kinetin0,5 mg-L! Môi trường MS có bồ sung BAP 1,5 mg-LT kết hợp IAA 0,25 mg:L! chohiệu quả tạo mô sẹo cao nhất và môi trường MS bổ sung 0,5 mg-L! IAA giúp rễ pháttriển tốt nhất về chiều dài rễ cũng như số lượng rễ

Dutta Gupta.S và ctv (2015) đã nghiên cứu về sự thay đôi ánh sáng đèn (LED)đến quá trình phát sinh chồi của cây Sâm cau in vitro Nghiên cứu cho thấy ánh sángmàu xanh đương (p< 0,05) cải thiện đáng ké về tỷ lệ phát sinh chéi, đối với đè LEDmàu đỏ có tác dụng ức chế quá trình hình thành chdi

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Út và ctv (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin và sựkết hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tạo chồi in vitro của Sâm cau từ chéi đỉnh.Trong đó, môi trường MS có bồ sung 1,0 mg-L! BAP + 1,0 mg-L’! Kinetin cho tỉ lệtạo chôi cao nhat.

Võ Châu Tuan va ctv (2011) đã nghiên cứu nhân giống Sâm cau in vitro thôngqua đỉnh sinh trưởng Kết qua thu được cho thấy, số chồi đạt lớn nhất trên môi trường

MS bé sung 1,0 mg-L", 2,5 mg-L! BA với 17,9 chồi/ mẫu cây Trong môi trường tạo

rễ, việc hình thành rễ tốt nhất trong môi trường MS có bố sung 0,75 mg-L! IBA và

0,75 mg-LTNAA đạt 64 rễ/ mẫu Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 86% cây sống và thíchnghi với điều tự nhiên

Nguyễn Thị Lai va ctv (2018) đã tiến hành nhân nhanh giống in vitro cây Sâmcau từ đỉnh sinh trưởng Kết quả cho thấy trên môi trường MS bồ sung 200 ml/I nước

dừa, 1g-L-1 than hoạt tinh, 1,5 mg-L TDZ, 0,5 mg/ 1 IBA, 1,0 mg-L1 AgNO; và 50

mg:L tảo Spirulina cho ra kết quả nhân chồi tốt nhất với 20,8 chồi/mẫu sau 6 tuầnnuôi cấy Tỷ lệ chéi ra rễ cao nhất, chất lượng bộ trễ tốt nhất trong môi trường MS bổsung 200 ml/I nước dừa, 1 g:L! than hoạt tính và 0,5 mg-L! IBA Hỗn hợp dat min

và xơ dừa (tỷ lệ 70:30) được xác định là giá thể phù hợp nhất cho sinh trưởng của câycon trong vườn ươm, sau 10 ngày trồng, tỷ lệ sống 98%, chiều cao cây đạt 16,6 em,6,9 lá/cây và 6,3 rễ mới/ cây

Trương Thị Bích Phượng và ctv (2018) đã nghiên cứu tạo chéi in vitro cay samcau Kết quả cho thay môi trường MS có bồ sung 3,5 mg-L" thích hợp tái sinh chéi từđoạn thân tự nhiên với tỷ lệ mẫu tai sinh la 96,4% và số chéi/mau cao nhất 2,65 Đốivới mau lá sâm cau, môi trường MS bổ sung riêng lẻ 1,5 mg-L'! BAP, 1,5 mg-LKIN,1,5 mg-L'TDZ cho tỷ lệ tái sinh chéi lần lượt là 96,68%; 92,88%; 85,76%

Nguyễn Thi Thúy Diễm và ctv (2021) đã khảo sát ảnh hưởng TDZ và IAA lên

sự phát sinh hình thái lớp mỏng tế bào của lá, cuống lá và thân rễ cây Sâm cau Kếtquả cho thấy môi trường thích hợp tạo mô sẹo từ lá là môi trường MS có bổ sung 1,0mg-L-1 TDZ với 1,5 mg-L' IAA, đối với cuống lá môi trường tối ưu là môi trường

MS bồ sung 0,5 mg-L'! TDZ và 1,5 mg-L' IAA và đối với thân rễ là môi trường MS

có 0,5 mg:L TDZ với 2,0 mg-L' IAA.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung thí nghiệm

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tái sinh

từ lá của cây Sâm cau in vitro

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự tạo rễ cây Sâm cau in vitro

2.2 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Đề tài được thực hiện bắt đầu từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023 tạiphòng nuôi cấy mô, thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa trường Đạihọc Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng phòng nuôi cay mô, thuộc Khu thực nghiệm

Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Cây giống Sâm cau in vitro được cung cấp từ Trung tâm ươm tạo doanh nghiệp,

khu nông nghiệp công nghệ cao Củ Chi.

Mẫu giống được duy trì trên môi trường MS

15

2.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige vàSkoog, 1962) Môi trường bồ sung thêm 30 g-L' đường, 7,0 g-L' agar, bố sung chấtđiều hòa sinh trưởng BA va NAA cho thí nghiệm 1, NAA cho thí nghiệm 2 Môitrường nuôi cấy được điều chỉnh ở pH 5,6 Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C,chu trình áp suất 1 atm trong 20 phút Thê tích môi trường: 50mL/chai nuôi cấy

Bảng 2 1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm (Murashige vàSkoog, 1962).

Thành phân Khôi luong(mg-L-1)

Re PFPA Na2EDTA.2H20 37,3

FeSO4.7H20 27,8

100

Myo-Inositol 20 Glycine 0,5

Vitamin Pyridoxine HCl 0,5

Nicotine acid 01

Thiamine HCI

2.4.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

- Thiết bị: Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), nồi hap khử trùng SS — 325 (Tomy SeikoCo., Ltd.,Nhat), máy đo pH của H198118 (Hanna Instrument), cân điện tử 3 số lẻ EJ-

323A (Handk, Đài Loan), điện thoại chụp ảnh.

- Dụng cụ: Kéo, kẹp, dao cấy, đĩa, đèn cồn, ống đong, chai thủy tinh dé nuôi cấy

dung tích 250mL, cốc thủy tinh (50mL, 250mL), bao tay

- Hóa chất:

+ Chất điều hòa sinh trưởng bổ sung thuộc hãng Duchefa Biochemie (Hà Lan):

6-Benzyle amino purine (BA), 1-Naphthalene acetic acid (NAA)

+ Côn 70°, cồn 96°

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng

tái sinh từ lá của cây Sâm cau in vitro :

Mục tiêu: Xác định được nồng độ phù hợp nhất BA va NAA đến khả năng táisinh từ lá của cây Sâm cau in vitro

2.5.1.1 Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm hai yếu tố, được bố trí theo kiêu hoàn toàn

ngẫu nhiên với 12 nghiệm thức và 3 lần lập lại

Yếu tổ B (nồng độ BA): 0 mg-L!; 1 mg:L!; 2 mg-L?; 3 mg-L†

Yếu tố N (nồng độ NAA): 0 mg-L1; 0,25 mg-LT 0,5 mg-L†

17

Bảng 2 2 Nong độ BA và NAA bồ sung cho từng nghiệm thức trong thí nghiệm 1Nong độ BA Nong độ NAA (mg-L-1) (N)

BO-NO,25 |BI-N0,5S |B0-NO B3-NO0,25 |B0-N0,/25 |BI-NO0

B3-N0,25 | BI-N0 BI-N0 BI-NO,5 |BI-N0/25 |B2-N0,25

2.5.1.2 Cách thức tiến hành

Bước 1: Chọn các lá có màu xanh từ cây in vitro có 3 - 5 lá, chiều cao cây từ Sem, loại bỏ cuống lá và ngọn lá 1 cm và sau đó cắt các lá thành các mảnh nhỏ có kíchthước 0,5 x 1 cm như hình 2.2

4-Hình 2.2 Mẫu lá Sâm cau trước khi đưa vào môi trường

nuôi cây

Bước 2: Lay các mảnh lá đặt vào dung tích 50mL có chứa môi trường MS bổ

sung BA va NAA với các nông độ khác nhau, mặt dưới lá tiêp xúc với môi trường.

Bước 3: Đặt bình có chứa mẫu trên giàn nuôi cây, sau đó dùng tam vải đen phủ

kín cách ly ánh sáng các bình chứa mẫu và dé trong vòng 4 tuần khi mẫu hình thành

mô sẹo, sau đó gỡ tâm vải và dé bình mẫu dưới cường độ chiếu sáng 50 imol-m7-s-l:

thời gian chiếu sáng 12h/ngày Nuôi cấy cho đến 70 ngày (10 tuần) sau cấy

2.5.1.3 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Số liệu được ghi nhận tại các thời điểm 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần kê

từ khi bắt đầu cấy và đo tất cả các mẫu

Ty lệ mẫu hình thành mô sẹo (%) = (Số mẫu hình thành mô seo/téng số mẫu banđầu) x 100

Tỷ lệ mẫu chết (%)= (Số mẫu chét/téng số mẫu ban đầu cấy) x 100

Hình thái mô sẹo (màu sắc, độ xốp): Đánh giá bằng cảm quan

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = (Số mẫu tái sinh chéi/téng số mẫu ban dau) x 100

Số chồi trên mẫu (chi) = tổng số chéi/téng số mẫu có chdi

19

Số liệu các chỉ tiêu được ghi nhận ở tuần thứ 10 sau cấy.

Kích thước mô seo (cm): Kết quả của số đo trung bình vị trí đường kính lớn nhất

và vị trí nhỏ nhất của mô sẹo

Khối lượng tươi mô sẹo (mg/mẫu)

Chiều cao chéi (mm): đo từ điểm phát sinh chéi đến chóp lá cao nhất

2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự tạo rễ và sinh trưởng cây

Sâm cau in vitro :

Mục tiêu: Xác định được nồng độ NAA tốt nhất đến sự tạo rễ cây Sâm cau in

N4 0,4

N§ 0,5Hình 2.3 Sơ đồ bó trí thí nghiệm 2

Bước 3: Đặt bình tam giác có chứa mẫu trên giàn nuôi cấy, cường độ chiếu sáng

50 umol-m-2-s-1, thời gian chiếu sáng 12h/ngày

Bước 4: Theo dõi khả năng tạo rễ của Sâm cau ở phòng tăng trưởng và thu thập

số liệu.

2.5.2.3 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Số liệu được ghi nhận sau cấy 7 ngày 1 lần trong vòng 4 tuần

- Tỷ lệ ra rễ (%): (Tổng số mẫu ra rễ/ tổng số mẫu cấy) x100, được ghi nhận

vào tuần thứ 4 sau cấy

-_ Số lá/cây (lá): Đếm số lá phát sinh trên mỗi mẫu cấy

- Số rễ/cây (rễ): Đếm số rễ phát sinh trên mỗi mẫu cấy

Các chỉ tiêu sau được ghi nhận vào tuần thứ 4 sau cấy.

- Chiều dài rễ (cm): Do từ gốc đến chop rễ dài nhất, được ghi nhận vào tuần

thứ 4 sau cấy

- Chiều cao của cây (cm): Dùng thước đo từ gốc thân đến đỉnh chồi cao nhất

- Khối lượng tươi toàn cây (g/cây): cân với cân 3 số lẻ đến khối lượng không

đồi

- Khối lượng khô toàn cây (g/cây): sấy ở 70 °C trong 3 ngày, cân với cân 3

số lẻ và cân đến khối lượng không đổi

21

2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu

Số liệu, kết quả được tính trung bình bằng phần mềm Excel 2016

Các phân tích thống kê được thực hiện trên phan mềm R Studio 4.3.1 (R foundation,Áo) Các chỉ tiêu tỷ lệ hình thành mô seo, tỷ lệ tái sinh chi, tỷ lệ mẫu chết được phântích thống kê với S-R-H test, trắc nghiệm phân hạng bằng Dumn test Các chỉ tiêu còn lạiđược phân tích phương sai (ANOVA), trắc nghiệm phân hạng bằng Duncan

Chương 3KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng

tái sinh từ lá của cây Sâm cau in vitro:

Mô sẹo là một cụm tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường

được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000) Mô

sẹo có thể hình thành từ hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt.Khi đặt trong môi trường phù hợp, các mẫu cấy sẽ phồng lên, dày lên do sự hap thunước, dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Khả năng tạo mô sẹo của

mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen Điều nàycũng được chứng minh bởi Ochatt và CaSo (1986) về khả năng tạo được mô sẹo từ nhiềuloại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật Kết quả được trình bày ở (bang 3.1)

Sau 2 TSC, các mau lá bat dau cảm ứng với môi trường nuôi cây, các mâu lá có hiện tượng uôn cong dù chưa xuât hiện mô sẹo.

Ở thời điểm 4 TSC, kết quả ghi nhận cho thấy tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa cácnghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Nếu xét theo yếu tố NAA, su

khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ NAA sử dụng Đối với yếu tố cácnồng độ BA, nồng độ BA 2 mg-L" cho tỷ lệ hình thành mô sẹo tốt nhất (58,89%) tuynhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ 1 mg-L BA và 3mg:L! BA lần lượt có tỷ lệ là (50,00% và 55,56%), nhưng khác biết có ý nghĩa thống

kê so với nồng độ đối chứng Sự tương tác giữa nồng độ BA và NAA khác biệt không

có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức Ở các nghiệm thức không b6 sung nồng độ

BA kết hợp với tất cả nồng độ NAA không xuất hiện mô sẹo và có dấu hiệu hóa nâu

mẫu lá ở tất cả các nghiệm thức.

Bảng 3 1 Ảnh hưởng nồng độ BA và nồng độ NAA đến tỷ lệ mẫu lá Sâm cau hìnhthành mô sẹo (%) ở các thời điểm khác nhau.

Nong độ NAA (mg-L~})Nông độ

Tuân sau cây BA(ms-LĐ 0 0,25 0,5 TB BA

” Giá trị H tinh theo S-R-H test "": khác biệt không ý nghĩa (p > 0,05); *: khác biệt có ý nghĩa (0,01 <

độ BA 1 mg-L! và 2 mg-L" lần lượt cho kết quả là 56,6% và 64,4%., nhưng lại có ýnghĩa thống kê so với nghiệm thức còn lại Sự tương tác giữa các nồng độ BA và NAA

giúp hình thành mô sẹo nhưng lại khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệmthức Ty lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức bồ sung nồng độ BA 1 mg-L!+

NAA 0 mg-L đạt 80%.

Ở tuần thứ 8, mô seo vẫn tiếp tục được hình thành Xét yếu tổ nồng độ NAA, môitrường bô sung nồng độ NAA 0 mg-L" cho tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (60, 1%),

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với hai nồng độ còn lại Xét yếu tố nồng độ

BA 3 mg-L! có tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo cao nhất (71,1%) dù sự khác biệt không có

ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ BA 1 mg-L và nồng độ BA 2 mg-L', cho kết

quả lần lượt là 61,1% và 67,8% Xét về sự tương tác giữa nồng độ BA và nồng độ NAA

tuy cho tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại khác biệt không

có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức

Ở tuần thứ 10, đã vậy yếu tổ NAA ở mức nồng độ NAA 0 mg-L" cho kết quảhình thành mô sẹo tốt nhất (62,5%), tuy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so vớinồng độ NAA 0,25 mg:L’! với kết quả là 45,83%, nhưng khác biệt có ý nghĩa so vớinồng độ còn lại Xét ở yếu tố BA, nghiệm thức có bổ sung nồng độ BA 3 mg-L vànông độ 1 mg-L'' cho kết quả tốt nhất (72,2%), khác biết không có ý nghĩa về mặt thống

kê so với nồng độ 2 mg-L'1, cho kết qua lần lượt là (67.8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê so với nồng độ đối chứng Sự tương tác giữa 2 yêu tố BA và NAA tuycho tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữacác nghiệm thức Ty lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức bé sung nồng độ BA

1 mg:L!+NÑAA 0 mg-L đạt 90%.

Tóm lại, sau 10 tuần nuôi cấy, càng tăng nồng độ BA thì tỷ lệ hình thành mô sẹotăng Kết quả cho thay, ở bat kì nồng độ NAA nào đều không dan tới sự hình thành mô

sẹo Sự kết hợp giữa nồng độ BA và NAA qua 10 tuần nuôi cấy vẫn không tạo ra kết

quả khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Ở tất cả các nghiệm thức, các mẫu đều hìnhthành mô seo ở tuần 4 đến tuần thứ 6, dat tối đa ở nghiệm thức 1 mg-L và 0,25 mg-L

! tăng 1,14 lần và hầu hết các nghiệm thức đều xuất hiện ở tuần thứ 4 Khi nồng độNAA tăng lên 0,5 mg-L có sự sụt giảm ở mức không có ý nghĩa về mặt thống kê Điềunày cho thay đường như việc b6 sung nồng độ NAA thì làm giảm quá trình tạo mô sẹo.Điều này gợi ý rang dé hình thành mô sẹo cho cây sâm cau không can sử dụng NAA,thay vào đó sử dụng nồng độ BA cho quá trình tạo mô sẹo Từ bảng trên cho thấy chỉ

25

cần sử dụng 1 mg-L! BA dé phát sinh mô seo sẽ giúp làm giảm chi phí sản xuất Vì quátrình kích thích tạo ra chéi sâm cau nên việc bố sung nồng độ NAA trong quá trình tao

mô sẹo rất cần thiết cho việc phát sinh chéi Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan

thường phải sử dụng loại chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau tùy theo mức

độ cảm ứng của các tế bào trong mô hay cơ quan đó Ở thí nghiệm này việc sử dụngmau lá cây Sâm cau in vitro 3 tháng tuổi, khi cấy trên môi trường được bồ sung auxin

và cytokinin thì mẫu cây phông ra và to dần tạo thành mô sẹo Kết quả này tương tự nhưkết quả thí nghiệm của Lê Hồng Giang và Đặng Thị Thúy Vân (2014) khi sử dụng nồng

độ BA 1 mg-L" đã đạt tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở cây cà chua

Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA va NAA đến tỷ lệ mẫu chết của cây sâm cau từ mẫu lá invitro ở các thời diém sau cay.

Tuansau = Nong độ Nong độ NAA

Giá trị H tính theo S-R-H test "": khác biệt không ý nghĩa (p > 0,05); **: khác biệt rat có ý nghĩa (p

< 0,01);

” Các số trong cùng một nhóm giá trị có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa theo trắc nghiệm

phan hang Dunn test ở mức p = 0,05.

Kết quả bảng 3.2 cho thấy, việc bổ sung BA va NAA ở các mức khác nhau đãảnh hưởng đến tỷ lệ chết của mẫu lá cây Sâm cau in vitro tại các thời điểm 4 TSC — 10TSC.

Ở thời điểm 4 TSC, xét theo yếu tố nồng độ NAA 0,5 mg-L! có số mẫu chết caonhất với 35,8%, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ0,25 mg-L (30,8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ đốichứng (0,8%) Sự tương tác giữa 2 yếu tố nồng độ NAA va BA tuy có tỷ lệ mẫu chếtkhác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê

Ở thời điểm 6 TSC, yếu tố nồng độ NAA ở mức 0,5 mg-L? dẫn đến tỷ lệ mẫuchết cao nhất là 35,8%, tuy khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0,25mg-L! (30,8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0 mg-L! NAA(3,33%) Xét về yếu tố nồng độ BA và sự kết hợp giữa hai nồng độ NAA va BA khácnhau đều cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệmthức còn lại.

Ở thời điểm § TSC, các mẫu có dấu hiệu chết nhiều hơn các tuần đầu Xét về yếu

tố NAA, ở nồng độ 0,5 mg-L" cho tỷ lệ cao nhất là 58,33%, khác biệt có ý nghĩa so vớicác nồng độ còn lại Xét về yếu tố BA và sự kết hợp giữa nồng độ BA và NAA có tỷ lệmẫu chết khác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê Tỷ

lệ mẫu chết cao nhất ở nghiệm thức b6 sung nồng độ BA 0 mg-L! + 0,5 mg-L! NAAđạt tỷ lệ chết cao nhất là 96,7%

Ở thời điểm 10 TSC, xét yếu tố nồng độ NAA, nồng độ NAA 0,5 mg-L! đạt tỷ

lệ chết cao nhất (65,83%), khác biệt có ý nghĩa thông kê so với các nghiệm thức còn lại.Nông độ BA và sự tương tác giữa các nồng độ BA va NAA khác nhau, tuy gây nên tỷ

lệ mẫu chết khác nhau, nhưng lại khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Tóm lại, từ kết quả trên cho thây nồng độ NAA dẫn đến sự ngộ độc và gây chếtmẫu Điều này ảnh hưởng đến quá trình hình thành mô sẹo và dẫn đến mẫu chết Qúatrình chết này một phần là ảnh hưởng của quá trình xuất tiết phenol trên môi trườngtrong đó cây sâm cau về ban chất có chứa nhiều hợp chat phenol Trong nuôi cấy mô,

việc hóa nâu môi trường là vân dé thường gap cũng ảnh hưởng dén sự phát triên của mô.

27