2.1 Nội dung thí nghiệm
Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tái sinh
từ lá của cây Sâm cau in vitro .
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự tạo rễ cây Sâm cau in vitro.
2.2 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Đề tài được thực hiện bắt đầu từ tháng 02 năm 2023 đến tháng 08 năm 2023 tại phòng nuôi cấy mô, thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
2.3 Điều kiện thí nghiệm
Thí nghiệm được tiễn hành tại phòng phòng nuôi cay mô, thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
- Độ chiếu sáng 50 umol-m 2-s † - Thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
- Âm độ trung bình 55%.
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy là 25 °C + 2 °%C
2.4 Vật liệu thí nghiệm
2.4.1 Mẫu giống
Cây giống Sâm cau in vitro được cung cấp từ Trung tâm ươm tạo doanh nghiệp,
khu nông nghiệp công nghệ cao Củ Chi.
Mẫu giống được duy trì trên môi trường MS
15
2.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Môi trường bồ sung thêm 30 g-L' đường, 7,0 g-L' agar, bố sung chất điều hòa sinh trưởng BA va NAA cho thí nghiệm 1, NAA cho thí nghiệm 2. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở pH 5,6. Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, chu trình áp suất 1 atm trong 20 phút. Thê tích môi trường: 50mL/chai nuôi cấy.
Bảng 2. 1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm (Murashige và
Skoog, 1962).
Thành phân Khôi luong(mg-L-1) NH4NO3 1650
Da luong KNO: 1900 KH¿PO¿ 170 CaCl 2H20 440
ae ieee MgSO4.7H20 370
MnSO4.4H20 16,9
ZnSO4.4H20 8,6
H3BO4 6,2 Vi luong KI 0,83
Na2MO4 0,25 CoCh.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025
Re PFPA Na2EDTA.2H20 37,3
FeSO4.7H20 27,8 100 Myo-Inositol 20
Glycine 0,5 Vitamin Pyridoxine HCl 0,5 Nicotine acid 01 Thiamine HCI
2.4.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
- Thiết bị: Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), nồi hap khử trùng SS — 325 (Tomy Seiko Co., Ltd.,Nhat), máy đo pH của H198118 (Hanna Instrument), cân điện tử 3 số lẻ EJ-
323A (Handk, Đài Loan), điện thoại chụp ảnh.
- Dụng cụ: Kéo, kẹp, dao cấy, đĩa, đèn cồn, ống đong, chai thủy tinh dé nuôi cấy dung tích 250mL, cốc thủy tinh (50mL, 250mL), bao tay.
- Hóa chất:
+ Chất điều hòa sinh trưởng bổ sung thuộc hãng Duchefa Biochemie (Hà Lan):
6-Benzyle amino purine (BA), 1-Naphthalene acetic acid (NAA)
+ Côn 70°, cồn 96°.
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng
tái sinh từ lá của cây Sâm cau in vitro :
Mục tiêu: Xác định được nồng độ phù hợp nhất BA va NAA đến khả năng tái
sinh từ lá của cây Sâm cau in vitro .
2.5.1.1 Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm hai yếu tố, được bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên với 12 nghiệm thức và 3 lần lập lại.
Yếu tổ B (nồng độ BA): 0 mg-L!; 1 mg:L!; 2 mg-L?; 3 mg-L†
Yếu tố N (nồng độ NAA): 0 mg-L1; 0,25 mg-LT 0,5 mg-L†
17
Bảng 2. 2 Nong độ BA và NAA bồ sung cho từng nghiệm thức trong thí nghiệm 1 Nong độ BA Nong độ NAA (mg-L-1) (N)
(mg-L-1) (B) 0,25 0,5 0 B0-N0 B0-N0,25 B0-N0,5
1 BI-N0 BI-N0,25 BI-N0,5 2 B2-N0 B2-N0,25 B2-N0,5 3 B3-N0 B3-N0,25 B3-N0,5
Hình 2. 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
B0-N0 B0N0,5 |B0-N05 [B0-N0/25 [B3-N0/25 |B0-NO B2-N0 B1-NO0,25 |B2-N0 B3-N0 BO-NO,5 | BI-N0,5 B2N0,5 |B3-N0 B2N05 |BI-N025 | B2-NO,5 |B2-N0 BO-NO,25 |BI-N0,5S |B0-NO B3-NO0,25 |B0-N0,/25 |BI-NO0 B3-N0,25 | BI-N0 BI-N0 BI-NO,5 |BI-N0/25 |B2-N0,25 B2N0/25 |B3-N05S |B2N0/25 | B3-NO,5 |B3-N05 |B3-N0
Quy mô thí nghiệm
Tổng số NT: 12 - Số LLL: 3
- Số chai 1 6 cơ sở: 5 - Số mẫu/ chai : 2
- Tổng số chai: 12 x 3 x 5 = 180 - Tổng số mẫu: 2 x 180 = 360
2.5.1.2 Cách thức tiến hành
Bước 1: Chọn các lá có màu xanh từ cây in vitro có 3 - 5 lá, chiều cao cây từ 4- Sem, loại bỏ cuống lá và ngọn lá 1 cm và sau đó cắt các lá thành các mảnh nhỏ có kích
thước 0,5 x 1 cm như hình 2.2
Hình 2.2 Mẫu lá Sâm cau trước khi đưa vào môi trường
nuôi cây
Bước 2: Lay các mảnh lá đặt vào dung tích 50mL có chứa môi trường MS bổ
sung BA va NAA với các nông độ khác nhau, mặt dưới lá tiêp xúc với môi trường.
Bước 3: Đặt bình có chứa mẫu trên giàn nuôi cây, sau đó dùng tam vải đen phủ kín cách ly ánh sáng các bình chứa mẫu và dé trong vòng 4 tuần khi mẫu hình thành mô sẹo, sau đó gỡ tâm vải và dé bình mẫu dưới cường độ chiếu sáng 50 imol-m7-s-l:
thời gian chiếu sáng 12h/ngày. Nuôi cấy cho đến 70 ngày (10 tuần) sau cấy.
2.5.1.3 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Số liệu được ghi nhận tại các thời điểm 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần kê từ khi bắt đầu cấy và đo tất cả các mẫu.
Ty lệ mẫu hình thành mô sẹo (%) = (Số mẫu hình thành mô seo/téng số mẫu ban đầu) x 100.
Tỷ lệ mẫu chết (%)= (Số mẫu chét/téng số mẫu ban đầu cấy) x 100 Hình thái mô sẹo (màu sắc, độ xốp): Đánh giá bằng cảm quan
Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = (Số mẫu tái sinh chéi/téng số mẫu ban dau) x 100.
Số chồi trên mẫu (chi) = tổng số chéi/téng số mẫu có chdi.
19
Số liệu các chỉ tiêu được ghi nhận ở tuần thứ 10 sau cấy.
Kích thước mô seo (cm): Kết quả của số đo trung bình vị trí đường kính lớn nhất và vị trí nhỏ nhất của mô sẹo.
Khối lượng tươi mô sẹo (mg/mẫu).
Chiều cao chéi (mm): đo từ điểm phát sinh chéi đến chóp lá cao nhất.
2.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự tạo rễ và sinh trưởng cây
Sâm cau in vitro :
Mục tiêu: Xác định được nồng độ NAA tốt nhất đến sự tạo rễ cây Sâm cau in
vitro
2.5.2.1 B6 trí thi nghiệm: Thi nghiệm một yếu tô được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lập lại.
Bảng 2. 3 Các nghiệm thức với các nồng độ NAA tương ứng bỗ sung vào môi trường
trong thí nghiệm 2
Nghiệm thức Nong độ NAA (mg-L”)
N0 0,0 NI 0,1 N2 0,2 N3 0,3
N4 0,4
N§ 0,5
Hình 2.3 Sơ đồ bó trí thí nghiệm 2
N0 N4 N0 N4 N5 N3
N4 NI N3 N0 NI NI
N5 N2 N2 Nã N2 N3
Quy mô thí nghiệm
Tổng: 6 nghiệm thức
- Số LLL: 3
- Số chai 1 6 cơ sở: 5 - Số mẫu/chai: 3
- Tổng số chai: 6 x 3 x 5 = 90 chai - Tổng số mẫu: 270
2.5.2.2 Cách thức tiến hành
Bước 1: Chọn các mẫu chồi cây Sâm cau nuôi từ lá khoảng 10 TSC, sau đó cấy chuyền qua môi trường MS 3 tuần và lay mẫu cây có kích thước 2 — 2,5cm.
Bước 2: Cay chồi được chọn vào bình tam giác có chứa môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau.
Bước 3: Đặt bình tam giác có chứa mẫu trên giàn nuôi cấy, cường độ chiếu sáng 50 umol-m-2-s-1, thời gian chiếu sáng 12h/ngày.
Bước 4: Theo dõi khả năng tạo rễ của Sâm cau ở phòng tăng trưởng và thu thập
số liệu.
2.5.2.3 Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Số liệu được ghi nhận sau cấy 7 ngày 1 lần trong vòng 4 tuần.
- Tỷ lệ ra rễ (%): (Tổng số mẫu ra rễ/ tổng số mẫu cấy) x100, được ghi nhận vào tuần thứ 4 sau cấy.
-_ Số lá/cây (lá): Đếm số lá phát sinh trên mỗi mẫu cấy.
- __ Số rễ/cây (rễ): Đếm số rễ phát sinh trên mỗi mẫu cấy.
Các chỉ tiêu sau được ghi nhận vào tuần thứ 4 sau cấy.
- Chiều dài rễ (cm): Do từ gốc đến chop rễ dài nhất, được ghi nhận vào tuần thứ 4 sau cấy.
-__ Chiều cao của cây (cm): Dùng thước đo từ gốc thân đến đỉnh chồi cao nhất.
- Khối lượng tươi toàn cây (g/cây): cân với cân 3 số lẻ đến khối lượng không đồi.
- Khối lượng khô toàn cây (g/cây): sấy ở 70 °C trong 3 ngày, cân với cân 3 số lẻ và cân đến khối lượng không đổi.
21
2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu
Số liệu, kết quả được tính trung bình bằng phần mềm Excel 2016.
Các phân tích thống kê được thực hiện trên phan mềm R Studio 4.3.1 (R foundation, Áo). Các chỉ tiêu tỷ lệ hình thành mô seo, tỷ lệ tái sinh chi, tỷ lệ mẫu chết được phân tích thống kê với S-R-H test, trắc nghiệm phân hạng bằng Dumn test. Các chỉ tiêu còn lại được phân tích phương sai (ANOVA), trắc nghiệm phân hạng bằng Duncan.
Chương 3