3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng
tái sinh từ lá của cây Sâm cau in vitro:
Mô sẹo là một cụm tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô
sẹo có thể hình thành từ hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt.
Khi đặt trong môi trường phù hợp, các mẫu cấy sẽ phồng lên, dày lên do sự hap thu nước, dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen. Điều này cũng được chứng minh bởi Ochatt và CaSo (1986) về khả năng tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Kết quả được trình bày ở (bang 3.1).
Sau 2 TSC, các mau lá bat dau cảm ứng với môi trường nuôi cây, các mâu lá có hiện tượng uôn cong dù chưa xuât hiện mô sẹo.
Ở thời điểm 4 TSC, kết quả ghi nhận cho thấy tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Nếu xét theo yếu tố NAA, su khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ NAA sử dụng. Đối với yếu tố các nồng độ BA, nồng độ BA 2 mg-L" cho tỷ lệ hình thành mô sẹo tốt nhất (58,89%) tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ 1 mg-L BA và 3 mg:L! BA lần lượt có tỷ lệ là (50,00% và 55,56%), nhưng khác biết có ý nghĩa thống kê so với nồng độ đối chứng. Sự tương tác giữa nồng độ BA và NAA khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Ở các nghiệm thức không b6 sung nồng độ BA kết hợp với tất cả nồng độ NAA không xuất hiện mô sẹo và có dấu hiệu hóa nâu mẫu lá ở tất cả các nghiệm thức.
Bảng 3. 1 Ảnh hưởng nồng độ BA và nồng độ NAA đến tỷ lệ mẫu lá Sâm cau hình thành mô sẹo (%) ở các thời điểm khác nhau.
Nong độ NAA (mg-L~})
Nông độ
Tuân sau cây BA(ms-LĐ 0 0,25 0,5 TB BA
0 0,0 0,0 0,0 0,08 1 70,0 36,6 43,3 50,04 4 2 63,3 56,6 56,6 58,84 3 50,0 63,3 53,3 55,5"
TB NAA 45,8 39,1 38,3
CV (%) = 10,72;HA=22,09**: Hg=1,84"*: Hap=8,822
0 0,0 0,0 0,0 0,050 1 80,0 46,7 43,3 56,6°
6 2 73,3 56,7 63,3 64,44 3 66,7 76,7 53,3 65.6"
TB NAA 55,0 45,0 40,0
CV(%)= 11,8; Ha=21,9""; Hp=4,3"); Han=7,0%
0 0,0 0,0 0,0 0,050) 1 86,7 46,7 50,0 61,1"
8 2 80,0 56,7 66,7 67,84 3 76,7 80,0 56,7 71,1"
TB NAA 60,1 45,8 43,3 CV(%)=10,00; HA=21,50”; Hs=5,53"⁄2: Hap=6,58"°
0 0,0 0,0 0,0 0,050) 1 90,0 46,7 50,0 T22 10 3 80,0 26,7 66,7 67,8^
3 80,0 80,0 66,7 22 TB NAA 62,5" A523 43,34
CV(%)=10,42; Ha=21,23**; Hg=5,93*; Hap—6,35"
” Giá trị H tinh theo S-R-H test. "": khác biệt không ý nghĩa (p > 0,05); *: khác biệt có ý nghĩa (0,01 <
p < 0,05); **: khác biệt rất có ý nghĩa (p < 0,01);
” Các số trong cùng một nhóm giá trị có cùng chữ cái thì không khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
Dunn test ở mức p = 0,05.
Ở tuần thứ 6, việc bổ sung các nồng độ NAA khác nhau vào môi trường hình thành mô sẹo cho tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở môi trường có bô nồng độ BA 3 mg-L! (65,6%), tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với nồng độ BA 1 mg-L! và 2 mg-L" lần lượt cho kết quả là 56,6% và 64,4%., nhưng lại có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức còn lại. Sự tương tác giữa các nồng độ BA và NAA
giúp hình thành mô sẹo nhưng lại khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Ty lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức bồ sung nồng độ BA 1 mg-L!+
NAA 0 mg-L đạt 80%.
Ở tuần thứ 8, mô seo vẫn tiếp tục được hình thành. Xét yếu tổ nồng độ NAA, môi trường bô sung nồng độ NAA 0 mg-L" cho tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (60, 1%), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với hai nồng độ còn lại. Xét yếu tố nồng độ BA 3 mg-L! có tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo cao nhất (71,1%) dù sự khác biệt không có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ BA 1 mg-L và nồng độ BA 2 mg-L', cho kết quả lần lượt là 61,1% và 67,8%. Xét về sự tương tác giữa nồng độ BA và nồng độ NAA
tuy cho tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại khác biệt không
có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức.
Ở tuần thứ 10, đã vậy yếu tổ NAA ở mức nồng độ NAA 0 mg-L" cho kết quả hình thành mô sẹo tốt nhất (62,5%), tuy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ NAA 0,25 mg:L’! với kết quả là 45,83%, nhưng khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ còn lại. Xét ở yếu tố BA, nghiệm thức có bổ sung nồng độ BA 3 mg-L và nông độ 1 mg-L'' cho kết quả tốt nhất (72,2%), khác biết không có ý nghĩa về mặt thống kê so với nồng độ 2 mg-L'1, cho kết qua lần lượt là (67.8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với nồng độ đối chứng. Sự tương tác giữa 2 yêu tố BA và NAA tuy cho tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Ty lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức bé sung nồng độ BA
1 mg:L!+NẹAA 0 mg-L đạt 90%.
Tóm lại, sau 10 tuần nuôi cấy, càng tăng nồng độ BA thì tỷ lệ hình thành mô sẹo tăng. Kết quả cho thay, ở bat kì nồng độ NAA nào đều không dan tới sự hình thành mô sẹo. Sự kết hợp giữa nồng độ BA và NAA qua 10 tuần nuôi cấy vẫn không tạo ra kết quả khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Ở tất cả các nghiệm thức, các mẫu đều hình thành mô seo ở tuần 4 đến tuần thứ 6, dat tối đa ở nghiệm thức 1 mg-L và 0,25 mg-L
! tăng 1,14 lần và hầu hết các nghiệm thức đều xuất hiện ở tuần thứ 4. Khi nồng độ NAA tăng lên 0,5 mg-L có sự sụt giảm ở mức không có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này cho thay đường như việc b6 sung nồng độ NAA thì làm giảm quá trình tạo mô sẹo.
Điều này gợi ý rang dé hình thành mô sẹo cho cây sâm cau không can sử dụng NAA, thay vào đó sử dụng nồng độ BA cho quá trình tạo mô sẹo. Từ bảng trên cho thấy chỉ
25
cần sử dụng 1 mg-L! BA dé phát sinh mô seo sẽ giúp làm giảm chi phí sản xuất. Vì quá trình kích thích tạo ra chéi sâm cau nên việc bố sung nồng độ NAA trong quá trình tao mô sẹo rất cần thiết cho việc phát sinh chéi. Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan thường phải sử dụng loại chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau tùy theo mức độ cảm ứng của các tế bào trong mô hay cơ quan đó. Ở thí nghiệm này việc sử dụng mau lá cây Sâm cau in vitro 3 tháng tuổi, khi cấy trên môi trường được bồ sung auxin và cytokinin thì mẫu cây phông ra và to dần tạo thành mô sẹo. Kết quả này tương tự như kết quả thí nghiệm của Lê Hồng Giang và Đặng Thị Thúy Vân (2014) khi sử dụng nồng độ BA 1 mg-L" đã đạt tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở cây cà chua.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA va NAA đến tỷ lệ mẫu chết của cây sâm cau từ mẫu lá in
vitro ở các thời diém sau cay.
Tuansau = Nong độ Nong độ NAA
cay BA 0 0,25 0,5 =
0 0,0 20,0 30,0 16,7 4 | 0,0 6,7 13,3 6,7 3 3,3 16,7 13,3 11,1 3 0,0 0,0 13,3 4.4
TBNAA 0,820 10.8% 17.
CV(%)= 51,4; Ha=5,9"; Hg=18,7””; Han=5,3"
0 0,0 43,3 60,0 34,44 : | 3,3 26,7 33,3 #1 11
5 10,0 36,7 20,0 ð9 35 3 0,0 16,7 30,0 15,55
TB NAA 3,3 30,84 55,8"
CV(%)=32,73; Ha=3,31"; Hp=22,21""; Hap=5,61"
0 0,0 83,3 96,7 60 g | 10,0 46,7 60,0 38 2 20,0 46,7 33,3 33 3 20,0 20,0 43,3 27
TB NAA as 49,24 58,3"
CV(%)=19,09; HẠ=3,01"°: Hp=21,02""; Han=9,4 1
0 0,0 100,0 100,0 66,67 10 | 10,0 53,3 66,7 43,33 3 20,0 56,7 33,3 36,67 3 20,0 20,0 63,3 34,44
TB NAA in 575" 65,84 CV(%)10,41; Ha=2,44°; Hg=21,37””; Hap=10,17"°
Giá trị H tính theo S-R-H test. "": khác biệt không ý nghĩa (p > 0,05); **: khác biệt rat có ý nghĩa (p
< 0,01);
” Các số trong cùng một nhóm giá trị có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa theo trắc nghiệm
phan hang Dunn test ở mức p = 0,05.
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, việc bổ sung BA va NAA ở các mức khác nhau đã ảnh hưởng đến tỷ lệ chết của mẫu lá cây Sâm cau in vitro tại các thời điểm 4 TSC — 10
TSC.
Ở thời điểm 4 TSC, xét theo yếu tố nồng độ NAA 0,5 mg-L! có số mẫu chết cao nhất với 35,8%, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ 0,25 mg-L (30,8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa trong thống kê so với nồng độ đối chứng (0,8%). Sự tương tác giữa 2 yếu tố nồng độ NAA va BA tuy có tỷ lệ mẫu chết khác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê.
Ở thời điểm 6 TSC, yếu tố nồng độ NAA ở mức 0,5 mg-L? dẫn đến tỷ lệ mẫu chết cao nhất là 35,8%, tuy khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0,25 mg-L! (30,8%), nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0 mg-L! NAA (3,33%). Xét về yếu tố nồng độ BA và sự kết hợp giữa hai nồng độ NAA va BA khác nhau đều cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm
thức còn lại.
Ở thời điểm § TSC, các mẫu có dấu hiệu chết nhiều hơn các tuần đầu. Xét về yếu tố NAA, ở nồng độ 0,5 mg-L" cho tỷ lệ cao nhất là 58,33%, khác biệt có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại. Xét về yếu tố BA và sự kết hợp giữa nồng độ BA và NAA có tỷ lệ mẫu chết khác nhau ở các nghiệm thức nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê. Tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở nghiệm thức b6 sung nồng độ BA 0 mg-L! + 0,5 mg-L! NAA đạt tỷ lệ chết cao nhất là 96,7%.
Ở thời điểm 10 TSC, xét yếu tố nồng độ NAA, nồng độ NAA 0,5 mg-L! đạt tỷ lệ chết cao nhất (65,83%), khác biệt có ý nghĩa thông kê so với các nghiệm thức còn lại.
Nông độ BA và sự tương tác giữa các nồng độ BA va NAA khác nhau, tuy gây nên tỷ lệ mẫu chết khác nhau, nhưng lại khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Tóm lại, từ kết quả trên cho thây nồng độ NAA dẫn đến sự ngộ độc và gây chết mẫu. Điều này ảnh hưởng đến quá trình hình thành mô sẹo và dẫn đến mẫu chết. Qúa trình chết này một phần là ảnh hưởng của quá trình xuất tiết phenol trên môi trường trong đó cây sâm cau về ban chất có chứa nhiều hợp chat phenol. Trong nuôi cấy mô,
việc hóa nâu môi trường là vân dé thường gap cũng ảnh hưởng dén sự phát triên của mô.
27
Sâm cau chứa nhiều hợp chất phenolics, vì vậy khi cắt lá, lá bị vết thương và tiết ra
phenol. Phenol tự nhiên không hóa nâu nhưng gặp oxi thì trở nên hóa nâu và là nguyên
nhân dẫn đến tỷ lệ chết cao ở các nghiệm thức B0-N0,25; B0-N0,5; B2-N0,25; B1-N0,S;
B3-N0,5. Từ chỉ tiêu tỷ lệ hình thành mô sẹo và tỷ lệ mẫu chết cho thấy gia tăng thêm nồng độ BA thì mau sẽ kích thích hình thành mô seo, gia tăng thêm nồng độ NAA làm chết mẫu.
B0-N0,25 B1-N0,25
Hình 3. 1Môi trường hóa nâu
Tuy nhiên tỷ lệ mô sẹo chưa thé hiện hết tác động của sự kết hợp nồng độ BA và nồng độ NAA vì vậy việc khảo sát thêm chỉ tiêu kích thước mô sẹo nhằm làm rõ hơn sự tương tác giữa nồng độ BA và NAA (Bảng 3.3)
Tại thời điểm 10 TSC, kết quả cho thấy nồng độ NAA kết hợp với nồng độ BA khác nhau đã ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng sinh mô sẹo. Xét nồng độ NAA 0 mg-L ` có kích thước mô sẹo lớn nhất (1,05cm) rat có ý nghĩa về mặt thống kê với các nồng độ còn lại. Đối với yếu tô nồng độ BA 2 mg-L' có kích thước mô sẹo lớn nhất (1,06cm), tuy khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ BA 3 mg-L'! (có kích thước là 1,05 em), nhưng sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Nghiệm
thức bồ sung (0 mg-L'NAA + 2 mg-L! BA) đạt kích thước mô sẹo lớn nhất (1,72 em).
Cho tới thời điểm 10 TSC thì khi kết hợp các mức nồng độ NAA khác nhau mà không bổ sung BA thì các nghiệm thức đó không hình thành mô sẹo. Với nghiệm thức bồ sung nông độ BA 3 mg-L!+NAA 0,5 mg-L có kích thước nhỏ nhất (0,48cm) khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức khác.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến kích thước mô sẹo hình thành từ mẫu lá sâm cau thời điểm 10 TSC
Nồng độ Nồng độ NAA(mg-L) TBBA BA(mg-L”) 0 0,25 0,5
0 0,0! 0,0! 0,0! 0,0 1 1,094 0,99° 0,598 0,898 a 17 0,568 0,89 1,064 3 1,40° Le 0,488 Lia"
TB NAA 1,05" 0,718 0,49°
CV(%) = 4,94; FA= 1676,6**; Fa = 703,6**; Fan = 259,8**
Ghi chu: Cac giá trị trung bình trong cùng một nhóm giá trị có cùng đi kèm các kí tự thể hiện sự khác
biệt có ÿ nghĩa về thông kê; **: có ý nghĩa ở mức p<0,01.
Khi khảo sát kích thước mô sẹo ở tuần thứ 10, xét yếu tố nồng độ NAA ở mức 0 mg:L! cho kích thước mô sẹo lớn nhất (1,05 cm), sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ còn lại. Xét yếu tố nồng độ BA, việc bổ sung nồng độ BA 0 nồng độ 2 mg-L! cho kích thước mô sẹo lớn nhất (1,06 cm), tuy khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với nồng độ 3 mg-L' (1,05 cm), nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hai nồng độ còn lại. Xét về sự tương tác giữa nồng độ BA và NAA, rất có ý nghĩa thông kê. Kết quả cho thấy nghiệm thức bổ sung nồng độ B2-N0 (2 mg-L BA + 0 mg:L NAA), đạt kết quả cao nhất về kích thước mô sẹo, khác biệt rất có ý
nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.
Ngoài ra, việc hình thành và kích thước mô sẹo cũng ảnh hưởng một phan nao đó đến hình thái mô sẹo
29
Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái của mô sẹo hình thành từ lá cây Sâm cau sau 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy
Thời gian nuôi cây
Nghiệm thức x x x x xkiệt: 2 tuân 4 tuân 6 tuân 8 tuân 10 tuân
BO-NO Mau lácảmứng Mau lá xuât hiệnrê Mau lá xuât hiện rễ Mau lá xuat hiện rê Mẫu lá xuât hiện rễ Mô sẹo có màu Mô sẹo có màu s j :
ý Ẻ — ~. Mô seo có mau x 2 atl . trăng ngà dạng hoi vàng xanh, bên R TM:
Mau lá có màu ; Ẽ = ép sx sư , .. xanh, bên ngoài có i 5 xôp, có một vải ngoài có | lớp mau : Soe SA Ẹ Rak xanh. Mô seo hinh x ere a Oa: . 1 lớp màu nâu, có BI-N0 Mau lá uôn cong a dom màu nâu xung nâu, cótăngsinhvà |. 5 v
thành ở xung quanh SA AI z .. tăng sinh va ở dang zg quanh mau và một ở dạng chac. Một b x Ậ vet cat Lo me ⁄ 4# ; ;:^ Chắc Mau xuât
sô mau xuât hiện sô mâu xuât hiện „., À.
Re Re hiện chôi _chôi chôi
7 : : Mô sẹo có màu 5 Fe cues wai x 6 i . M6 sẹo màu vàng, _. xxx A^ Mô sẹo có màu nau, Mau lỏ cú mau _, x__ : + 2. Vàng và cú màu nõu ơ z x
& ' có sự tăng sinhí,ở nk ak : không có sự tăng x 1z Ấ xanh. Mô sẹo hình ro. „một sô điêm, có sự .. a
B2-N0 Mau lá uôn cong .. dạng chắc và một ,.-... ne sinh và ở dang thành 6xung quanh 2 © x x, +:a^_ tăng sinh và ở dang ý ANH Win:
Ag sO mau xuat hién Z x 4~ 7 chắc. Mau đã phat vét cat ie ~~ chac. Mau đã có .. se
chôi x. sinh chôi chối
Mô sẹo có màu Mô sẹo có màu Mau lá có màu i — vàng xanh, có màu vàng xanh, có màu x 1z Ấ : a 1 Mô sẹo màu vàng, _ Am Sh Am ea, „SP nhà Mau lá uôn cong và xanh. Mô sẹo hình , ae .„ nau một vai diém, một một vai diém, B3-N0 eae “se. có sự tăng sinhvàở _„, s : : “ ‘
phù lên thành ở xung quanh E có sự tăng trưởng có sự tăng trưởng me dang chac 5 ar
vét cat nhanh va ở dang nhanh và ở dang chắc chac
Mau lá xuât hiện
B0-N0.25 Mẫu lá còn xanh và hóa nâu ở vị trí vết © ak ak A. ae qh mo.
R —_ o; 8 A_ _. Mậu lá chêt Mẫu lá chêt Mẫu lá chêt không phản ứng cat và lan dân vào
bên trong
BI-N025 Mau lá uôncongvà Mau lá có màu Mô seo có màu Mô sẹo có màu Mô sẹo có màu phù lên xanh. Mô sẹo hình vàng, có tăng sinh, vàng, tăng trưởng vàng, tăng trưởng
B2-N0.25
B3-N0.25
B0-N0.5
BI1-N0.5
B2-N0.5
thanh 6 xung quanh vet cat
ở dạng chắc và một
sô mau bị chét phan thit la
it, ở dang chắc, xuat hiện chôi
Mau lá uốn cong va
phù lên
Mâu lá xuât hiện mô sẹo ở vêt cat
Mẫu lá xuất hiện
mô sẹo nhưng it
Mô sẹo tăng sinh, màu trắng ngà
Mau lá còn xanh và không phản ứng
Mẫu lá có dâu hiệu hóa nâu và chêt mầu
Mô sẹo có dấu hiệu
hóa nâu, không tăng sinh và ở dạng
xốp
Mô sẹo có màu vàng, có tang sinh,
ở dạng chắc và một số mẫu có choi
Mẫu lá chết
Mau lá uôn cong và phù lên
Mẫu lá có màu
xanh. Mô sẹo hình thành ở xung quanh
vết cắt
Mô sẹo có hiện tượng hóa nâu, không có sự tăng
sinh, một số mẫu chết và ở dạng xốp
Mô sẹo có màu nâu, không có sự tăng
trưởng, ở thể mô xốp dạng viên. Một số mô sẹo chết
Mô sẹo có màu vàng xanh, có màu
một một vài điểm,
có sự tăng trưởng nhanh và ở dạng
chắc. Mẫu đã có
_chôi
Mẫu lá chết
Mô sẹo có màu nâu, không có sự tăng
trưởng, ở thể mô xốp đạng viên. Một số mô sẹo chết
Mẫu lá uôn cong và phù lên
Mẫu lá có màu
xanh. Mô sẹo hình thành ở xung quanh
vết cắt
Mô sẹo có màu vàng, có tăng sinh,
ở dạng chắc và một số mẫu có chéi
Mô sẹo có mau vàng xanh, có sự tăng trưởng chậm
và ở dạng chắc
ít, ở dạng chắc, xuât hiện chôi
Mô sẹo có màu nâu, không có sự tăng
trưởng, ở thể mô xốp dạng viên
Mô sẹo có màu vàng xanh, có màu
xanh một vài điểm,
có sự tăng trưởng nhanh và ở dạng
chắc. Mẫu có chồi
Mẫu lá chết
Mô sẹo có màu nâu, không có sự tăng
trưởng, ở thể mô xốp dạng viên.
Mô sẹo có màu vàng xanh, có sự tăng trưởng chậm
và ở dạng chắc