Rượu vang xác Định hàm lượng glucose và fructose phương pháp enzyme tcvn 12084 2017

Phạm vi ứng dụng - Tiêu chuẩn TCVN 12084:2017 quy định phương pháp enzyme để xác định hàm lượng glucose và fructose trong rượu vang 2.. PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE, FRUCTOSE G

RƯỢU VANG GVHD TS Hoàng

Quốc Tuấn

Nhóm sinh viên:

Hán Thị Thúy Nga 20211503 Nguyễn Quỳnh Mai 20211493 Phạm Tuấn Kiệt 20211476

Xác định hàm lượng Glucose và Fructose

Phương pháp enzyme

TCVN 12084: 2017

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

1 Phạm vi ứng dụng

- Tiêu chuẩn TCVN 12084:2017 quy định phương pháp enzyme để xác định hàm lượng glucose và fructose trong rượu vang

2 Nguyên tắc

Glucose và fructose được phosphoryl hoá bởi adenosine triphosphat (ATP) trong quá trình phản ứng enzym xúc tác bởi hexokinase (HK), tạo thành glucose-6-phosphat (G6P) và fructose-6-phosphat (F6P):

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

G6P được oxy hóa thành gluconat-6-phosphat bởi nicotinamit adenin dinucleotit phosphat (NADP) với sự có mặt của enzym glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH) Lượng nicotinamit adenin dinucleotit phosphat dạng khử (NADPH) được tạo thành tương ứng với lượng G6P và lượng glucose.

NADPH được xác định từ độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm.

Ở cuối phản ứng này, F6P được chuyển thành G6P bởi enzym phosphoglucose isomerase (PGI):

G6P lại phản ứng với NADP tạo thành gluconat-6-phosphat và NADPH, đo phổ để xác định NADPH

3 Thuốc thử

- Dung dịch đệm trietanolamin

- Dung dịch nicotinamit adenin dinucleotit phosphat

- Dung dịch adenosine-5’-triphosphat

- Huyền phù hexokinase/glucose-6-phosphat-dehydrogenase

- Huyền phù phosphoglucose-isomerase

4 Thiết bị, dụng cụ

- Máy đo quang phổ

- Cuvet thủy tỉnh/cuvet dùng một lần

- Pipet

- Pipet dùng cho dung dịch enzym

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

5 Cách tiến hành

a Chuẩn bị mẫu: Tùy thuộc vào hàm lượng glucose và fruotose ước tính có

trong một lít (g/l), pha loãng mẫu như sau:

Hàm lượng glucose và fructose ước tính, g/l

Phép đo ở bước sóng

340 nm và 334 nm Phép đo ở bước sóng 365 nm

Bảng 1 – Hướng dẫn pha loãng mẫu

b Xác định

- Dùng máy đo quang phổ chỉnh đến bước sóng 340 nm, thực hiện các phép đo

sử dụng không khí (không có cuvet trong đường quang) hoặc dùng nước để so sánh.

- Cài đặt nhiệt độ từ 20°C đến 25°C.

- Cho vào hai cuvet có chiều dài đường quang 1 cm các dung dịch sau:

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

Dung dịch Thể tích cho vào

cuvet so sánh (mẫu trắng), ml

Thể tích cho vào cuvet mẫu thử, ml

Dung dịch đệm trietanolamin ở 20°C 2,50 2,50

Dung dịch nicotimanit adenin dinucleotit phosphat 0,10 0,10

Dung dịch adenosine-5’-triphosphat 0,10 0,10

Trộn đều, sau 3 min đọc độ hấp thụ của dung dịch (A1) Bắt đầu cho phản ứng bằng cách bổ sung:

Dung dịch hexokinase/glucose-6-phosphat-dehydrogenase 0,02 0,02

Trộn đều, sau 15 min đọc độ hấp thụ (A2) và sau mỗi 2 min tiếp theo kiểm tra xem phản ứng đã dừng hay chưa Khi phản ứng dừng, bổ sung ngay:

Dung dịch phosphoglucose-isomerase 0,02 ml 0,02 ml

Trộn đều, sau 10 min đọc độ hấp thụ (A3) và sau mỗi 2 min tiếp theo kiểm tra xem phản ứng đã dừng hay chưa.

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

Bảng 2 – Thể tích dung dịch cho vào hai cuvet

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

6 Tính toán

Hàm lượng glucose và fructose của mẫu thử, C, tính bằng gam trên lít (g/l) được tính theo Công thức (1):

- V1 là thể tích của dung dịch thử trong cuvet (xem Bảng 2),tính bằng mililit

đối với phép xác định glucose: V = 2,92 ml

đối với phép xác định fructose: V = 2,94 ml;

PP ENZYM-XĐ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSE,

FRUCTOSE

- V2 là thể tích của dung dịch mẫu bổ sung vào cuvet, tính bằng milllt (V2 = 0,02 ml);

- M là khối lượng phân tử glucose hoặc fructose, tính bằng gam trên mol (M = 180,16

g/mol);

- F là hệ số pha loãng mẫu (xem Bảng 1);

- là hệ số hấp thụ NADPH ở bước sóng 340 nm ( = 6,3 mmol -1 x l x cm-1 ).

ở bước sóng 340 nm: = 6,3 mmol -1 x l x cm-1

ở bước sóng 365 nm: = 3,5 mmol -1 x l x cm-1

ở bước sóng 334 nm: = 6,18 mmol -1 x l x cm-1

- d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng xentimet (d = 1 cm),

- ∆A là chênh lệch độ hấp thụ

đối với phép xác định glucose: ∆A glucose = (A2 – A1)mẫu – (A2 – A1)mẫu trắng

đối với phép xác định fructose: ∆A fructose = (A3 – A2)mẫu – (A3 – A2)mẫu trắng.

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

1 Phạm vi áp dụng:

Định lượng đường khử, đường tổng bằng phương pháp

chuẩn độ oxy hóa khử với ferrycyanure

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

2 Nguyên tắc

Khi cho ferrycyanure phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là

ferrocyanure Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt

trong dung dịch cần xác định Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường

kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen Phương trình phản ứng:

Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dựng dung dịch kiềm của sulfat đồng

do không tạo tủa và phản ứng kết thúc rỏ rang Kết quả tính toàn không dựa vào phương trình lý thuyết, mà dựng công thức thực nghiệm Độ chính xác của kết quả phụ thuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác là quang trọng nhất Tất cả monosacarit và oligosacarit là đường khử Các oligosacarit và polysacarit dễ

bị thủy phân thành monosacarit vì vậy có thể định lượn đượng khử trước và sau thủy phân để tính hàm lượng của chúng.

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

3 Hóa chất và dụng cụ

- Dụng cụ: Bếp đện, kẹp, lưới amiang, nồi cách thủy, phễu, ống đong, bình định mức, becher, erlen, burette, pipette

methylen blue 0,04%

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

4 Tiến hành

- Cân 10 g nguyên liệu, cho vào bình định mức Nhỏ 3 giọt chỉ thị metyl đổ và cho từng giọt NaOH 5% vào đến khi

xuất hiện màu hồng nhạt Lắc đều trong 10 phút định mức đến vạch và đem lọc

- Sau khi lọc, lấy dung dịch mẫu chứa đường khử, cho vào burette

ml dung dịch NaOH 2,5N

- Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử từ burette, cho từng giọt một, lắc mạnh

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

- Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferrycyanure Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến

mất, dung dịch trong suốt không màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị metylen xanh và một giọt đường thừa sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc

- Lặp lại thí nghiệm chuẩn độ 3 lần

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

5 Tính kết quả

Trong thí nghiệm Vk ml đung dịch mẫu và Vg dung dịch glucose 0,5% cùng phản ứng với một đung dịch ferrycyanure ở một nồng độ nhất định Như vậy, Vk ml dung dịch mẫu tương ứng với Vg ml dung dịch glucose 0,5% có (0,5 x Vg)/100 g glucose

Lượng đường khử được tính bằng công thức:

PP CHUẨN ĐỘ OXI HÓA KHỬ- XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ

Xk: lượng đường khử, g/100 g hay g/100ml

Vg: thể tích dung dịch glucoza 0,5% cho chuẩn

độ, ml

Vk: thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn

độ, ml

V: thể tích định mức ml

m: lượng mẫu thí nghiệm, g hoặc ml

THANK

YOU !