Do đó, việc phát hiện, xác định và phân tách hiệu quả các mẫu bị nhiễm aflatoxin và/hoặc nấm là rất quan trọng để giảm nguy cơ aflatoxin xâm nhập vào chuỗi thực phẩm.... Chúng đã được ch
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *********************
TIỂU LUẬN
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đề tài : Xác định hàm lượng aflatoxin trong thực
phẩm( mẫu phô mai trắng ) bằng phương pháp chạy sắc kýkhối phổ (LC-MS)
Giảng viên hướng dẫn : PGS Quản Lê Hà
TS Nguyễn Trường Giang
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thành ThắngMSSV : 20200609
Mã học phần: BF3708Mã lớp : 142418
Hà Nội, 2023
Trang 3I, Tổng quan1, Khái niệm
Aflatoxin là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp có độc tính cao được tạo ra bởi nấmthuộc chi Aspergillus (A.), chủ yếu là A flavus và A parasiticus Thuật ngữ “aflatoxin”xuất phát từ ba từ: Aspergillus (chi), flavus (loài) và độc tố Trong số 18 loại aflatoxin khác nhau được xác định cho đến nay, các loại xuất hiện tự nhiên đã được biết đến là aflatoxin B1 (AFB1, C17H12O6), aflatoxin B2 (AFB2, C17H14O6), aflatoxin G1 (AFG1, C17H12O7) và aflatoxin G2 (AFG2, C17H14O7 ) , với AFB1 là loại phổ biến nhất, gây ung thư Các aflatoxin có nguồn gốc sinh tổng hợp từ tiền chất acetate
hemiacetal versiconal thông qua con đường polyketide Về mặt cấu trúc, aflatoxin là một nhóm các hợp chất dị vòng difuranocoumarin được oxy hóa cao, chứa các vòng furofuran, vòng lactone, vòng sáu cạnh thơm và/hoặc nửa vòng pentanone (hình 1.1) Aflatoxin được biết đến là chất gây độc cho gan, gây ung thư gan, gây quái thai và gây đột biến, và được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế của WHO coi là chất gây ung thư loại 1 ở người Trong số hơn 400 loại độc tố nấm mốc đã biết, aflatoxin, đặc biệt là AFB1, vẫn là loại độc nhất Tuy nhiên, hơn 5 tỷ người ở các nước đang phát triển được báo cáo là tiếp xúc thường xuyên với aflatoxin qua thực phẩm Ước tính, số ca tử vong ở Indonesia vì ung thư gan do aflatoxin gây ra khoảng 20.000 ca/năm Hơn nữa, ô nhiễm aflatoxin có thể dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng, lên đến 250 triệu đô la cho nông dân Các nhà kinh tế của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ ướctính thiệt hại hàng năm do ô nhiễm aflatoxin ở Hoa Kỳ là ~ 500 triệu đô la thông qua hai loại thiệt hại, bị từ chối đưa ra thị trường và ảnh hưởng đến sức khỏe động vật Ngoài ra, các sản phẩm bị nhiễm nấm Aspergillus cũng có thể chứa các mối nguy hiểm tiềm ẩn do có đặc tính sản sinh aflatoxin Nhiễm aflatoxin và nhiễm nấm có thể xảy ra phổ biến hơn ở vùng khí hậu nhiệt đới và ẩm ướt trong nhiều loại sản phẩm nông nghiệp trong cả giai đoạn trước và sau thu hoạch Trên đồng ruộng, nhiệt độ cao, điều kiện khô hạn kéo dài và hoạt động mạnh của côn trùng là những yếu tố quan trọng gây ônhiễm aflatoxin trước thu hoạch Nhiệt độ ấm và độ ẩm cao là những yếu tố góp phần làm tăng sự xâm nhập của nấm và sản sinh độc tố trong các giai đoạn sau thu hoạch baogồm bảo quản, chế biến, vận chuyển và bán Do đó, việc phát hiện, xác định và phân tách hiệu quả các mẫu bị nhiễm aflatoxin và/hoặc nấm là rất quan trọng để giảm nguy cơ aflatoxin xâm nhập vào chuỗi thực phẩm.
Trang 41.1 Cấu trúc phân tử aflatoxin
2, Sự tìm ra Aflatoxin
Vào cuối những năm 1950 và đầu những năm 1960, một bệnh mới ở gà tây gây nên tỷ lệ tử vong cao được tìm ra ở Anh Sau khi dịch bệnh bùng phát không rõ bản chất và nguyên nhân (bệnh “X”), việc phát hiện ra aflatoxin bắt đầu Tổng cộng 100.000 con gà tây đã chết vì bệnh gà tây “X” sau khi được cho ăn bằng bột lạc Brazil bị ô nhiễm tại một trang trại gia cầm ở London.
2.1 William Percy Blount (*1905–+1968) Ảnh: World’s Poultry Science Association.
William Percy Blount (Hình 2.1) là một nhà khoa học thú y và chuyên gia tư vấn về chăn nuôi gia cầm W.P Blount đã tiến hành nghiên cứu chuyên sâu trong phòng thí nghiệm và thực địa, những phát hiện và kết luận đã được công bố vào năm sau đó Nhiều cá thể bị bệnh nằm ở khoảng 4–6 tuần tuổi, nhưng có một số con khác ở độ tuổi 10–16 tuần Gà tây bị bệnh thường rũ xuống sàn nhà và trở nên lơ mơ, chết trong vòng 24–48 giờ Một đặc điểm khác của bệnh là vị trí hoặc tư thế của gia cầm khi chúng chết.
Trang 5Mối quan giữa độc tính trong bột lạc Brazil và bệnh tật đã được chứng minh bởi W.P Blount, người đã mô tả chính xác các triệu chứng, đặc biệt là tổn thương gan, và sau đó loại trừ rằng căn bệnh này có thể là nguyên nhân của các tác nhân truyền nhiễm.
Nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus Link ex Fries được xác định trong Phòng thí nghiệm thú y trung ương tại Weybridge ở Anh.
Tên aflatoxin
Độ hấp thụ UV (nm)
Phát xạ huỳnh quang (nm)
265362
Trang 6B2 C17H14O6 314 286-289 265 425363
Aflatoxin được chuyển đổi thành dạng 8,9-epoxide phản ứng (còn được gọi là 2,3 epoxide) có khả năng liên kết với cả ADN và protein bởi enzyme cytochrom P450 Epoxit aflatoxin phản ứng liên kết với vị trí N7 của guanin Hơn nữa, các chất bổ sung aflatoxin B1-ADN có thể dẫn đến chuyển đổi từ GC sang TA Một hệ thống glutathioneS-transferase phản ứng được tìm thấy trong tế bào chất và microsome xúc tác sự kết hợpcủa aflatoxin hoạt hóa với glutathione khử, dẫn đến bài tiết aflatoxin Các giá trị LD50 (liều gây chết trung bình) đối với aflatoxin B1 và G1 lần lượt là ≤18 và 12-16 mg./kg trọng lượng cơ thể.
aflatoxin-II, Nguồn gốc
AF được sản xuất chủ yếu bởi A flavus và Aspergillus parasiticus Hai loài Aspergillus khác, A nomius và A.pseudotamarii, cũng có thể tạo ra AF Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae, các chủng quan trọng được sử dụng trong công nghiệp lên men, là tổ
Trang 7tiên của A flavus và A parasiticus Chúng đã được chứng minh rằng chúng không bao giờ tạo ra AF bằng cách phân tích các gen sinh tổng hợp AF của chúng.Aflatoxin B1 và B2 (AFB1 và AFB2, AF series B), G1 và G2 (AFG1 và AFG2, series G) là sản phẩm tựnhiên A parasiticus tạo ra cả hai series AF, trong khi A flavus chỉ tạo ra series B do thiếu enzyme sinh tổng hợp để sản xuất G Aflatoxin M1 và M2 (AFM1 và AFM2) lần lượt là các sản phẩm trao đổi chất của AFB1 và AFB2, lần đầu tiên được phân lập từ sữa của động vật đang cho con bú được cho ăn thức ăn bị nhiễm AF.
Trang 8Hiển vi quang học của A.flavus
Trang 9III, Phương pháp phân tích
Sữa và các sản phẩm từ sữa là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng cần thiết cho sự phát triển và duy trì sức khỏe của con người Do đó, người tiêu dùng từ các nước đang phát triển phải đối mặt với các vấn đề về an ninh lương thực và an toàn thực phẩm vì họ phụ thuộc vào thực phẩm sản xuất tại địa phương.Về vấn đề này, sự hiện diện của aflatoxin trong sữa và các sản phẩm từ sữa là một vấn đề nghiêm trọng ở các nước đang phát triển Về mặt trao đổi chất, AFM1 là chất chuyển hóa hydroxyl hóa của aflatoxin B1 AFM1 được bài tiết vào sữa qua tuyến vú của người và động vật đang cho con bú Khoảng 0,3%–6,2% AFB1 được chuyển đổithành AFM1 và bài tiết qua sữa tùy thuộc vào nhiều yếu tố (ví dụ: di truyền, sự thay đổitheo mùa, quy trình vắt sữa và điều kiện môi trường) AFM1 trong sữa có khả năng chống phân hủy nhiệt cao trong quá trình xử lý sữa như thanh trùng hoặc tiệt trùng Do đó, sự nhiễm AFM1 không chỉ xảy ra ở sữa chế biến thương mại mà còn ở các sản phẩm sữa sản xuất Ở bài tiểu luận này, em sẽ trình bày các bước để phân tích aflatoxin M1 trong phomat trắng.
1, Chuẩn bị mẫu
- Phô mai trắng được mua ngẫu nhiên từ các siêu thị Tất cả các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 3°C trong thiết bị làm lạnh trước khi phân tích Mẫu pho mát được xử lý để phân tích theo Mayesand MacDonalds:
- 40g pho mát băm nhỏ được thêm vào Celite® 545 (10 g), chloroform (150 mL) và dung dịch NaCl (2 mL) bão hòa, trộn ở tốc độ trung bình trong 2–3 phút để tạo thành huyền phù đặc
- Huyền phù được lọc qua giấy lọc Whatman® số 4 Dịch lọc thu được được làm bay hơi trong điều kiện chân không ở 60°C đến khô bằng thiết bị cô quay 60 ml dung dịch muối đệm phốt phát, topH 7.4 đã điều chỉnh và 2 mL metanol được thêm vào phần cặn đã sấy khô và cho vào phễu chiết (500 mL) Hexan (100 mL) được thêm vào phễu chiết và hỗn hợp này được lắc mạnh để loại bỏ mẫu chứa nước Các lớp được để riêng biệt vàmột phần của lớp dưới (nước) (50 mL) được thu thập để phân tích Từ mỗi mẫu, một lượng dịch lọc (50 mL) được đưa qua cột có ái lực miễn dịch chứa các kháng thể đơn dòng liên kết với vật liệu hỗ trợ rắn Các lớp được phép tách ra và một phần 50 mL của lớp nước phía dưới được thu thập để phân tích Một phần 10 mL (tương đương với 2 g mẫu phô mai) được truyền dưới trọng lực vào cột ái lực miễn dịch và 40 mL còn lại được giữ ở các lọ thủy tinh −20°Cin để phân tích thêm nếu cần Các thành phần khác của mẫu nền được rửa sạch khỏi cột bằng 10 mL nước Sau đó, chất này được rửa giải
Trang 10từ từ khỏi cột bằng 3 mL axetonitril, và dịch chiết được làm bay hơi đến 300 μg/ml) và dễ tan trong các dung môi phân cực vừa L dưới dòng khí nitơ và được hòa tan lại thành 3 mL pha động HPLC (10 mM) gồm axetonitril,metanol và amoni axetat theo tỷ lệ 2:6:15 Sau đó, các mẫu đã sẵn sàng để tiêm
Dung dịch chuẩn AFM1:
- Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch chuẩn trung gian của AFM1 trong acetonitril ở nồng độ tương ứng là 5 mg/mL và10 mg/mL Theo Phương pháp Chính thức Quốc tế (AOAC) 970.44 các dung dịch làm việc cũng được chuẩn bị bằng cách pha loãng thích hợp với axetonitril Các phần thích hợp của dung dịch gốc AFM1 được pha loãng bằng pha động thành các nồng độ 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 và 40,0 ng/mL (ppb) Các dung dịch được sử dụng để tạo thành cả hai đường chuẩn phù hợp với dung môi và nền Để kiểm chứng, các phần thích hợp của dung dịch gốc AFM1 được pha loãng với metanol thành các nồng độ 0,625, 1,25, 0,250, 0,5 và 1 ng/mL (ppb).
2, Điều kiện sắc ký
Sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ LC -MS loại tứ cực đơn với nguồn ion hóa kiểu ESI Chọn chế độ khảo sát tự động để chọn ion mẹ, ion con dùng để định lượng, định tính Các thông số MS/MS được tự động tối ưu bằng chế độ MS tune của thiết bị Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột phân tích pha đảo (150 mm × 2 mm x 5-μg/ml) và dễ tan trong các dung môi phân cực vừa m
(Phenomenex, Torrance, CA, USA)
- Cột sắc ký: Optima ODS-H, kích thước 50mm x 2,1mm x 3 micromet- S/N: ODS-H-OL3-36550
+ Lưu lượng khí hóa hơi 350 (L/Hr)+ Lưu lượng khí hội tụ: 50 (L/Hr)
Trang 11Dữ liệu được phân tích bằng kiểm tra t, kiểm tra xác suất chính xác của Fisher và kiểm tra tuyến tính của đường chuẩn theo xác suất, p <0,05, sử dụng gói thống kê SPSS của IBM
3 Hàm lượng chất phân tích, độ chính xác và phạm vi đo của phương pháp (detector )Giới hạn phát hiện (LOD): 0,125 ppb
Giới hạn định lượng (LOG): 0,250 ppbPhạm vi đo: khoảng 9 đến 100 ng/L
Độ chính xác của phương pháp: khoảng 99,25%Giá trị chính xác: 8,67%
IV, Tài liệu tham khảo
Tao, F., Yao, H., Hruska, Z., Burger, L W., Rajasekaran, K., & Bhatnagar, D (2018) Recentdevelopment of optical methods in rapid and non-destructive detection of aflatoxin and fungalcontamination in agricultural products Trends in Analytical Chemistry, 100, 65–81.https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.12.017
Pickova, D., Ostry, V., Toman, J., & Malir, F (2021) Aflatoxins: History, Significant Milestones,Recent Data on Their Toxicity and Ways to Mitigation Toxins, 13(6), 399.https://doi.org/10.3390/toxins13060399
Kumar, V V (2018) Aflatoxins: Properties, Toxicity and Detoxification Nutrition & Food ScienceInternational Journal, 6(5) https://doi.org/10.19080/nfsij.2018.06.555696
Kamel, E., Bazalou, M S., Sdeek, F A., & Konuk, M (2017) Comparison of liquid chromatography instruments with single quadrupole and tandem mass spectrometry for trace level
analysis: Aflatoxin m1 (afm1) in white cheese International Journal of Food Properties
https://doi.org/10.1080/10942912.2017.1369435