THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN LIỆU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN SỮA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (ESI HPLC – MS/MS)

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN … : 2019 Xuất lần THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN LIỆU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN SỮA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (ESI HPLC – MS/MS) Foodstuffs and Raw Materials – Identification of Milk Proteins – Liquid chromatographic tandem mass spectrometry (ESI HPLC-MS/MS) HÀ NỘI – 2019 TCVN … : 2019 TCVN … : 2019 Lời nói đầu TCVN … : 2019 xây dựng sở tham khảo AOAC 2017.12 Identification of Milk Proteins in Raw Materials and Finished Goods ESI HPLC-MS/MS; TCVN … : 2019 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN … : 2019 TCVN … : 2019 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN … : 2019 Thực phẩm nguyên liệu - Xác định hàm lượng protein sữa Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (ESI HPLC-MS/MS) Foodstuffs and Raw Materials – Identification of Milk Proteins – Liquid chromatographic tandem mass spectrometry (ESI HPLC-MS/MS) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định tính xác định protein sữa mẫu nguyên liệu thành phẩm thực phẩm Giới hạn phát phương pháp Nguyên tắc Mẫu rắn chiết xuất urê 5,0 M dung dịch đệm Tris 50 mM, sau khử dithiothreitol (DTT) M 30 phút kiềm hóa iodoacetamide 0,5M 30 phút Dịch chiết thủy phân thêm dung dịch trypsin 37°C qua đêm, sau làm nguội axit formic Sau lọc ống tiêm dùng lần lọc ống tiêm nylon 0,22 µm, dịch chiết pha loãng (1:10) với axit formic 0,1% chất chuẩn nội 200 ng/mL phân tích LC-MS/MS Phương pháp sử dụng peptide -4-casomorphin 1-4 làm chất nội chuẩn (IS) Nhận dạng protein sữa dựa so sánh với mẫu giới hạn báo cáo phương pháp (MRL), làm từ nguyên liệu thô xác định PCR Thuốc thử Tất thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích, nước sử dụng nước cất hai lần nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác 3.1 Nước siêu tinh khiết (H2O), ≥ 16 MΩ/cm 3.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC (CAS No 75-05-8) TCVN … : 2019 3.3 Axit formic (HCOOH), độ tinh khiết ≥98.5% purity (CAS No 64-18-6) 3.4 Iodoacetamid (NaCl), loại thủy phân protein (CAS No 144-48-9) 3.5 DTT, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 3483-12-3) 3.6 Urea, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 57-13-6) 3.7 Ammonium bicarbonat, độ tinh khiết ≥ 99.5% pure (CAS No.1066-33-7) 3.8 Trypsin, loại thủy phân protein (CAS No 9002-07-7) 3.9 Trizma base, loại dùng cho sinh học phân tử (CAS No 77-86-1) 3.10 Phosphate buffered salin (PBS), loại dùng cho sinh học phân tử 3.11 Dimethyl sulfoxide (DMSO), loại dùng cho HPLC (CAS No 67-68-5) 3.12 Peptide tham chiếu β-Casomorphin 1-4 (bovine) (YPFP) 3.13 Mẫu kiểm soát (LCS), Sử dụng để kiểm sốt tín hiệu peptide 3.13 Dung dịch đệm Tris M (PB), 0,1 M Chuyển 60,57 g Trizma base (MW =121,14) vào ống đong 500 ml thêm ~ 350 ml nước cất siêu tinh khiết Sau Trizma base hòa tan, dùng nước cất siêu tinh khiết đổ đầy đến vạch 3.14 Đệm chiết (urê M Tris đệm 50 mM) Chuyển 300,3 g urê (MW = 60,06) vào ống đong L thêm ~ 600 ml nước cất siêu tinh khiết Đậy nắp ống đong parafilm khuấy từ urê tan hết (dung dịch bị giảm nhiệt độ Đảm bảo dung dịch trở lại nhiệt độ phòng trước tiếp tục bước tiếp theo) Thêm 50 ml đệm Tris M làm đầy đến vạch nước cất siêu tinh khiết 3.15 Dung dịch khử (DTT M) Chuyển 1,697 g DTT (MW = 154,2) vào ống 15 ml hình nón thêm 11 ml nước cất Lắc vortex tan hết, dung dịch trở nên suốt Lưu trữ – 20°C sử dụng vòng lần phân tích 3.16 Đệm thủy phân (amoni bicarbonate100 mM) Chuyển 3,953 g amoni bicarbonate (MW = 79,06) vào ống đong 500 ml thêm 400 ml nước cất Định mức đến vạch nước cất siêu chuyển vào lọ đựng TCVN … : 2019 3.17 Dung dịch trypsin gốc (~ 50 mg/ml) Chuyển 525 mg trypsin vào ống hình nón 15 ml thêm 10,5 ml đệm thủy phân Trộn dung dịch ống nhẹ nhàng cách đảo ngược trypsin tan hết (khơng Vortex trypsin dung dịch) Lấy 1200 µl phần dung dịch vào ống ly tâm 1,5 ml, dán nhãn TRYP 50 bảo quản – 20°C, dùng hai lần trước bỏ 3.18 Dung dịch Trypsin làm việc (~ 500 μg/ml) Lấy lọ dung dịch trypsin gốc 50 mg/ml từ tủ đông để tan băng hoàn toàn trước sử dụng Chuyển 400 μl đến ống hình nón 50 ml pha lỗng đến 40 ml dung dịch đệm thủy phân Trộn nhẹ nhàng đảo ống liên tục (không vortex dung dịch trypsin) Lấy 1500 µl phần dung dịch vào ống ly tâm 1,5 ml, dán nhãn TRYP 500 bảo quản – 20°C, dùng hai lần trước bỏ 3.19 Dung dịch bảo vệ alkyl hóa (iodoacetamid 0,5 M) Iodoacetamide hóa chất độc hại nên sử dụng cần có thiết bị bảo vệ cá nhân, bao gồm áo thí nghiệm, găng tay kính an tồn Chuẩn bị dung dịch alkylation trước sử dụng Loại bỏ phần khơng sử dụng hết Mỗi mẫu, hịa tan 185 mg iodoacetamide (MW = 184,96) ml nước cất Vortex tan hoàn toàn 3.20 Nội chuẩn (IS; β-casomorphin 1-4, ypfp) Cân ~ 40 mg β-casomorphin 1-4 peptide vào bình định mức 25 ml, hòa tan đệm PBS, trộn định mức đến vạch Pha dung dịch trung gian ~ 100 μg/ml 25 mL với PBS Chuẩn bị dung dịch làm việc nồng độ ~ 2000 ng/ml 50 ml PBS Ghi nhãn "bcas 2000" bảo quản – 20°C 3.21 Mẫu kiểm sốt nội phịng thí nghiệm LCS Một hỗn hợp mẫu protein nguyên liệu chuẩn bị bảo đảm nguồn protein mức hàm lượng hỗn hợp mẫu chuẩn cuối Đối với mẫu protein nguyên liệu sử dụng hỗn hợp mẫu chuẩn, sử dụng phân tích Kjeldahl để tính tốn trọng lượng mẫu cần sử dụng hỗn hợp mẫu chuẩn Đối với ~ 100 g composite từ nguyên liệu, sử dụng phương trình sau để tính tốn trọng lượng nguồn protein: Lượng mẫu X (g) = (100 g hỗn hợp / tổng số mẫu) × (giá trị protein trung bình mẫu theo Kjeldahl / kết protein mẫu X theo Kjeldahl) 3.22 Mẫu MRL - 1000 ppm (0,1%) Trộn mẫu LCS với mẫu trắng Mức trung bình phần trăm thành phần nguyên liệu sử dụng để tính tốn lượng LCS cần thiết để thêm chuẩn mức nồng độ mong muốn Ví dụ, tính toán cho lượng LCS để tạo hỗn hợp 10 g lúc ban đầu 20 000 ppm (2%) là: Hàm lượng LCS = (10 g Mix × 2%)/19.79% = 1,01 g TCVN … : 2019 Các mẫu thêm chuẩn LCS trộn mẫu âm tính 3.23 Pha động A (axit formic 0,1% nước) Lấy 500 μl axit formic vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch nước cất, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, rung siêu âm khử khí trước sử dụng 3.24 Pha động B (acid formic 0,1% acetonitril) Lấy 500 μL axit formic vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch acetonitril, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, rung siêu âm khử khí trước sử dụng 3.25 Dung mơi rửa kim (95% acetonitril - 5% nước) Lấy 25 mL nước cất vào ống đong 500 ml Làm đầy đến vạch acetonitril, chuyển sang chai thủy tinh, trộn đều, rung siêu âm khử khí trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ 4.1 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) —Shimadzu 20AXL tương đương 4.2 Detertor khối phổ ba tứ cực — AB Sciex Triple 5500 tương đương 4.3 Cột HPLC column — C18, 150 × 4.6 mm x 3.5 µm , Waters tương đương 4.4 Tiền cột C18 HPLC — C18 Waters tương đương 4.5 Máy ly tâm — tốc độ tối thiểu 4000 r/min 4.6 Cân phân tích — độ xác 0,0001 g 4.7 Pipette xác — loại điều chỉnh thể tích từ 10-100 µL từ 100-1000 µL 4.8 Pipette tip — loại dùng cho pipette (4.7) 4.9 Xy-lanh — ml 4.10 Màng lọc mẫu — 0,22 μm 4.11 Ống ly tâm — 1,5, 15 50 ml 4.12 Vial — thể tích ml 4.13 Tủ ấm — Ổn định nhiệt độ 37°C 4.14 Tủ lạnh — Ổn định nhiệt độ 2–8°C TCVN … : 2019 4.15 Tủ đông — Ổn định nhiệt độ –20°C 4.16 Bếp điều nhiệt — Ổn định nhiệt độ 55°C 4.17 Bể rung siêu âm 4.18 Máy lắc vortex Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Mẫu phòng thử nghiệm nhận phải mẫu đại diện không bị hư hỏng bị biến đổi chất lượng suốt trình bảo quản vận chuyển Cách tiến hành (a) Trộn mẫu trước cân Chuyển 500 mg vào ống ly tâm 15 ml (b) Chuẩn bị mẫu riêng biệt để tránh vón cục ống (c) Thêm 10 ml đệm chiết, lắc xoáy 10 – 60 s mẫu đồng (d) Siêu âm 60 (làm nóng bể siêu âm trước cho mẫu vào siêu âm) (e) Ly tâm mẫu 10 tốc độ 4000 r/min (f) Chuyển ml dịch chiết pipet vào ống ly tâm hình nón 15 ml thêm 150 μl dung dịch khử (g) Lắc xốy mẫu để trộn Đun nóng 30 bể điều nhiệt 55°C (h) Làm mát nhiệt độ phòng (trong làm mát, chuẩn bị dung dịch alkyl hóa) (i) Alkyl hóa mẫu riêng biệt Thêm 1,2 ml dung dịch alkyl hóa, trộn máy lắc xoáy, để mẫu tránh ánh sáng nhiệt độ phòng 30 (j) Sau alkyl hóa, thêm ml dung dịch đệm thủy phân vào mẫu (k) Trộn cẩn thận nhiều lần (l) Thêm 250 μL dung dịch trypsin (m) Trộn cẩn thận ống nhiều lần TCVN … : 2019 (n) Ủ mẫu qua đêm tủ ấm 37°C (Ghi thời điểm bắt đầu kết thúc trình ủ mẫu) (o) Thêm 400 μL axit formic để dừng phản ứng (p) Trộn cẩn thận nhiều lần tránh tạo bọt, việc tạo bọt dẫn đến mẫu (q) Ly tâm mẫu 10 4000 r/min (r) Lọc phần dịch vào ống ly tâm 1,5 ml (s) Rã đông dung dịch IS 2000 ng/ml (t) Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1:10 với axit formic 0,1% IS 200 ng/ml (ví dụ: thêm 100 μl mẫu, 100 μl dung dịch IS, 800 μl axit formic 0,1%) (u) Tiêm μl mẫu vào máy để phân tích 6.4 Phân tích sắc ký 6.3.1 Điều kiện vận hành HPLC - Cột HPLC Waters μm, 150 × mm C18 - Tốc độ dịng 0,5 ml/min - Nhiệt độ cột, ổn định 30ºC - Thể tích tiêm mẫu, 10 μl - Chương trình gradient Chương trình valco valve 10 Phút A, % B, % 0,0 85 15 0,8 85 15 5,1 50 50 6,4 98 7,3 98 7,5 85 15 10 85 15 TCVN … : 2019 Phút Vị trí Đường dung môi A Ra thải B Vào MS A Ra thải Điều kiện khối phổ Thế ion hóa IS 5500 Nhiết độ đầu phun TEM 500 Curtain gas CUR 20 Ion source gas GS1 40 Ion source gas GS2 50 Collision gas CAD High Mảnh đặc trưng Chất phân tích Peptide Q1 Q3 CE α-s1-Casein-1 FFVAPFPEVFGK 692,9 920,5 29 α-s1-Casein -2 YLGYLEQLLR 634,4 991,6 33 α-s1-Casein -3 HQGLPQEVLNENLLR 880,5 1324,7 51 β-Lactoglobulin-1 VYVEELKPTPEGDLEILLQK 1157,1 1453 60 β-Lactoglobulin -2 VLVLDTDYK 533,3 853,5 23 β-Lactoglobulin -3 LIVTQTMK 467,3 707,4 21 Glutelin-1 EGSLLLPHYNSR 693,4 773,6 40 Glutelin -2 GDFELVGQR 510,8 572,5 26 Vicilin-1 ALPNDVLANAYR 658,9 566,8 26 Vicilin -2 LQAFEPIR 487,3 732,5 23 Vicilin -3 GDEFGAFTPIQYK 736,9 1024,8 33 Glycinin G1-1 VLIVPQNFVVAAR 713,4 1001,6 33 Glycinin G1-2 VFDGELQEGR 575,3 903,4 29 Glycinin G1-3 LNALKPDNR 520,8 629,3 32 11 TCVN … : 2019 6.3.2 Phân tích mẫu Mẫu thử tiến hành tương tự mẫu chuẩn, Thứ tự chạy mẫu - Dung môi DMSO - Mẫu blank - Dung môi - Mẫu MRL - DMSO blank - Mẫu thử Tính kết (a) MRL 1000 ppm, — Tính tỷ lệ diện tích trung bình peptide: Tỷ lệ diện tích píc = diện tích chất phân tích / diện tích nội chuẩn (b) Mẫu thử – tính tỷ lệ diện tích píc mẫu thử (c) Xác định mẫu thử (1) so sánh tỷ lệ diện tích píc mẫu thử mẫu MRL, (2) tỷ lệ diện tích peptide mẫu thử nhỏ mẫu MRL, kết âm tính, Khi tỷ lệ diện tích píc peptide mẫu thử lớn mẫu MRL, kết dương tính, (3) ba peptide protein có kết dương tính, mẫu thử dương tính với protein đó, Nếu khơng, mẫu thử âm tính với protein đó, Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thơng tin sau đây: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu, biết; c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này; 12 TCVN … : 2019 d) điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn xem tùy chọn, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thử nghiệm thu được, 13 TCVN … : 2019 Phụ lục A (tham khảo) 14 .. .TCVN … : 2019 TCVN … : 2019 Lời nói đầu TCVN … : 2019 xây dựng sở tham khảo AOAC 2017.12 Identification of Milk Proteins in Raw Materials and Finished Goods ESI HPLC-MS/MS; TCVN … :... lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN … : 2019 TCVN … : 2019 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN … : 2019 Thực phẩm nguyên liệu - Xác định hàm lượng protein sữa Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ... sốt nội phịng thí nghiệm LCS Một hỗn hợp mẫu protein nguyên liệu chuẩn bị bảo đảm nguồn protein mức hàm lượng hỗn hợp mẫu chuẩn cuối Đối với mẫu protein nguyên liệu sử dụng hỗn hợp mẫu chuẩn,