Báo cáo thí nghiệm hóa sinh bài 8 xác Định hàm lượng vitamin c

Sơ đồ phản ứng giữa axit ascocbic với chất chỉ thị DCIP như sau: Vitamin C + 2,6 DCIP  DHAA + 2,6 DCIP Khử oxi hóa oxi hóa Khử * Quá trình đổi màu: Màu xanh môi trường kiềm màu hồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CNSH & CNTP

-

 -BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ tên sinh viên : Nguyễn Minh Tú

Giáo viên hướng dẫn: Cô Phùng Thị Thủy

Cô Lê Thị Huyền

Bài 8: Xác định hàm lượng vitamin C

- Mẫu thí nghiệm: cam

I Nguyên tắc

1.Nguyên tắc chuẩn độ

Axit ascocbic ( vitamin C) là một hợp chất chưa no có hai nhóm enol và 2 nhóm hydroxit, hòa tan trong nước và tồn tại dưới dạng oxi hóa và dạng khử

Axit ascocbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong môi trường axit Do vậ, người ta thường chiết axit ascocbic trong mẫu bằng các dung dịch axit như axetic 5%, axit metaphotphoric 2%

* Phương pháp dựa trên nguyên tắc là axit ascocbic có khả năng oxi hóa khử thuận nghịch chất chỉ thị đặc trưng màu xanh là 2,6 diclophenolindophenol ( DCIP) Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu tốn ta tính được lượng axit ascocbic có trong mẫu thí nghiệm Sơ đồ phản ứng giữa axit ascocbic với chất chỉ thị DCIP như sau:

Vitamin C + 2,6 DCIP  DHAA + 2,6 DCIP

(Khử) ( oxi hóa) (oxi hóa) (Khử)

* Quá trình đổi màu:

Màu xanh (môi trường kiềm) màu hồng ( môi trường axit)  không màu

Phản ứng là phản ứng thuận nghịch, chiều thuận xảy ra ở điều kiện thường

và rất dễ dàng xảy ra, nhưng chiều nghịch lại khó xảy ra và cần có chất xúc tác

* Đặc điểm chất chỉ thị:

- 2,6 DCIP là chất chỉ thị đặc trưng, chỉ phản ứng với vitamin C mà không tác dụng với chất khác

- DCIP là chất không bền, nồng độ thay đổi theo thời gian

- Chất chỉ thị này là một hợp chất có khả năng đổi màu kép, một mặt, khi

pH của môi trương thay đổi từ kiềm qua axit thì màu của chất chỉ thị chuyển từ xanh sang hồng, mặt khác dạng oxy hóa của DCIP có màu, còn dạng khử không màu (DCIP có màu xanh tỏng môi trường kiềm và môi trường axit yếu, có màu tím trong khoảng pH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở môi trường có pH < 4 )

- DCIP bền trong môi trường trung tính và kém bền ở môi trường axit nên màu hồng khi DCIP dư chỉ tồn tại trong vòng khoảng 1 phút

2 Nguyên tắc xác định hệ số f:

- Do DCIP kém bền, thay đổi nồng độ tùy thuộc vào nhiệt độ nên nồng độ của nó cũng thay đổi Chính vì vậy, nên phải xác định hệ số f

- Vitamin C + KIO3/H+ + hồ tinh bột  xuất hiện màu xanh

+ Phương trình phản ứng :

KIO3 + 6HCl + 5KI  3I2 + 6KCl + 3H2O

+ Vitamin C trong trường hợp này ở dạng khử ( axit ascocbic), khi cho I2

vào thì axit ascocbic bị oxi hóa và chuyển sang dạng dehydroascorbic còn I0 bị khử thành I- nên dung dịch mất màu

Khi cho dư I2 thì lúc này dung dịch xuất hiện màu xanh (với chất chỉ thị là

hồ tinh bột)

Phương trình phản ứng:

Chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu xanh : lúc này ta tính được lượng I2,

từ đó xác định được nồng độ Vitamin C, cuối cùng suy ra được nồng độ DCIP

CN( DCIP)× VDCIP = CN( vitamin C) × Vvitamin C = CN( KIO3)× VKIO3

 CN( DCIP) = ?

II Cách tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị

a Dung dịch 2,6 DCIP

Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch 2,6 DCIP

- Bình tam giác 1(cỡ 50ml):

+ 5ml dịch vitamin C tinh khiết + 2,5ml Oxalatamon bão hòa + Chuẩn bằng 2,6 DCIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút, được a1 ml

- Bình tam giác 2(cỡ 50ml):

+ 5ml dịch vitamin C tinh khiết + Vài tinh thể KI

+ 5 giọt hồ tinh bột + Chuẩn bằng KINO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b1 ml

- Tính hệ số f của dung dịch 2,6 DCIP dùng trong phân tích: f = b1/a1

b Dịch phân tích

Cân 10g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong HCl 1%, chuyển mẫu vào bình định mức cỡ 100ml Định mức tới vạch bằng HCl 1%, lắc đều, lọc và thu dịch lọc vitamin C phân tích

2 Tiến hành phản ứng

a Mẫu thí nghiệm: Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50ml)

- 10ml dịch lọc vitamin C phân tích

- 5ml dung dịch oxalatamon bão hòa

- Chuẩn bằng 2,6 DCIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút

b Mẫu kiểm chứng: Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50ml)

- 10ml HCl 1%

- 5ml Oxalatamon bão hòa

- Chuẩn bằng 2,6 DCIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút

III Lưu ý

1 Vitamin C là chất khử mạnh, dễ bị oxi hóa nên phải duy trì trạng thái khử của nó:

+ Chiết trong môi trường axit metaphosphoric

+ Nghiền nhanh, ngập trong axit để tránh vitamin C tác dụng với oxi trong không khí

+ Tránh dùng các dụng cụ bằng sắt, đồng vì Fe, Cu là trung tâm của nhiều enzym oxi hóa khử trong cơ thể sống, nên nếu dùng dụng cụ bằng Fe, Cu thì sẽ kích hoạt các enzym oxi hóa khử làm khử vitamin C và dẫn đến sai số

2 Với những dung dịch có sẵn màu hồng phải tẩy màu (bằng than hoạt tính, hoặc bằng axit metaphosphoric , axit oxalic )

3 Dung dịch đục phải lọc hoặc li tâm, sắc kí

4 Axit metaphosphoric 5% còn có tác dụng liên kết với Fe2+, Cu2+ để phá hủy enzym phá hủy vitamin C, không những vậy nó còn lọa bỏ protein giúp lọc dễ dàng

5 Dung dịch oxalatamon có tác dụng bền màu của dung dịch, cũng như

nó giống như axit oxalic để tẩy màu

6 Có thể dùng axit oxalat 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức, hoặc dùng axetat chì 5% (5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố

7 Khi xác định vitamin C trong một phẩm vật nào đó phải tiến hành phân tích ít nhất là 2 mẫu thí nghiệm, dối với mỗi mẫu 2 lần xác định, kết quả định phân 2 lần không sai lệch quá 0,03ml DCIP 0,001N

8 Phải dùng microburet để dịnh phân.

Thời gian định phân kéo dài không quá 2 phút và lượng DCIP dùng để định phân nên ở trong khoảng 1-2ml ( không quá 2ml hoặc ít hơn 1 ml)

IV Tính toán kết quả thí nghiệm

Yêu cầu: Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm theo mg%

Biết: 1ml 2,6 DCIP 0,001N tương ứng với 0,088mg vitamin C

1 Kết quả phân tích

- Hiệu chỉnh 2,6 DCIP: a1 = 2,5 ; b1 = 1,9

- Khối lượng mẫu: 10g

- Thể tích 2,6 DCIP dùng cho mẫu kiểm chứng: 0,1ml

- Thể tích 2,6 DCIP dùng cho mẫu thí nghiệm: 0,55 ml

2 Tính toán

- Hệ số hiệu chỉnh: f = 1, 9 2 ,5 = 0,76

- Số ml 2,6 DCIP cần dùng: Vtn-Vkc

 V = 0,55- 0,1 = 0,45 ml

Ta có 1ml 2,6 DCIP 0,001N tương ứng với 0,088mg vitamin C

 Số mg vitamin C có trong 10ml mẫu thí nghiệm là V× f × 0,088 = 0,45×0,76×0,088 = 0,03(mg)

 Số mg vitamin C có trong 100ml (tương ứng với 10g mẫu) là

0 , 03× 10010 =0 , 3 (mg)

- Trong 10,00g mẫu → 0,3mg vitamin C

 100g mẫu → 3mg vitamin C

- Vậy hàm lượng % vitamin C có trong 100g cam làm thí nghiệm là:

3

100× 1000 ×100=0,003 %

Bài 9-12: Xác định chỉ số axit, xà phòng, peroxyt, iot của dầu thực vật

Phần 1 : Xác định chỉ số axit của dầu thực vật

I Nguyên tắc

1.1 Khái niệm chỉ số axit:

Chỉ số axit là số mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự do có trong 1g chất béo

1.2 Ý nghĩa

- Xác định chỉ số axit, từ đó biết được giá trị của chỉ số axit, từ đó cho biết độ tươi của chất béo (dựa vào lượng chất béo bị thủy phân) Nếu sản phẩm có nhiều axit béo tự do, có glixerit bị phân hủy do các yếu tố bên ngoài, vì enzym có trong

vi sinh vật dẫn đến xảy ra quá trình thủy phân thì chỉ số axit càng cao Chỉ số axit càng cao thì chứng tỏ độ thủy phân trong chất béo càng lớn => độ tươi giảm

- Chỉ số axit tăng khi tồn tại độ ẩm, nhiệt độ, enzym lipaza (enzym thủy phân chất béo để tạo axit béo và glixeryl) trong chất béo Nhiệt độ càng cao thì các quá trình diễn ra càng nhanh

1.3 Nguyên tắc:

Trung hòa chất béo bằng dung dịch KOH chuẩn độ, khi đó giữa KOH và các axit béo tự do có trong chất béo xảy ra phản ứng

RCOOH + KOH  RCOOK + H2O Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các axit, tính chỉ số axit

II Cách tiến hành thí nghiệm

2.1 Hóa chất:

Ete etylic

Rượu etylic 96%

KOH 0,1N trong rượu

Dung dịch phenolphtalein 1% trong rượu

2.2 Cách tiến hành:

Chuẩn bị bình cầu, bình nón sạch, khô, dung tích 250ml (chọn nút nhám phù hợp)

Mẫu Thí nghiệm

 Cân chính xác 2-3g chất béo (cân bằng cân phân tích).

 30-50ml hỗn hợp ete- rượu 96% ( 1:1) để hòa tan chất béo

 Lắc cẩn thận, có thể đun cách thủy nếu chất béo chưa tan hết

 Lắc đều Làm nguội

o Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu với chất chỉ thị là phenolphtalein (5 giọt dung dịch 1% trong rượu)

o Chuẩn đến khi xuất hiện màu hồng tươi

Mẫu kiểm chứng

 2-3 ml nước cất

 30-50ml hỗn hợp ete- rượu 96% ( 1:1)

 Lắc cẩn thận, có thể đun cách thủy nếu mẫu thí nghiệm đun

 Lắc đều Làm nguội

 Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu với chất chỉ thị là phenolphtalein (5 giọt dung dịch 1% trong rượu)

Chuẩn đến khi xuất hiện màu hồng tươi

III Chú ý

- KOH 0,1N trong rượu được sử dụng để tránh những sai sót có thể xảy ra do

sự thủy phân của xà phòng, trong trường hợp hỗn hợp chứa quá nhiều nước từ 20% trở lên

- Trường hợp chất béo có màu sẫm thì dùng chỉ thị timolphtalein (1ml dung dịch 1% trong rượu) định phân cho đến màu xanh, hoặc dùng ankali xanh 6B (1ml dung dịch 1% trong rượu)

- Nồng độ kiềm sử dụng ở đây thấp hơn trong thí nghiệm xà phòng để tránh

sự thủy phân

- Mẫu kiểm chứng để xem khi dung dịch mẫu không chứa chất béo có chất nào trong mẫu có chất nào tác dụng với KOH 0,1N không

IV Tính toán kết quả thí nghiệm

Yêu cầu: Xác định các chỉ số axit

a Kết quả phân tích

- Thể tích KOH 0,1N dùng cho mẫu thí nghiệm: 1,32ml

- Thể tích KOH 0,1N dùng cho mẫu kiểm chứng: 0,2ml

b Thiết lập công thức

Chỉ số axit (Ax) tính theo công thức:

Ax = 5 ,611× m(b −a)× f Trong đó:

- 5,611: số mg KOH có trong 1 ml KOH 0,1N

- a: số ml KOH dùng định phân mẫu kiểm chứng

- b: Số ml KOH dùng định phân mẫu thí nghiệm chất béo

- f: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch KOH 0,1N đem dùng

- m: Lượng mẫu thí nghiệm (g)

c Tính toán kết quả

Hệ số hiệu chỉnh f = 1

Chỉ số axit (Ax):

Ax = 5 ,611×(1 ,32−0 ,2)×1

Vậy chỉ số axit Ax = 2,095

Phần 2 : Xác định chỉ số xà phòng của dầu thực vật

I Nguyên tắc và ý nghĩa chỉ số xà phòng

1.1 Khái niệm chỉ số xà phòng hóa:

Chỉ số xà phòng hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự do cũng như liên kết có trong 1g chất béo Nói cách khác là lượng mg KOH ần để xà phòng hóa các glixerit cũng như để trung hòa axit béo tự do có trong 1g chất béo (là số mg KOH dùng để dịnh phân axit béo tự do và axit béo trong glixerit (bằng cách thủy phân chất béo), nói cách khác là số mg KOH dùng để định phân axit béo có trong cấu trúc chất béo trong 1g chất béo.)

1.2 Ý nghĩa :

- Chỉ số xà phòng có ý nghĩa quan trọng Nó cho biết khối lượng phân tử trung bình của chất béo, từ đó đánh giá nguồn gốc của chất béo

- Chất béo có mạch C dài là chất béo tốt, quý (như dầu olive, dầu hạt cải,…) Chất béo có mạch C ngắn là chất béo không tốt Là nguyên nhân tạo nên chỉ số cholesterol xấu trong máu, làm tăng quá trình xơ vữa động mạch

- Trong quá trình chế biến thực phẩm, chúng ta nên dùng mỡ động vật để xào, rán để tránh khi gia nhiệt cao đỡ hại so với dùng dầu vì dầu dễ bị oxy hóa thành peroxit Ta chỉ nên dùng dầu với những món ít gia nhiệt

1.3 Nguyên tắc :

Đun sôi chất béo với một lượng dư dung dịch KOH chuẩn độ thì chất béo bị thủy phân

Các axit béo được giải phóng ra sẽ phản ứng với KOH

RCOOH + KOH  RCOOK + H2O

Các chất béo tự do cũng phản ứng với KOH sơ đồ trên

Lượng kiềm dư, không tham gia phản ứng với các axit béo được định phân bằng HCl chuẩn Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn để trung hòa các loại axit béo trong chất béo, tính được chỉ số xà phòng

II Cách tiến hành

2.1 Hóa chất:

 Dung dịch KOH 0,5N trong rượu: 30g KOH tinh khiết hào ta trong 1 lít rượu etylic tinh khiết đun nóng có lắp ống sinh hàn thu hồi, dung dịch để yên một đêm, sau đó lọc và bảo quản trong bình đựng màu nâu

 (Tránh ánh sáng, do nó rất nhạy cảm với ánh sáng, dễ oxi hóa, phân hủy, không ổn định)

 Dung dịch HCl 0,5N

 Dung dịch phenolphtalein 1% trong rượu hoặc timolphtalein 1%

2.2 Cách tiến hành:

Mẫu thí nghiệm:

 Lấy 2-3g chất béo vào bình 250ml

 Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( dùng pipet hoặc buret)

 Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 1giờ

 Làm nguội hỗn hợp, thêm 5 giọt phenolphtalein hoặc timolphtalein 1% trong rượu và định phân bằng dung dịch HCl 0,5N

 Chuẩn đến khi dung dịch mất màu hồng

Mẫu kiểm chứng:

 Lấy 2-3ml nước cất vào bình 250ml

 Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( dùng pipet hoặc buret)

 Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 1 giờ

 Làm nguội hỗn hợp, thêm 5 giọt phenolphtalein hoặc timolphtalein 1% trong rượu và định phân bằng dung dịch HCl 0,5N

 Chuẩn đến khi dung dịch mất màu hồng

III Chú ý

- Nếu xà phòng khó tan có thể thêm khoảng 20ml một trong các dung môi có nhiệt độ sôi cao như toluen, rượu propilic, butylic hoặc amilic

- Song song làm thí nghiệm kiểm chứng, thay chất béo bằng một lượng nước cất tương ứng (cần làm thí nghiệm kiểm chứng vì nồng độ của kiềm có thể bị biến đổi) Mẫu kiểm chứng có thể làm bằng dung môi để có độ chính xác nhất định

IV Xử lý số liệu

1 Xác định chỉ số xà phòng

a Kết quả phân tích

- Thể tích HCl 0,5N dùng cho mẫu kiểm chứng: 20ml

- Thể tích HCl 0,5N dùng cho mẫu thí nghiệm: 3,5ml

b Thiết lập công thức

Chỉ số xà phòng (Xp) tính theo công thức:

Xp = (a −b)× f 1 ×28 , 05 × f 2 m Trong đó:

- a: Số ml HCl dùng định phân mẫu kiểm chứng

- b: Số ml HCl dùng định phân mẫu thí nghiệm chất béo

- f1: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch HCl 0,5N đem dùng

- 28,05: Lượng mg KOH có trong 1 ml KOH 0,5N

- f2: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch KOH 0,5N đem dùng

- m: Lượng cân chất béo (g)

c Tính toán kết quả

Hệ số hiệu chỉnh: f1 = f2 =1

Chỉ số xà phòng (Xp):

Xp = (20−3 ,5)×1 ×28 , 05 ×12 = 231,4125 Vậy chỉ số xà phòng Xp = 231,4125

Phần 3 : Xác định chỉ số peroxit của dầu thực vật

I Nguyên tắc

1.1 Khái niệm chỉ số peroxit

Chỉ số peroxit là số gam iot có thể phản ứng với hydro hoạt động của các peroxit chứa trong 100g chất béo, nói cách khác, chỉ số peroxit là số gam iot được

giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của các peroxit (sản phẩn của sự ôi hóa chất béo) có trong chất béo

1.2 Ý nghĩa

 Chỉ số peroxit cho biết mức độ ôi hóa của chất béo, dùng để đánh giá độ tươi của chất béo

 Thời gian tích trữ càng lâu, chất béo càng bị ôi hóa càng làm tăng chỉ số peroxit

 Chỉ số peroxit cao sẽ gây nguy hiểm đến sức khỏe con người Là nguyên nhân gây ra xơ vữa động mạch,…

1.3 Nguyên tắc:

 Xác định chỉ số peroxit dựa trên nguyên tắc: các peroxit của chất béo (tạo thành trong quá trình ôi hóa của chất béo) trong môi trường axit có khả năng phản ứng với KI thải ra I2 theo phản ứng:

 Iot được tạo thành định phân bằng dung dịch tiosunfat:

2Na2S2O3 + I2  2NaI + Na2S4O6

 Dựa vào lượng tiosunfat tiêu tốn khi định phân iot tính chỉ số peroxit

II Cách tiến hành

2.1 Hóa chất:

 Axit axetic loãng

 Tinh thể KI

 Dung dịch Na2S2O3 0,01N ( pha trước khi dùng từ dung dịch Na2S2O3 0,1N bằng nước cất đun sôi để nguội không có chứa CO2)

 Dung dịch hồ tinh bột 1%

2.2 Cách tiến hành:

Mẫu thí nghiệm:

 Lấy 3-5g chất béo cho vào bình nón 250ml

 5-10ml clorofocm để hòa tan chất béo

 10-20ml CH3COOH băng ( hỗn hợp axit axetic băng và clorofocm 2:1)

 1 ít tinh thể KI ( bằng hạt đỗ)

 Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 5-10 phút

 Thêm vào hỗn hợp 25ml nước cất

 Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chất chỉ thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%)

 Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím)

Mẫu kiểm chứng:

 Lấy 3-5ml nước cất cho vào bình nón 250ml

 5-10ml clorofocm

 10-20ml CH3COOH băng ( hỗn hợp axit axetic băng và clorofocm 2:1)

 1 ít tinh thể KI bằng hạt đỗ

 Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 5-10 phút

 Thêm vào hỗn hợp 25ml nước cất

 Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chất chỉ thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%)

 Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím)

III Chú ý

 Phải cho clorofocm vì khi chiết chất béo, tập trung chất béo ở 1 chỗ làm cho

I2 nằm ngoài lớp clorofocm dẫn đến không tác dụng với chất béo làm I2 dễ tác dụng với thuốc thử

 Lắc hỗn hợp thật cẩn thận để cho I2 phân bố ở nước để dễ tác dụng với thuốc thử

IV Xử lý số liệu

2 Xác định chỉ số peroxyt

a Kết quả phân tích

- Thể tích Na2S2O3 0,01N dùng cho mẫu kiểm chứng: 0,4ml

- Thể tích Na2S2O3 0,01N dùng cho mẫu thí nghiệm: 0,7ml

b Thiết lập công thức

Chỉ số peroxyt (P) tính theo công thức:

P = (a −b)× f × 0,001269 ×100 m Trong đó:

- a: Số ml Na2S2O3 0,01N dùng định phân mẫu thí nghiệm chất béo

- b: Số ml Na2S2O3 0,01N dùng định phân mẫu kiểm chứng

- f: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch Na2S2O3 0,01N đem dùng

- 0,001269: Số gam Iod tương ứng có trong 1 ml Na2S2O3 0,01N

- 100: hệ số quy chuẩn cho 100 gam chất béo

- m: Lượng cân chất béo (g)