Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm sinh học: Định lượng một số hợp chất thứ cấp có khả năng kháng oxy hoá trong điều kiện in vitro của tổ hợp ba loại dược liệu

Tôi đã bảo vệ khoá luận tốt nghiệp với dé tai: Dinh lượng một số hợp chất thứ cấp có khả năng kháng oxy hoá trong điều kiện in vitro của tổ hợp ba loại được liệu tại Hội đông cham khoá l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO — ~TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

NGUYEN HUY HOANG

CUA TO HOP BA LOẠI DƯỢC LIEU

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HQC

NGANH SU PHAM SINH HỌC

THANH PHO HO CHi MINH - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO — ~TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

NGUYEN HUY HOANG

CUA TO HOP BA LOẠI DƯỢC LIEU

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SU PHAM SINH HOC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA LUẬN

ThS Nguyễn Thị Hằng

THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2024

CONG HOA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

BAN XÁC NHAN CHINH SUA KHOA LUẬN TOT NGHIỆP

Hgvảitên:NguyH Huy HồfÄEconaenananonntnniiinnntiittiitintirtttttiitiatrtttrdtnttittidtn

Sinh viên khoá: 46 c.eceeie, Mã số sinh viên: 46.01.301.038

Ngày sinh: 16/01/2002 coi Nơi sinh: Binh Dương Chương trình đảo tạo: Sư phạm Sinh học - LH Hà nà yêu

Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Hang 222-2222222222222221222211122211222212 222 xe.

Cơ quan công tác: Trường Dai học Sư phạm Thành phố Hỗ Chi

Minh -Điện thoại: 0985280§851 c coi Email: hangntŒhcmue.ecdu.vn

Tôi đã bảo vệ khoá luận tốt nghiệp với dé tai: Dinh lượng một số hợp chất thứ cấp

có khả năng kháng oxy hoá trong điều kiện in vitro của tổ hợp ba loại được liệu tại Hội

đông cham khoá luận ngày 8 tháng 5 năm 2024.

Tôi đã sửa chữa vả hoản chinh khoá luận tốt nghiệp đúng với các góp ¥, yêu câu của

Hội đông và uý viên nhận xét, gôm các ý chính như sau:

- Một số lỗi hình thức: lỗi chính tả, lỗi khoảng trắng ©2c5ccccccccccseere

- Thay đổi cầu trúc nội dung Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

Nay tôi xin báo cáo đã hoan thành sữa chữa khoá luận như trên và dé nghị Hội đồng chấm khoá luận, người hướng din khoa học xác nhận.

Thanh phố Hỗ Chí Minh, ngày 16 tháng 5 năm 2024

LỜI CÁM ƠN

Lời đâu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyên Thị Hằng - người đã định

hướng, hướng dan và tận tình giúp đỡ tôi trong quả trình học tập, nghiên cứu và hoàn

thành dé tài khoá luận nay.

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm Thành phố Hỗ Chi Minh

và ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cá nhân thuộc phòng thí nghiệm Di truyền - Tién hoá, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành pho Hồ Chi Minh đã nhiệt tinh giúp đỡ, ho trợ, cung cấp các thiết bị và dung cụ cũng như nơi thực hiện nghiên cứu

cho dé tài khoá luận của tôi

Tôi xin chân thành cam ơn các quy Thây/Cô, các nhân viên, anh chị, các bạn

sinh viên thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hoá, phòng Sinh học trung tâm, phòng Sinh lí người và động vật, phòng Sinh lí thực vật - Phương pháp day học thuộc khoa

Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phô Hồ Chi Minh đã giúp đỡ, hỗ trợ các

thiệt bị và dụng cu cho đề tài của toi.

Thành phố Hỗ Chi Minh, ngày 02 tháng 05 năm 2024

SINH VIÊN THỰC HIỆN KHOÁ LUẬN

Ay

“y

Nguyễn Huy Hoàng

I,EIBO'GHON ĐỀ TAN ssasiscisoassscccsasssssenassssszsavssssssauuassssansosszasnpoazisnstoazisettsaassccteasses |

2 MỤC DICH NGHIÊN CỨU 22-¿22222222E2zretEEEEEErrrrrrtrrrrrrrrrrrrrrrrree 2

3 DOL TƯỢNG NGHIÊN CỨU - 2 S22 SE S13 172102511711 771 11211117211 y2 2

A INIT A WGA ĐỀ DAN aniniiintiioiatioiiiiiiititiiitiiiiigt2gig2ig210 2

1.1.2 Cơ chế kháng oxy hoá của tế bào co: 5c Sccc St 2 22t 2t22seczsersrrei 5

1.2 Tông quan về chat khang oxy hoá tự nhiên - 2: sex xe 2x crvee 7

}L2:J AIRNHBÏNH:; ::-::.:: ciaciiniiiiitiia111131441165316315133153585391933883853338833123353531833535512335885855 §

P22: FLAVOR :úiciboiiioiii601065146ã40161184818515551385153318555885681965548ã65886585655568156ã18683558586ã8888 9

Ï.2:1:.FðDIPHGHÏ:icsiiciiiitiiiiiiat1231159315853539155538391383558853833533535335331583852513338583388381358 10 P24: PGlftdiCHLÍE:: ::c¿cici:ceiinkttiLA05941205i126515638168116455648864386ã586ã1888146856ãã46554645ã648ã 11

1.3 Tông quan về các được liệu trong nghiên cứu của đề tải 5 12

LSD, Bữh!GNHỂÏRicisiianiiaiiiaisitiasiiig115815221318155815029ã6653583885338683531383568833153338358858153388538 12

LSS! KG GOW asssccsssscieasscesisscicaissctasastsassoarisastoasseasteassoasssstsossseetssseneasseetasstaeanseetassee 14

1.4 Tông quan vẻ các phương pháp định lượng hợp chat thứ cấp 15

1.5 Tông quan các phương pháp khảo sát kha năng kháng oxy hoá in vitro 16

1.5.1, Phương pháp khảo sát năng lực khứ Fe (reducing power) 16

1.5.2 Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP) ccccccccecsecei 171.5.3 Phương pháp khảo sát năng lực khử ion đồng (CUPRAC) 171.5.4 Phương pháp khảo sát khả năng bat gốc tự do DPPH (DPPH) 181.4.5 Phương pháp khảo sát hiệu quá trung hoà gốc tự do ABTS+ (TEAC) 18

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22- 22 222222222 xe ve 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiÊn cứu - 5 tt 2211112112111 112112 tre 20 2.2 DSi tugng nghién Ctr cee 20

2.3 Thiết bj, dụng cụ và hod chất, óc 12H ng n1 ng 01 2e 21

2.3.1 Thiết bi, QUITS Cl:::¿::i::::222222251222231125053012353853283553335585533358558885835355938585583556858 21 DBD: NMOS ORIG scsssccsassssszassscsssszssscressessseestrosseessessstosseessesssreseaesseesseeseeesenossreseset 21

2.4 Phong phán nghiên CHU : c:.esscccseessscsseesssessnarsnassncsseassocssnassccsinessecssnesisaasease 22

2.4.1 Phương pháp thụ nhận nước sắc 55+cc5cccccccccrscrrecrrecrrrcrrree 23

2.4.2 Phương pháp thu nHẬN CAO NUGC cocccccccccccsecsssecssccseessseeseccseessseeteccseuenecsacens 24

2.4.3 Phương pháp định tinh các hợp chất hữu eơ ccscccccccccece 24

2.4.4 Phương pháp định lượng các hợp Chất ITU CƠ c SE S0 12112112226 25

2.4.5 Phương pháp xác định kha năng kháng oxy hoá in Vitro 27

2.4.3.1 Phương pháp xác định năng lực khử -ceeeeeeirreerse 27

2.4.5.2 Phương pháp bắt gốc tự do DPPIH 5á cccecSceccrcrrecrrrcee 28

Chương 3 KET QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN -.: S222 c6 30

3.1 Kết quả nghiên cứu 2-2¿©22+C2+2Sxt2EE12E3122E1222222222172222212212-222 te 30

3.1.1 Kết quả xác định khả năng kháng oxy hoá cocccccccccccccceeceevcee 30

3.1.1.1 Năng lực khử CA CAO HLƯỚC 5s ng Hhh 30

3.1.1.2 Kết quả bắt gốc tự do DPPIH -225:25s 25522 2222stc2sxcsxrzcrrsrea 31

3.1.1.2.1 Kết qua bat gốc tự do DPPH của ascorbic acid 313.1.1.2.2 Két qua bắt gốc tự do DPPH của cao nước - eee 32

3.1.2 Kết qua định tính, định lượng các hợp chất thứ cấp - - 34

1 221‹./7 01.010 ố HH 38

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

khối lượng cafein trong | g cao

chiét hoặc | mL nước sắc nông

độ 100%; đơn vị mg

khôi lượng quecertin trong | g

cao chiết hoặc 1 mL nước sắc

nồng độ 100%; đơn vị mg

khôi lượng gallic acid trong | g

cao chiết hoặc 1 mL nước sắc

nông độ 100%; đơn vị mg

khôi lượng D-glucose trong 1 g

cao chiết hoặc 1 mL nước sắcnông độ 100%; đơn vị mg

Đơn vị định lượng alkaloid

dựa vào đường chuân caffein

Đơn vị định lượng flavonoid

dựa vào đường chuẩn

quercetin

Đơn vị định lượng polyphenol dựa vào đường chuẩn gallic acid

Đơn vi dinh lượng

polysaccharide dựa vào đường chuân D-glusose

DANH MỤC HÌNH ANH

Trang

Hình 1.1 Gốc tự do và một số bệnh liên quan 522222222 2S ccsrrzsrrrcrrec 3

Hinh 1.2 Quá trình tự oxy hoá của monosaccharide với sự tham gia của ion KIM DBÍi:ccictsniiisti64124420426400415631563115315648563858633036985388535935568135515638563858365833983388535638568 5

Hinh 1.3 Stress oxy hoá vả hậu quả - Á << S91 1 Y4686488448844164 6

Hình 1.4 Một số cơ chế kháng oxy hoá của tế bào ©2sc2cccccxeccrkecrrecrree 7

Hình 1.5 Các loại chat kháng oxy hoá cọ 1S E11 1 01101111010 syo §

Hình 1.6 Sơ đô thé hiện quá trình bat hoạt gốc tự do của alkaloid 9

Hình 1.7 Sơ 46 thẻ hiện quá trình bat hoạt gốc tự do bởi flavonoid 9

Hình 1.8 Phức Fe”*-quecertin hoạt động như superoxide dimusta (SOD) 10

Hình 1.9 Sơ đồ thé hiện quá trình bat hoạt gốc tự do bởi polyphenol H Hình 1.10 Sơ đồ thê hiện quá trình loại bỏ ion kim loại của polyphenol II Hình 1.11 Fucoidan ngăn chặn stress oxy hóa bang cách điều chỉnh hệ thống kháng ORY HỘ Ginnätiiiiiigiiiititiiiisitiii4411411166156611661156538505851385538315938366586455853888588336559855281168556338 12 Hình 2.1 Bán chi liên, Bach hoa xa thiệt thao và Xa den say MG scsi casscasssasscasseass 20 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm - ¿502 0 2 211 21022102210721022222 2e 23 Hình 3.1 Đồ thị thé hiện sự tương quan giữa DPPH (%) và nồng độ ascorbic acid 0 32

Hình 3.2 D6 thị thể hiện tương quan giữa DPPH (%) và nông độ cao nước theo phương trình logarithmic cc nhìn n1 11211120, 34 Hình 3.3 Kết quả định tính hợp chat alkaloid trong tổ hợp dược liệu 35

Hình 3.4 Kết quả định tính hợp chat flavonoid trong tô hợp được liệu 36

Hình 3.5 Kết quả định tính hợp chat polyphenol trong tô hợp được liệu 37

Hình 3.6 Kết quả định tính hợp chất polysacchride trong tổ hợp được liệu 37

Hình 3.7 Dé thị thé hiện sự tương quan giữa nòng độ và giá trị OD của các

chất chuẩn - S2 1S 1112112111 1112 1111151121 11 1121 11 1121011212101 2121111110211 11 se 39

DANH MỤC BANG

Trang

Bảng 1.1 Một số gốc tự do phô biền 00 220220 22221022102210221221022Eecrree 4

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bi, dung cụ sử dung trong đề tải - 21

Bảng 2.2 Các nông độ cao nước khảo sát trong thử nghiệm năng lực khử 28

Bang 2.3 Các nông độ cao nước khảo sát trong thử nghiệm bắt gốc tự do DPPNH::::::::::::::22222021001221221112217111112111231161318313653123134831293858 9335353 534535333555333953523139350237E 29 Bảng 3.1 Năng lực khử Fe?* của cao nước theo nông độ 5s 5s csccccccscee 30 Bang 3.2 Ti lệ phan trăm bắt gốc tự do DPPH của cao nước theo nông độ 33

Bảng 3.3 Giá trị ICso của cao chiết nước tô hợp được liệu -. 34

Bảng 3.4 Kết quả định tính các hợp chat tự nhiên từ nước sắc va cao nước 38

Bang 3.5 Hàm lượng các hợp chat thứ cấp trong tô hợp được liệu 40

Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số hợp chat tự nhiên trong tô hợp dược liệu va các

dược liệu thành phẳn -2-© 2 222SSÊSS1E21222112211221222121112112111111112 21122112212 c0 42

Trong đó, chất kháng oxy hoá tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật chiếm phần lớn.

Theo WHO, khoáng 80% người dân trên thế giới tin dùng các loại thảo được trong

điều trị và phòng ngừa các bệnh mãn tính [3] Chính vì vậy, hiện nay, các chiến lược sàng lọc các hợp chất từ tự nhiên có tính kháng oxy hoá đang diễn ra rất phô biến bởi các nhà khoa học trong và ngoài nước Từ đó, những cây thuốc, được liệu của

dân gian được quan tâm chú ¥ nhiều hơn

Một số công trình nghiên cứu về Bán chi liên [4,5,6], Bạch hoa xả thiệt thao

[7.8] Xa đen [9,10] cho thấy mỗi được liệu riêng lẻ đều thé hiện hoạt tính kháng oxy

hoá và chứa các chất kháng oxy tiềm năng như flavonoid, phenolic,

carotenoid, Trong đông y, Bán chi liên, Bạch hoa xà thiệt thao cùng một số thao

dược khác được dùng trong điều trị ung thư gan [11,12]; tương tự ở Xa đen Do đó,các được liệu trên đều thé hiện hoạt tính gây độc tế bao ung thư Phùng Anh Tài [13]

đã chứng minh nước sắc tô hợp ba loại được liệu trên có khả năng gây độc tế bảo ung

thư gan Hep-G2 với giá trị ICsa là 0,661 + 0,137%

Với các cơ sở đã trình bảy và mong muôn chứng minh tô hợp dược liệu gồmBán chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt thảo, Xạ đen ngoài hoạt tính gây độc tế bào ung thư

thì còn hoạt tính sinh học khác chăng hạn như kháng oxy hoá Từ đó giúp giảm tác

dụng phụ, tăng cường miễn dịch trong điều trị ung thư Vì vay, dé tai tiền hành “Dinh

lượng một số hợp chat thứ cấp có khả năng kháng oxy hoá trong điều kiện in

vitro của tô hợp ba loại dược liệu” dé cung cấp thêm các cơ sở khoa học.

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Phân tích khả năng kháng oxy hoá in vitro của cao nước tô hợp gồm Ban chi

liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và Xa đen.

3 ĐỎI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đề cung cấp những dẫn liệu cho việc sử dụng thuốc trong dân gian, đề tài khảo

sát khả năng kháng oxy hoá của cao nước tô hợp được liệu gồm Bán chỉ liên, Bạch

hoa xa thiệt thảo và Xa đen được phôi trộn theo tỉ lệ 2:2:5 về mặt khối lượng.

4 NHIỆM VỤ CUA DE TÀI

Đề tải tiến hành thực hiện các nhiệm vụ sau:

- Nhiệm vụ 1: Tổng thuật các cơ sở khoa học và các công trình nghiên cứu liên quanđến đề tài;

- Nhiệm vụ 2: Thực hiện các nội dung chính gồm:

+ Nội dung 1: Xác định kha năng kháng oxy hoá in vitro của cao nước;

+ Nội dung 2: Định tính va định lượng các hợp chat thứ cấp có tinh kháng oxy

hoá có trong nước sắc, cao nước

5 PHAM VI NGHIÊN CỨU

Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, cao nước và nước sắc tô hợp dược liệu

được định lượng một số hợp chất thứ cấp Trong các hợp chất thứ cấp, những hợp

chất được lựa chọn là: alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide Vì những hợp

chat nay đã được chứng minh tiềm năng kháng oxy hoá

Dé chứng minh khả nang kháng oxy in vitro của được liệu, dé tai sử dụng 2phương pháp: năng lực khử sắt (reducing power assay) và bắt gốc tự do DPPH(2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Vì 2 phương pháp này được sử dụng phô biến trongthử nghiệm kháng oxy hoá, có độ tin cậy cao, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

6 NỘI DUNG CỦA ĐÈ TÀI

Chương 1 TONG QUAN

1.1 Tổng quan về gốc tự do và cơ chế kháng oxy hoá của tế bào

các phân tử DNA, protein, lipid, cũng như các bào quan, cau trúc tế bào như ty thể,

màng tế bào, [14] Từ đó, gốc tự do góp phần gây ra hoặc làm trầm trọng thêm các

bệnh như ung thư, đái tháo đường, các van dé tim mach, (hình 1.1) Một số ROS

phô bién trong tế bào được thẻ hiện qua bảng 1.1

“an

OMA treatege, Percektation of wwe “cà boty eh

(rretaton urvestsated trty ackis ?%79vdirxvtrsez9zs4xxe — -Abtso.

Orcogene 0224g1®©es boos Of merrtrase protety Crosse vhinp $C 29/4602

"14 420p 9rxc9on prtteds Vagrantation

Gene revert OLDE forthe changes in

QeMENTz,

CATARACT STROKE

Bảng 1.1 Một số gốc tự do phỗ biến [15]

Reactive Oxygen Species Non Free-Radical Species

Lipid hydroperoxide | LOOH

Lipid peroxyl radical Hypochlorous acid | HOCI

Peroxyl radical _ROO* Peroxynitrite | ONOO~

Lipid alkoxy! radical LO* Dinitrogen trioxide N20;

Nitrogen dioxide radical N

cụ thé là các phản ứng oxy hoá khử, nhiều nhất là quá trình hô hap tế bào Gốc tự do

được tao ra thông qua trình phân giải glucose với sự tham gia của các enzyme trong

tế bào Vì vậy, trong tế bao, gốc tự do tôn tại nhiêu trong ty thể, ngoài ra còn một số

bao quan khác như peroxisome, microsome [16] Ở cấp độ cơ thé, gốc tự do

có nhiều ở gan do đây là cơ quan thải độc chính của cơ thẻ Từ đó làm tăng

các nguy cơ Xơ gan, viêm gan, ung thư gan.

Ngoài quá trình hô hap tế bao, gốc tự do còn được tạo ra từ một số con đường

khác như: quá trình tự oxy hoá đường monosaccharide với sự có mặt của ion

kim loại Con đường nay không can sự tham gia của enzyme [17] Theo hình 1.2, khi

có sự tham gia của ion kim loại (M°?), monosaccharide (dạng endiol) sẽ tự oxy hoá

thông qua nhiều giai đoạn va tạo thành nhiều gốc tự do như: HOz, ‘OH,

Vi xảy ra trong tế bao, các gốc tự đo nảy có thé tắn công màng tế bao, glycosyl hoá

protein, Điều này làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein, từ đó dẫn đến

một số bệnh mà điền hình nhất là đái tháo đường [18].

OH OHOHLi p= R-G-k

Hình 1.2 Qua trình tự oxy hoá của monosaccharide với sự tham gia của

ion kim loại [ L7]

1.1.2 Cơ chế kháng oxy hoá của tế bào

Khi nông độ gốc tự do trong tế bao tăng cao vượt quá mức kiểm soát, nó có thé

gây ra tình trạng stress oxy hoá Stress oxy hoá nghiêm trọng có thê gây tôn thương

tế bao, là một trong những nguyên nhân dẫn đến nhiều loại bệnh, tật, thậm chí là tử

vong (hình 1.4) [19].

Tăng sắt nội bào

Giải phóng ion kim loại vào

các mô xung quanh và

Tăng tốn thương DNA, làm tổn thương an té bao lan can

proteins, lipids

Hinh 1.3 Stress oxy hoa va hau qua [19]

Dé điều hoà tác động của gốc tự do, tế bảo có cơ chế chống gốc tự do bằng hệ

thông chất kháng oxy hoá Chất kháng oxy hoá là những chất có tác dung bảo vệ hoặc

làm chậm các quá trình tốn thương tế bào gây ra bởi các gốc tự đo Dựa vào nguồn

gốc chất kháng oxy hoá có thé chia thành hai loại là chat kháng oxy hoá nội sinh và

chất kháng oxy ngoại sinh Chất kháng oxy hoá nội sinh bao gồm các emzyme kháng

oxy hoá như: catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase

(GPx), thioredoxi (Trx), Chat kháng oxy hoá ngoại sinh bao gồm các chất không

phải enzyme như: các vitamin A, C và E, flavonoid, phenolic acid, coenzym Q10,

B-carotene, Chất chéng oxy hoá có thé tương tác với gốc tự do hoặc nguyên nhân

tạo ra góc tự do theo nhiều cơ chế khác nhau Theo hình 1.4, một số cơ chế phan ứng

phô biến của chat chong oxy hoá là: phan ứng trực tiếp với gốc tự do, qua đó tạo ragốc ôn định hơn; ức chế các phản ứng oxy hoá tạo ra gốc tự đo: chất kháng oxy hoá

không enzyme có thẻ hoạt hoa gene sản xuất các enzyme khang oxy hoá, [20].

View ACE

Hình 1.4 Một số cơ chế khang oxy hoá của tế bào [20]

Trong cơ thé, các chất chống oxy hoá có thê không hoạt động độc lập ma phối hợp với nhau đề chong lại các gốc tự do Chang hạn như, vitamin E với khả năng tan

tốt trong lipid có thẻ loại bỏ gốc tự đo trong lớp phophotlipid kép, từ đó hình thành

gốc tự đo của vitamin E Sau đó, vitamin C phản ứng với nhóm chroman để tái tạo

lại vitamin E từ óc tự do của nó [21] Tuy nhiên, hiệu quả các chất chống oxy hoá

còn phụ thuộc vào nhiều yếu tổ như nhiệt độ loại và nông độ chất oxy hoá, sự hiện

điện của các hợp chất hỗ trợ và tiền oxy hoá

Dựa trên sơ đô hình 1.4, hiện nay, các nhà khoa học đang đây mạnh nghiên cứu,

sàng lọc các hoạt chất có khả năng tác động đến các con đường kháng oxy hoá của tế

bào dé ngăn chặn các tác hại của gốc tự do Trong đó các hợp chất có nguồn gốc tự

nhiên được quan tâm, chú ý.

1.2 Tong quan về chất kháng oxy hoá tự nhiên

Hiện nay, một số hợp chất có khả nang khang oxy hoa đã được phân lập thểhiện qua hình 1.5 Theo đó, trong các nhóm chất kháng oxy hoá, các nhà khoa học

tập trung vào việc phân lập các hợp chất có bản chất không phải là enzyme như:flavonoid, phenolic, các vitamin, Vì những chất này có nhiều trong thực vật, qui

trình phân lập và cách bảo quản đơn giản hơn so với các enzyme kháng oxy hoá.

Secondary Enzymes Glutathione reductase

Glucoasephosphatedehydroge-ttase

acid

Organosulfur compounds:

Hydroxybenzoic acids: Allyl sulfide, Indoles

Vitamins and Derivatives: A (Retionol), C (Ascorbic Acid), E (Tocopherols and Tocotrienols), K

Carotenoids: f-Carotene, Lycopene, Lutein, Zeaxanthin

Nitrogen non-protein compounds: Uric acid

Hình 1.5 Các loại chất kháng oxy hoá [15]

L2.1 Alkaloid

Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên có cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học

rất đa đang Chúng hiện điện ở hầu hết các họ thực vật, đặc biệt là các họ như Anh

túc (Papaveraceae), Cà phê (Rubiaceae), Cà (Solanaceae), Cấu trúc hoá học của

các alkaloid luôn chứa nghuyên tử nitrogen trong vòng dj hoàn vì vậy luôn có tính

base Day cũng lả cơ sở cho việc phân lập các alkaloid [22]

Trong cau trúc của alkaloid, gốc — C=C-N thường dé nhường proton H* do cặp

điện tử trên nguyên tử nitrogen có khuynh hướng dich chuyên về liên kết C=C [22].

Đây cũng là cơ chế kháng oxy hoá của alkaloid Nếu trong tế bào có các gốc tự do ởtrạng thiểu một proton (chăng hạn như hydroxyl), thi proton H* của alkaloid sẽ được

chuyên cho góc tự do dé tạo thành sốc 6n định (hình 1.6) [23].

R° RH

Co 4.

N H

Có 2 cơ chế hoạt động kháng oxy hoá của các flavonoid: (a) loại bỏ trực tiếp

các góc tự do bing cách nhường một electron hoặc nguyên tứ hydrogen; (b) ức chế

quá trình hình thành gốc tự đo Theo cách thứ nhất, các flavonoid phản ứng với gốc

tự đo bằng cách nhường đi proton H* của các nhóm — OH (hình 1.7)

Theo cách thứ hai, khi có mặt của ion kim loại (Fe**) và sốc tự do (O»'),

flavonoid (quecertin) có thể hoạt động như enzyme kháng oxy hoá dé loại bỏ gốc tự

đo (hình 1.8) Đồng thời, flavonoid liên kết và tạo phức với các ion kim loại, từ đó

loại bỏ môi nguy tiềm tạo ra gốc tự do thông qua phan ứng kiêu fenton (1) [25] Ngoài

ra, một số nghiên cứu cho thấy, flavonoid có thể giảm hoạt động các enzyme hình

thành gốc tự do (xanthine oxidase) do có cau trúc gần giống nên có khả năng cạnh

tranh [26] Vì vậy, những nhóm thực vật có chứa nhiều flavonoid sẽ là nguồn kháng

oxy hoá tiềm năng chăng hạn như các họ thuộc bộ Hoa môi (Lamiaceae,

Verbenaceaeae, Gesneriaceae), họ Hoa Thảo (Gramineae), [27]

(1) H:O› + Fe**(Cu*) > ‘OH + OH" + Fe**(Cu”*) Phan ứng Fenton

Hình 1.8 Phức Fe?'-quecertin hoạt động như superoxide dimusta (SOD) [25]

Trong tự nhiên, phân lớn các flavonoid xuất hiện dưới dang liên kết với đường(glycoside) Số lượng va vị trí liên kết với phân tử đường sẽ ảnh hướng đến hoạt tinhchống oxy hóa của flavonoid Ngược lai, dang flavonoid không liên kết với đường(aglycone) thê hiện hoạt tinh kháng oxy hóa cao hơn nhưng nông độ trong cơ thé thấp

[28].

1.2.3 Polyphenol

Polyphenol là những hợp chất thuộc nhóm phenol, đặc trưng bởi cau trúc vòng

benzene, có một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl (—- OH) Các hợp chat polyphenolthường có trong hau hết họ thực vật: một số hợp chất polyphenol phô biến như tanin

(lá); lignin (vách tế bào thực vật) [22]

Tương tự như flavonoid, vì các polyphenol có chứa các gốc hydroxyl (P-OH) nên dé dàng khử các gốc tự do (hydroxyl, peroxyl, ) bang con đường nhường nguyên tử hydrogen (hình 1.9).

Hình 1.9 Sơ đồ thé hiện quá trình bat hoạt gốc tự do bởi polyphenol [29]

Ngoài ra, các hợp chat polyphenol có thé tương tác với các tiền chat tạo gốc tự

do, chăng hạn như Fe”*, Thông qua đó, sự hình thành của các gốc tự đo bị hạn chế

(hình 1.10) Một số công trình ngiên cứu [25] đã chứng minh một số hợp chất

polyphenol còn tham gia vào quá trình điều hoà hoạt động gene mã hoá cho các

enzyme kháng oxy hoá (SOD, GSH, GST) bang cách điều chỉnh yếu tố Nr-f2

Hình 1.10 Sơ đồ thé hiện quá trình loại bỏ ion kim loại của polyphenol [25]

1.2.4 Polysaccharide

Polysaccharide là các hợp chất thuộc nhóm carbohydrate, gồm nhiều đơn vimonosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside, Trong cơ thé sống, ngoài

chức nang cấu tao, polysaccharide còn tham gia vào nhiều chức nang khác, chăng

hạn như loại bỏ các gốc tự đo Vì vậy, một số polysaccharide có khả năng kháng oxy

hoa, làm giảm mức độ lão hoá của tế bào Cơ chế chống oxy hoá của polysaccharide

chế hoạt tính của enzyme oxy hoá (NADPH oxidase) và tăng cường hoạt động của enzyme kháng oxy hoá (SOD, CAT, ) thông qua con đường truyền tin hiệu

ExcessROS —> Oxidative stress _

Hinh 1.11 Fucoidan ngan chan stress oxy héa

bằng cách điều chỉnh hệ thống kháng oxy hóa [31]

Ngoài ra, một số hợp chất khác cũng được chứng minh là có hoạt tinh kháng oxy hoá tốt như: vitamin A, C, E, coenzyme Q10, kim loại selen [15] Trong phạm vi

nghiên cứu của đẻ tai, bốn hợp chat alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide

được lựa chọn dé định tinh, định lượng (nước sắc và cao nước) Từ đó làm cơ sở đề giải thích cho khả năng kháng oxy hoá của tô hợp được liệu.

1.3 Tổng quan về các dược liệu trong nghiên cứu của đề tài

1.3.1 Bán chi liên

Bán chi liên là cây thân thảo, mọc bò, thuộc họ Hoa môi (Lamiaccae).

Trong đông y, toàn cây (trừ rễ) Bán chỉ liên được sử dụng làm thuốc đề tiêu viêm,thanh nhiệt, điều trị áp-xe phôi nhiễm độc do rắn hoặc côn trùng cắn Đặc biệt,

được định lượng từ cao ethanol; tương tự ở cao ethyl acetate, các giá trị nay

tương ứng lần lượt là 12,1740.66 mg QE/g và 12,7740.31 mg GAE/g Ngoài ra,

công trình còn chứng minh khả năng chống viêm của 2 loại cao chiết này trên dòng

tế bào RAW 264.7 và cho kết qua khả quan [4].

Nam 2021, Arzoo Pannu va Ramesh K Goyal đã tiến hành định tinh, định lượng các hợp chất có trong cao chiết ethanol 75% của Bán chỉ liên Bằng phương pháp

đo mật quang, công trình đã xác định được hàm lượng alkaoid, saponin và tanin lần lượt là 1,03%: 1,37% và 2,33% Bên cạnh đó, giá trị flavonoid toàn phần và phenolic toàn phan cũng được xác định lần lượt là 62,33+1,78 mg QE/g cao chiét va 12,09+0,057 mg GAE/g [5].

Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của T.T Ma (2020) đã tiễn hành khảo sát khả năng

điều trị ung thư của tô hợp Bán chỉ liên và Bạch hoa xả thiệt thảo Bằng phương pháp

thu nhận nước sắc kết hợp với sắc kí lỏng hiệu năng cao, công trình đã xác định được tông cộng 75 hợp chất có trong tỏ hợp nay cũng như chứng minh khả năng ức chế

sự tăng sinh và xâm lắn của tế bảo ung thư vú [6]

1.3.2 Bach hoa xa thiệt thao

Bach hoa xa thiệt thao là cây thân thao sông hang nam, moc bo, thuộc ho Ca

phê (Rubiaceae), Toàn cây (trừ rễ) được dùng làm thuốc Trong một số bài thuốc

dong y, Bach hoa xà thiệt thao được sử dụng như một vi thuốc hỗ trợ trong điều trịcác van dé vẻ viêm, nhiễm, đặc biệt trong điều trị ung thư [11]

Nam 2020, Phan Kim Định và cộng sự đã nghiên cứu một số hoạt tính sinh học

ở cao chiết methanol của Bạch hoa xà thiệt thảo Bằng phương pháp đo mật độ quang

và hồi quy đường chuẩn, công trình nghiên cứu cho thay hàm lượng polyphenol tông

va flavonoid toàn phan là §3,5§+1,3§ mg GAE/g và 39§,53+7,13 mg QE/g Ngoài ra,

dé tài còn khảo sát khả ning khang oxy hoá của cao methanol Bạch hoa xà thiệt thảo

bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH với giá trị ECso là 473,83+26,99 pg/mL Vớicác kết quả nảy, nhóm tác gia đã cho thay Bach hoa xa thiệt thao là nguồn chất khángoxy hoá tiềm năng [7]

Năm 2022, công trình của Phan Thị Thu Hiền đã xác định được các nhóm hợp chất như flavonoid, tannin, chất béo, alkaloid, coumarin, saponin, từ cao chiết phân

đoạn (ethanol, petroleum ether, chloroform và ethyl acetate) của Bạch hoa xà

thiệt thảo Bên cạnh đó, dé tài cũng tiễn hành khảo sát khả năng kháng oxy hoá

bằng phương pháp bay gốc tự do DPPH và hoạt tinh gây độc tế bào ung thưbằng phương pháp MTT của các cao chiết dược liệu này Kết quá cho thấy cao

ethyl acetat thé hiện hoạt tính kháng oxy hoá tốt nhất với giá trị ECso là 30,52 ug/mL,;

cao chloroform có hoạt tính gây độc tốt nhất với ECso là 81,16 pg/mL Qua đây,

công trình đã mở ra các hướng nghiên cứu tiếp theo về phân lập và khảo sát tác dụng

được lí của hoạt chất có trong cao chloroform vả cao ethyl acetate [8]

1.3.3 Xạ den

Xa đen là cây thân gỗ, leo, thuộc họ Vòi voi (Boraginaceae) Thân, cành và lá

của Xa đen đều được sử dung làm thuốc Trong đông y Xa đen thường là chủ vị trongcác bài thuốc về điều trị ung thư, đặc biệt là viêm, ung thư gan [12]

Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Bùi Thị Thanh Duyên đã tiến hành chiết xuất

mẫu lá Xa đen bằng ethanol 90% và tiễn hành phân đoạn lần lượt với n-hexane,

cthyl acetate va n-butanol Dé tài đã khảo sát khả năng kháng oxy hoá của các loại

cao chiết bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH Kết quả cho thay cao ethanol 90%

(cao tông) có giá trị ECsa là 48,5 wg/mL, cao ethyl acetate có tác đụng mạnh nhất trong các cao phân đoạn với ICso là 46.9 jig/mL Ngoài ra, công trình còn tiền hanh

khảo sát khả năng ức chế tế bào ung thư bằng phương pháp MTT trên ba dòng tế baoung thư ở người (Hep-G2, LU-1, MCF-7) Ở thir nghiệm nay, cao chiét phan doanethyl acetate cũng có tác dung gây độc tế bào ung thư gan và phổi mạnh nhất

so với các phân đoạn khác với giá trị IC‹¿ lần lượt là 33,7 ng/mL và 13,0 pg/mL

Qua công trình nay, nhóm tác giả đã đánh giá cao chiết lá Xa đen có tác dung ức chế

tế bào ung thư và kháng oxy hoá tốt [9].

Đái Thị Thu Trang và cộng sự (2023) đã tiền hành khảo sát hoạt tính sinh họccủa cao chiết ethanol lá Xa đen được thu hái tại hai địa điểm là Hoà Bình va

Tây Ninh Kết quả cho thấy, cao ethanol lá Xạ đen tại Tây Ninh có hàm lượng polyphenol va flavonoid cao hơn với giá trị lần lượt là 99,98 mg GAE/g và 90,69 mg QE/g so với 50,95 mg GAE¿g và 49,72 mg QE/g Ngoài ra, công trình còn tiền hành khảo sát hoạt tinh kháng oxy hoá và kháng đái tháo đường in vitro của hai loại cao này Kết quả cho thay lá Xa den tai Tay Ninh có hoạt tính sinh hoc

cao hơn lá Xa đen tai Hoa Binh [10].

Dua trén két qua nghiên cứu bước đầu của Phùng Anh Tài (2021), Xa đen đượcphối trộn với Bán chi liên và Bạch hoa xà thiệt thảo; trong đó Xa đen đóng vai tròchủ vị Tô hợp có tí lệ phối trộn 5:2:2 thé hiện hoạt tinh kháng oxy hoá, kháng khuẩn

(Bacillus subtilis) và gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 (ECso = 0.470 + 0,014%) cao

nhất Vì vậy, dé tải tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng oxy hoá và định tinh,định lượng một số hợp chất thứ cấp của tô hợp nảy nhằm chứng minh tiềm năngsinh học trong trị liệu, tăng cường miễn dịch, giảm tác dụng của thuốc, giảm tác hạicủa gốc tự do

1.4 Tổng quan về các phương pháp định lượng hợp chất thứ cấp

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định thành phần vềlượng các hợp phần của hợp chất đã cho hoặc hỗn hợp các chất Các phương pháp

nay được chia thành hai nhóm là: phân tích hoa học (phân tích trọng lượng, phân tích

thê tích — chuân độ) và phân tích hoá lí (sắc kí, đo mật độ quang, điện di, ) [32].Trong điều kiện nghiên cứu của đẻ tài, phương pháp đo mật độ quang được sử dụng

phospho-wolfarm-sản phẩm có màu xanh đương với độ hấp thu cực đại tại bước sóng 725 nm.

Dựa vào cơ chế này, hàm lượng polyphenol được dựa vào phương trình đường chuan

của gallic acid.

Polysaccharide: Các liên kết glycoside trong polysaccharide sẽ bị phân huỷ bởiH2SOx đậm đặc tạo thành các monosaccharide Tiếp theo, các đường đơn sẽ phan ứng

với phenol tạo thành dung dịch có màu vàng-cam Dựa vào sự biến đổi màu này, hàm lượng polysaccharide được xác định dựa vào chất chuẩn là D-glucose tại bước sóng 490 nm.

1.5 Tông quan các phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hoá in vitro

1.5.1, Phương pháp khảo sát năng luc khử Fe (reducing power)

Phương pháp này được M Oyaizu công bố lần đầu vào năm 1986 [30] Về sau,

phương pháp này được cải tiến bởi Elmastas [33] và đã trở nên phổ biến vì được

đánh giá là nhanh chóng, tiết kiệm và dé dàng thực hiện tại các điều kiện

phòng thí nghiệm khác nhau.

Một số nghiên cứu đã chỉ rằng khá năng nhường điện tử sẽ phản ánh khả năngkhử của các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hoá [34] Vì vậy ở thử nghiệm nảy.K:[Fe(CN)«] được sử đụng làm chat oxy hoá (chất nhận electron) và mẫu thử sẽ đóngvai trò là chất khử (chat cho electron) Nếu mẫu thử có kha năng kháng oxy hoá thi

K:s[Fe(CN}] (Fe**) sẽ bị khử thành K:[Fe(CN)] (Fe?*) Sau đó, Ks[Fe(CN)«] sẽ tác

dụng với FeCl; tạo thành phức Fe[Fe(CN),]' có màu xanh Cường độ mau xanh sẽ

xác định bằng phương pháp đo mật độ quang tại bước sóng 700 nm Khi này, màu

dung địch càng đậm thì chỉ số OD càng lớn chứng tỏ khả năng cho eleetron và kháng

oxy hoá của mẫu thử cảng tốt Tuy nhiên, kết quả của phương pháp này được xác

định thông qua sản phẩm chuyên tiếp vì vậy dé dẫn đến sai số.

1.5.2 Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP)

Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt (FRAP) được công bồ lần dau vao năm

1985 bởi Wayner [15], sau đó nó được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm

về khảo sát khả năng chống oxy hoá của các chất vì được đánh giá là phương pháp đơn giản, nhanh chóng, không yêu cầu các thiết bị, dụng cụ chuyên dụng Tuy nhiên,

phương pháp này có hạn chế lớn là hoạt động ở điều kiện pH 3.6 — môi trường pH

acid phi thực tế ở cơ thé người và sản phẩm tao ra rat dé kết tủa dẫn đến sai số.

Phương pháp FRAP sử dụng tripyridyltriazine (TPTZ) làm phối tử liên kết với

ion sắt dé đánh giá kha năng kháng oxy của mau thi Mức độ khử các

phức Fe”* + TPTZ thành phức hợp kim loại Fe** + TPTZ có màu xanh lam đậm sẽ

được đánh giá ở bước sóng 593 nm Kết quá được so sánh với các chất chuẩn là

FeSO, hoặc BHT (Butylated Hydroxyl Toluene) [15].

1.5.3 Phương pháp khảo sát năng lực khử ion đồng (CUPRAC)

Phương pháp CUPRAC giúp xác định tông khả năng kháng oxy hoá dựa trên

việc khử ion Cu”* thành Cu* Phương pháp này được xây dựng và phát triển bởiKrishnaiah và cộng sự vào đầu những năm 2000 Với các ưu điểm như ôn định,

dé thực hiện, phản ứng ở điều kiện pH gần như sinh lí mà CUPRAC trở thành

một trong những phương pháp tốt nhất trong nhóm phương pháp SET (Single

Electron Transfer) [35].

Trong phương pháp nay, neocuproine (Nc; 2,9-dimethyl-L,10-phenanthroline)

được sử dụng làm phối tử tạo thành phức phối tử với đông (Cu-Nc) Các nhómhydroxyl của chất chống oxy hóa sẽ khử phức hợp Cu?*-neocuproine (màu xanh

dương) thành phức hợp Cu*-neocuproine (màu vàng-cam) Khi nay, cường độ màu

vàng-cam của dung dịch thử nghiệm sẽ tỉ lệ thuận khả năng kháng oxy hoá của mẫu

thử và được xác định ở bước sóng 450 nm [15].

1.5.4 Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH (DPPH)

Phương pháp khảo sát khả nang bat gốc tự do DPPH ra đời vào năm 1958

bởi Blois và được cải tiễn, hoàn thiện quy trình bởi Brand — William và Bondet lan

lượt vào năm 1995 va 1997 [36] Phương pháp DPPH là một trong những

phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hoá được sử dụng phd biến với các ưu điểm như đơn giản, dé thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, chi phí thấp so với các phương pháp HAT (Hydrogen Atom Transfes) khác.

2,2 - diphenyl - | - picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím, có

độ hap thụ cực đại ở bước sóng 517 nm và được sử dụng lam chất oxy hoá Nó sẽ bị

khử thành 2,2 - diphenyl - 1 - 1 - picrylhydrazine (DPPH - H) có màu vàng bởi chất

chống oxy hoá Dựa vào cơ chế nảy, giá trị OD ở bước sóng 517 nm cảng thấp so với chứng âm, chứng tỏ nông độ DPPH trong dung địch càng ít và khả năng kháng oxy

hóa của mẫu thử càng mạnh [37].

1.4.5 Phương pháp khảo sát hiệu qua trung hoà gốc tự do ABTS+ (TEAC)

Phương pháp này được công bố vào năm 1993 bởi Miller và cộng sự Nó nhanh

chóng trở nên phô biến nhờ ưu điểm có thẻ hoạt động ở nhiều điều kiện pH khác nhau

cũng như xác định được nhiều loại chất chống oxy hoá khác nhau từ tong hợp đến

tự nhiên Phương pháp TEAC được sử dụng dé do khả nang trung hòa cation

2.2’-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic) (ABTS*) của các chat chống oxy hóa vàđược so sánh với chất chuan là Trolox Trong thử nghiệm TEAC, kali persulphatc(K2$20g) là chất oxy hóa phô biến nhất đề tạo ra ABTS' (màu xanh lam) từ ABTS

(không màu) Khi có mặt của các chat chỗng oxy hoá, ABTS* sẽ bị khử thành ABTS,

đi cùng với đó là sự thay đổi của dung dich từ mau xanh lam về dạng không mau Sựthay đôi này được xác định bằng độ giảm hấp thụ ở bước sóng 734 nm, chỉ số ODcảng thấp chứng tỏ kha năng trung hoà gốc tự do ABTS* cũng như khả nang kháng

oxy hoá của mẫu thử càng nhiều [15].

Dựa trên các lí luận tông quan vừa trình bày, đề tai tiền hành khảo sát hoạt tinhkháng oxy hoá in vitro của đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp năng lực khử(reducing power) và bắt gốc tự do DPPH Vi hai phương pháp này phê biến,

phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, hai phương pháp này còn

đại điện cho hai nhóm phương pháp thử nghiệm kháng oxy hoá trong điều kiện

in vitro là SET và HAT.

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tai được tiền hành trong khoảng thời gian từ tháng 10/2023 đến 4/2024

tại phòng thí nghiệm Di truyền - Tiến hoá, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm

Thành phô Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Nước sắc và cao nước được thu nhận từ tô hợp được liệu gồm: Bán chi liên

(Scutellaria barbata D.Don), Bạch hoa xà thiệt thao (Hedyotis diffusa Willd) và

Xa đen (Ehretia asperula Zoll et Mor) phối trộn theo tỉ lệ 2:2:5 về mặt khối lượng.

Các dược liệu (hình 2.1) được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến

cây dược liệu Dược liệu Sài Gòn (35/21B5 đường Trần Đình Xu, quan I,

thành phố Hỗ Chí Minh); được bao quản trong điều kiện nhiệt độ phòng, khô ráo,thoáng mát tại phòng thí nghiệm Di truyền - Tiến hoá, Khoa Sinh học

Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hồ Chi Minh Nước sắc được sử dụng trong ngày sau khi thu nhận, cao nước được bảo quản điều kiện nhiệt độ -20°C, khô ráo.

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dung cụ sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Hãng sản xuấtBếp điện Sanaky

Tủ lạnh Toshiba

May li tâm 8 ống Hettich Zentrifugen

| Quang phô kế UV Amersham Biosciences

| Can dién ur Ohaus

| Tủ say Memmert

7 | Bé ôn nhiệt Memmert

8 | Pipetman 5000 pL SCI Logex

9 | Pipetman 1000 pL SCI Logex

10 | Pipetman 100 HL SCI Logex

2.3.2 Hoa chat

* Hoá chat được sứ dung trong thử nghiệm định tính các hợp chat thứ cap:

- Alkaloid: HCI 1,5%, thuốc thử Wagner (cách pha: 1,27 g lạ và 2 g KI, bé sung

nước cất vừa đủ tạo thành 100 mL đung dịch)

- Flavonoid: NaOH 1%.

- Polyphenol: FeCl: 5% (được pha trong ethanol 90%).

- Polysaccharide: H;SO; đậm đặc, thuốc thử Fehling (cách pha: Fehling A +

Fehling B với tỉ lệ 1:1; Fehling A: 40 g CuSO4.5H20, bổ sung nước cất vừa đủ

tạo thanh 1000 mL dung dịch: Fehling B: 20 g NaK.4H:O và 150 g NaOH, bồ sung

nước cất vừa đủ tạo thành 1000 mL dung dịch)

* Hoá chất được sử dụng trong thử nghiệm định lượng các hợp chat thứ cấp:

- Alkaloid: dung dịch Bromocresol green (BCG) (Ba Lan; cách pha: 68,9 mg

Bromocresol green cùng với 3 mL NaOH 2N và 5 mL nước cat được dun nóng chođến khí hoa tan hoan toàn; dung dịch được pha loang đến | L bằng nước cất),đệm acetate pH = 4,7 (cách pha: 1,92 g CH:COOH và 3,2 g CH:COONa, bố sung

nước cất vừa đủ tạo thành 200 mL dung dịch), chloroform, chất chuẩn: caffein (Merck).

- Flavonoid: NaNO» 5%, AICI; 10%, NaOH 1M, chất chuẩn: quercetin (Merck)

- Polyphenol: NaxCOs 7%, Folin — Ciocalteu (Merck), chat chuan: gallic acid (Merck).

- Polysaccharide: phenol 5%, H;SO; đậm đặc chất chuân: D-glucose

(Trung Quốc).

* Hoá chất được sứ dụng trong thí nghiệm kháo sát hoạt tính kháng oxy hoá

in vitro:

- Năng lực khử: đệm phosphate pH = 6,6, Ks[Fe(CN)s] 1%, trichloroacetic acid

(TCA) 10% (bao quan trong điều kiện không có ánh sáng), FeCls 0,1%, ascorbic acid

(Sigma-Aldrich; được sử dụng ngay, tránh sáng).

- Bất gốc tự do DPPH: DPPH (Sigma-Aldrich ; 67 mg DPPH được bồ sung

vừa đủ với methanol tuyệt déi tạo thành 170 mL dung dịch có nông độ 0,1 mM:

tránh sáng); ascorbic acid (Sigma-Aldrich; có nồng độ là 8,3 ug/mL: được sử dụng

ngay, tránh sáng).

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Dựa vào kết quả nghiên cứu bước đầu của Phùng Anh Tài (2021) tổ hợp dượcliệu gồm Bán chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và Xa đen có tỉ lệ 2:2:5 về mặt khốilượng thé hiện hoạt tính sinh học Vi vậy, dé tải tiến hảnh thực hiện định tinh,

định lượng một số hợp chất thứ cấp (hình 2.2) trong nước sắc và cao nước; đồng thời

khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao nước đẻ làm cơ sở đánh giá hoạt tính

sinh học này nhằm ứng dụng thực tiễn

2.4.1 Phương pháp thu nhận nước sắc

Trong dé tai, nước sắc được thu nhận theo tài liệu [38] quy trình được thực hiện

- Tô hợp dược liệu được bỏ sung 200 mL nước cat và tiếp tục cô trong | giờ 30

phút ở nhiệt độ như trên, thu nhận nước sắc lần 2;

- Nước sắc lần 1 và lần 2 được trộn chung và li tâm ở 3000 vòng/phút

2.4.2 Phương pháp thu nhận cao nước

Phương pháp thu nhận cao nước được thực hiện theo phương pháp chiết rắn

-lỏng, ngâm dầm của tài liệu [22] Quy trình được thực hiện như sau:

- 100 g bột được liệu được ngâm trong 1000 mL nước cat, ủ ở nhiệt độ 60°C

trong 24 giờ; lọc va thu dịch chiết lần 1;

- Phần bột được liệu còn lại tiếp tục được ngâm với 1000 mL nước cất trong điều kiện như trên, lọc và thu nhận dịch chiết lần 2 Tuỳ vào điều kiện của thí nghiệm,

việc thu nhận địch chiết có thé lặp lại cho đến dịch chiết không con mau (chiết kiét);

- Dịch chiết 2 lần được trộn với nhau; dung môi được loại bỏ bang cách ủ

trên bẻ ôn nhiệt ở 60°C cho đến khi khối lượng không đổi;

- Cao nước sau khi được thu nhận được cân dé tính hiệu suất thu cao và

được bảo quản tránh sáng ở nhiệt độ — 20°C tại phòng thí nghiệm Sinh lí Thực vật.

2.4.3 Phương pháp định tính các hợp chất hữu cơ

Phương pháp định tính một số hợp chất hữu cơ trong mẫu (nước sắc và cao

nước) được thực hiện theo tải liệu [22] và [39] Các nghiệm thức trong thí nghiệm

này được lặp lại 3 lần

* Alkaloid: 2 mL mẫu được bố sung 1 mL HCI 1,5%; 3 — 5 giọt thuốc thửWagner Quan sát hiện tượng kết tủa xuất hiện trong dung dịch Nếu alkaloid có

hiện diện trong mẫu thì kết tủa nâu - đỏ sẽ xuất hiện.

* Flavonoid: 2 mL mẫu được bỗ sung 3 — 5 giọt NaOH 1% Quan sát hiện tượng

biến đôi màu của dung dich Nếu mẫu thử có flavonoid thì màu của dung dich sẽ biếnđổi sang màu vàng - cam - đỏ

* Polyphenol: 2 mL mẫu bô sung 3 — 5 giọt FeCls 5% (pha trong ethanol 90%).

Quan sát hiện tượng biến đôi màu của dung địch Nếu mẫu thử có polyphenol thì màucủa dung dịch sẽ biến đổi sang màu xanh rêu

* Polysaccharide: 5 mL mẫu thử được bỗ sung thêm 25 mL H;SO;: đun sôi hỗnhợp 15 phút; sau đó dé nguội và chuẩn độ bằng NaOH 10% cho đến khi pH=7;

bồ sung thêm 5 mL thuốc thử Fehling và đun sôi trong 2 phút Quan sát hiện tượng

kết tủa xuất hiện trong dung địch Nếu polysaccharide có hiện điện trong mẫu thì kết

tủa đỏ gạch sẽ xuất hiện.

2.4.4 Phương pháp định lượng các hợp chất hitu cơ

Nông độ nước sắc được thử nghiệm có nông độ từ 0,01% đến 0,001% vì các

nông độ trên 0,01% không ghi nhận được giá trị OD (vượt ngưỡng của thiết bị) Nông

độ cao chiết là 200 đến 500 g/mL cũng được lựa chọn vi lí đo như trên Các thí

nghiệm được lặp lại 3 lần.

* Alkaloid

Đề định lượng được hàm lượng alkaloid toàn phan trong mẫu, phương trìnhđường chuan của caffein được xây dựng dựa trên mỗi tương quan giữa x (nồng độ

caffein) va y (gia trị OD).

Quy trình thực hiện ớ nghiệm thức caffein và mẫu được thực hiện tương tự nhau,dựa trên nguyên tắc của tài liệu [39] Các bước thực hiện gồm: 1 mL mẫu hoặc caffeinđược bỗ sung với 5 mL dung dịch BCG và 5 mL dung dich đệm acetate (pH = 4,7);

lic va chiét lan lượt với 1, 2, 3 và 4 mL chloroform; các dịch chiết thu nhận được ở

bước trên được bỗ sung với chloroform vừa đủ 10 mL; đo độ hap thụ ở bước sóng

470 nm.

Nông độ caffein được sử dụng để xây dựng đường chuẩn: 50, 100, 150, 200,

250 pg/mL Các nông độ này được xác định bằng cách: 0,5 mL caflein (nông độ

100 Hg/mL) sẽ có nông là 50 g/mL; tương tự cho các nông độ còn lại (1; 1,5; 2;2,5 mL nông độ 100 pg/mL)

Hàm lượng alkaloid trong mẫu được tính bằng cách thay thế giá trị OD của mẫu

vào phương trình đường chuân caffein Don vị alkaloid: mg CE/g hoặc mg CE/mL.

* Flavonoid

Đề định lượng được hàm lượng flavonoid toàn phan trong mau, phương trình

đường chuẩn của quecertin được xây dựng dựa trên mối tương quan giữa x (nồng độ

quecertin) va y (giá trị OD).

Quy trình thực hiện ở nghiệm thức quecertin va mẫu được thực hiện tương tunhau, dựa trên nguyên tắc của tài liệu [39] Các bước thực hiện gồm: 1 mL mẫu hoặc

quecertin được bỏ sung với 4 mL nước cất và 0,3 mL NaNO: 5%; sau 5 phút, bỗ sung

thêm 0,3 mL AIC; 10%; sau 5 phút, bô sung thêm 2 mL NaOH IM và hỗn hợp

dung dịch được bô sung bang nước cất vừa đủ 10 mL; sau 15 phút, hỗn hợp được

đo độ hap thụ ở bước song 510 nm Các bước thí nghiệm được thực hiện tránh sáng

Nông độ quecertin được sử dụng dé xây dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80,

100 pg/mL Các nồng độ này được xác định bằng cách: pha 0,0010 g quecertin vừa

đủ trong 10 mL (nồng độ 100 pg/mL); sử đụng quecertin nồng độ 100 ug/mL pha

nông độ gallic acid và y là giá trị OD.

Quy trình thực hiện ở nghiệm thức gallic acid và mẫu được thực hiện tương tự

nhau, dựa trên nguyên tắc của tài liệu [39] Các bước thực hiện gồm: I mL mẫu hoặc

gallic acid được bô sung với 9 mL nước cất và 1 mL thuốc thử Folin — Ciocalteu;sau 5 phút, bổ sung thêm 10 mL Na;CO: 7%; hỗn hợp dung dich được bồ sung bằngnước cất vừa đú 25 mL; sau 90 phút, hỗn hợp được đo độ hap thụ & bước sóng 725

nm Các bước thí nghiệm được thực hiện tránh sáng.

Nông độ gallic acid được sử dụng đẻ xây dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80,

100 pg/mL Cách xác định nông độ tương tự như ở nghiệm thức quecertin

Ham lượng polyphenol trong mẫu được tính bằng cách thay thé giá tri OD củamẫu vào phương trình đường chuẩn của gallic acid Đơn vị polyphenlol: mg GAE/g

hoặc mg GAE/mL.

* Polvsaccharide

Đề xác định được hàm lượng polysaccharide trong mẫu, phương trình đường chuẩn của D-glucose được xây dựng dưới dạng y = ax + b trong đó: x là nòng độ

D-glucose và y la giá trị OD.

Quy trình thực hiện ở nghiệm thức D-glucose va mẫu được thực hiện tương tự

nhau, dựa trên nguyên tắc của tải liệu [40] Các bước thực hiện gồm: | mL mẫu hoặc D-glucose được bô sung với 0,5 mL phenol 5%; bô sung thêm 2,5 mL H2SO, đậm

đặc và để nguội ở nhiệt độ phòng; đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm

Nông độ D-glucose được sử dung dé xây dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80, 100 ug/mL Cách xác định nông độ tương tự như ở nghiệm thức quecertin.

Hàm lượng polysaccharide trong mẫu được tính bằng cách thay thé giá trị OD

của mẫu vào phương trình đường chuẩn của D-glucose Đơn vị polysaccharide:

mg GE/g hoặc mg GE/mL.

2.4.5 Phương pháp xác định kha năng kháng oxy hoá in vitro

3.4.5.1 Phương pháp xác định năng lực khử

Phương pháp được thực hiện dựa theo tài liệu [41] Nguyên tắc: Phức Fe(CN)„*

sẽ bị khử thành phức Fe(CN)¿# bởi chất kháng oxy hoá Sau đó, phức Fe(CN),*

sẽ tác dụng với FeCl; tạo thành Fe[Fe(CN);¿]' có mau xanh Màu của Fe[Fe(CN},]} được do mật độ quang ở bước sóng 700 nm Khi nay, mau của dung dịch cảng đậm

thì giá OD càng cao, năng lực khử của chất kháng oxy hoá càng cao

Quy trình được thực hiện như sau: | mL cao nước (nông độ 50, 100, 150, 200,

250, 300, 400, 600, 800, 1000 j1g/mL: được pha theo bang 2.2) được bỏ sung 2,5 mL

dung dịch đệm phosphate 0,2M (pH = 6.6); bô sung thêm 2,5 mL dung dich

K;Fe(CN), 1% và ủ ở nhiệt độ 50°C trong 20 phút; hỗn hợp sau u được bỏ sung

2,5 mL TCA 10% và li tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút; hỗn hợp sau li tam đượclay 2,5 mL dung dịch trên; bô sung 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl; 0,1%;hỗn hợp được đo mật độ quang tại bước sóng 700 nm Chứng âm của thí nghiệm lànước cất và DMSO 2.5%; chứng đương là ascorbic acid có nồng độ 100 pg/mL;các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Bảng 2.2 Các nồng độ cao nước khảo sát trong thử nghiệm năng lực khử

Cao nước ở các nông độ Thể tích stock Thể tích DMSO (2,5%)

khử thành 2,2 - diphenyl - 1 - 1 - picrylhydrazine (DPPH - H) có màu vàng bởi

chất kháng oxy hoá Dựa vào cơ chế này, giá trị OD ở bước sóng 517 nm cảng thấp

so với chứng âm, chứng tỏ nồng độ DPPH trong dung dịch càng ít và khả năng khángoxy hoá của mẫu thử càng mạnh.

Quy trình được thực hiện như sau [42]: 1 mL mẫu thử (nồng độ 20, 40, 60, 80,

100, 120 Hg/mL; được pha theo bảng 2.3) được bô sung 2 mL dung dịch DPPHnòng độ 0,1 mM; hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở điều kiện không có ánh sáng;

đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm Chứng âm của thí nghiệm là nước cất và DMSO2,5%; chứng đương là ascorbic acid có nông độ 8,3 pg/mL — giá trị ECs» được suy ra

từ phương trình đường chuẩn (trình bay ở phụ luc); các thí nghiệm được lặp lại 3 lan

OD,: Giá trị mật độ quang của chứng âm.

OD„;: Giá trị mật độ quang của cao chiết ở từng nồng độ khảo sát.

Từ DPPH (%), phương trình tương quan tuyến tính được xây dựng là:

y =a.ln(x) +b Trong đó: y là DPPH (%); x là nông độ cao chiết (ug/mL); a và b là

hệ số được xác định bằng phần mém thông kê SPSS 27.0 Từ phương trình, giá trị

Trong đề tải, các kết quả về định lượng, giá trị phần trăm được xác định bằng

phần mềm Microsoft Excel 365 Các số liệu khác như: giá trị trung bình, độ lệch

chuan, sự khác biệt giữa các nghiệm thức, p-value, phương trình tương quan được xử

lí bằng phần mềm thống kê SPSS 27.0