3.1. Kết qua nghiên cứu
3.1.1. Kết quả xác định khả năng kháng oxy hoá
3.1.L.L. Năng lực khử của cao nước
Nang lực khử Fe** của cao nước tô hợp được liệu ở các nông độ (50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 600, 800, 1000 g/mL) được thé hiện qua bảng 3.1.
Chứng âm là nước cất 2 lần và DMSO 2,5%; chứng dương là ascorbic acid có
nông độ 100 ug/mL. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
Bang 3.1. Năng lực khử Ee?* của cao nước theo nồng độ
9
[nay Lam | ae [em
Fam Foor [ae
| O37 | 397 | OAM | 411
— 04172 ~ 472 — 043 —~ 473
E 0,514 0,529 0.537 0.527 0,012
DMSO 2,5%
Ascorbic acid 0.786 0,719 0.809 0.771! aoe |
Ghi chủ: a, b, e, doef gh L j, & là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thong kê (LSD, p < 0,05).
31
Nhan xét:
Nang lực khử được thê hiện thông qua giá trị OD (đã trình bày ở chương 1).
Giá trị OD của cao nước tăng dan từ 0,124 đến 1,118, tương ứng theo chiều tăng dan nông độ từ 50 pg/mL đến 1000 pg/mL. Chứng âm (nước cat và DMSO 2,5%) có giá trị OD rất thấp (0.019 và 0,002). Chứng tỏ dung môi nước cất và DMSO 2,5%
không ảnh hưởng đến kết quả năng lực khử của cao nước. Chứng dương
(ascorbic acid, nông độ 100 pg/mL) có giá trị OD là 0,771 đã chứng tỏ năng lực của
ascorbic acid. Như vậy, trong các nồng độ khảo sát, cao nước thé hiện năng lực khử Fe** cao nhất tại nông độ 1000 pg/mL.
Theo đó. gia tri OD ở tat cả các nòng độ đều só sự khác biệt về mặt thống kê
với a = 0,05. Như đã trình bày ở trên (chương 1), giá tri OD càng cao, năng lực khử
Fe** thành Fe°* càng cao. Năng lực khử càng cao chứng minh khá năng
kháng oxy hoá trong thử nghiệm in vitro của cao nước càng mạnh.
3.1.1.2. Kết quả bắt gốc tự do DPPH
3.1.1.2.1. Kết quả bất gốc tự do DPPH của ascorbic acid
Đề làm chứng dương cho các thí nghiệm bắt gốc tự do DPPH, dé tài tiền hành khảo sát tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH của ascorbic acid ở các nòng độ khác nhau. Kết quả được thé hiện qua hình 3.1.
32
© Observed
82.00 — Linear
70.20
6240
8# 220
42.40
39.40
20.60
10.60
2s $0 15 106 ws
nongdo
Hình 3.1. Đồ thị thé hiện sự tương quan giữa DPPH (%) và nồng độ ascorbic acid
Theo hình 3.1, các giá trị DPPH (%) đều phân bố gần hoặc trên đường chuân.
Từ đó, phương trình tương quan tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 2,5 g/mL đến 12,5 pg/mL được xác định là y = 58,57x + 1,34 (R? = 0,993). Với y là tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH và x là nồng độ của ascorbic acid. Qua đú, giỏ tri ICsằ được
xác định là 8,32 pg/mL (phụ lục) và được sử dụng làm chứng dương cho các thử nghiệm sau.
3.1.1.2.2. Kết quả bắt gốc tự do DPPH của cao nước
Cao nước được khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH ở các nòng độ: 20, 40,
60, 80, 100, 120 tig/mL. Chứng âm là nước cất và DMSO 2,5%, chứng dương là ascorbic acid (8,3 ug/mL). Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Kết qua của
thử nghiệm được trình trong bảng 3.2.
33
Bảng 3.2. Tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH của cao nước theo nồng độ Lần | Lần 3
DPPH DPPH Trung bình | Độ lệch chuẩn
(%)
(%)
1,365 2,338
0,444
2,017
Nhận xét:
Chứng đương có giá trị 52,87 + 2,017 % chứng tỏ các kết quả thứ nghiệm trên
có giá tri tin cậy.
DPPH (%) tăng dan từ 27,82% đến 89,37% tương ứng theo chiều tăng dan nông độ cao nước từ 20 pg/mL đến 120 pg/mL. Chứng tỏ cao nước có hoạt tính kháng oxy hoá trong các nòng độ khảo sát. Khả nang này dat giá trị cao nhất (89,37 %) tại nông độ 120 pg/mL. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá không có sự khác biệt về mặt thống kê từ néng độ 100 pg/mL đến 120 g/mL (p = 0,05).
Chứng tỏ cao nước thê hiện tốt khả năng bắt gốc tự do DPPH.
Với các số liệu trên, phương trình tương quan tuyến tính giữa DPPH (%) và nông độ cao nước được xác định với các thông số được thể hiện qua phụ lục.
Đồ thị tương quan được thẻ hiện qua hình 3.2.
34
© Observed
100.09 — Logarithmic
$003
DPPH 09 4009
40029 (
2002
+00 “0 60.0 8.0 1con 1200
nongdo
Hình 3.2. Đồ thị thé hiện tương quan giữa DPPH (%) và nồng độ cao nước
theo phương trình logarithmic
Theo hình 3.2, tại các nông độ 20, 60, 100 thì DPPH (%) của cao nước phân bố gần hoặc trên đường đồ thị. Qua đó, DPPH (%) tăng nhanh trong khoảng từ 20 pg/mL đến dưới 100 ug/mL. Từ 80 pg/mL đến 120 pg/mL, khả năng kháng oxy hoá của cao nước trong thứ nghiệm tăng chậm và tốc độ gia tăng giảm dan. Từ phương trình, giá trị ECso trung bình của ba lần lặp được xác định là
38.47 + 1,89 pg/mL (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Giá trị ECso của cao chiết nước tố hợp được liệu
Lần lặp Lần! Lần2 | Lần3 | Trungbinh | Độ lệch chuẩn |
ECso 36.36 40,00 39.04 38,47 1,89
Đề làm cơ sở giải thích cho hoạt tính kháng oxy hoá của tô hợp dược liệu, dé tai tiến hành định tinh, định lượng các hợp chat: alkaloid. flavonoid, polyphenol,
polysaccharide, Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.
35
3.1.2.1. Kết quả định tính
* Alkaloid
Kết quả định tính alkaloid có trong nước sắc tại nồng độ 1% và cao nước tại nông độ 3 mg/mL được thé hiện qua hình 3.3. Trong đó, chứng dương la caffein;
chứng âm là nước cất; chứng thuốc thử.
we
1
or be
ay wh 1.ằ
Hình 3.3. Kết quả định tính hợp chat alkaloid trong tổ hợp được liệu
Ghi chủ: (+): Chất chuẩn caffein với nông độ 100 pgimL; (-}: Nước cất; (1): mau nước sắc;
(2): Mẫu cao nước; (*): Thuốc thử
Qua hình 3.3. chứng âm không xuất hiện tủa nâu — đỏ trong khi chứng dương
xuất hiện tủa ( it) màu nâu — đỏ. Mẫu nước sắc và cao nước tại hai nồng độ thử nghiệm trên đều cho kết quả xuất hiện tủa nhiều. Diều nay chứng tỏ tại các nông độ này, nước sắc và cao nước có chứa các hợp chất Alkaloid.
* Flavonoid
Két quả định tinh flavonoid được ghi nhận theo hình 3.4. Theo đó,
so với chứng âm là nước cất (trong suốt, chứng đương có màu vàng, thuốc thử trong suốt, nước sắc (1%) và cao nước (3 mg/mL) đều có hiện tượng biến đổi
màu sắc từ màu vàng nhạt sang màu vàng-nâu. Cao nước tại nông này có màu nâu
36
sậm hơn so với nước sắc. Chứng tỏ mẫu thử có sự hiện hiện của các hợp chất
flavonoid.
Hình 3.4. Kết quả định tính hợp chat flavonoid trong tổ hợp dược liệu
Ghi chủ: (+): Chat chuẩn quecertin với nông độ 100 ngán; (-): Nước cất; (1): mẫu nước sắc;
(2): Mau cao nước; (*): Thuốc thử
* Polyphenol
Hình 3.5 trình bay kết định tính hợp chat polyphenol trong nước sắc và
cao nước. Chứng dương là gallic acid (nồng độ 200 g/mL); chứng âm là nước cắt.
Nước sắc (1%) và cao nước (3 mg/mL) có sự biến đổi sang màu xanh rêu
tương tự như chứng dương, trong khi chứng âm (nước cất) không có. Điều này chứng tỏ cả hai mẫu thử đều chứa các hợp chất thuộc nhóm polyphenol.
Hình 3.5. Kết quả định tính hợp chất polyphenol trong tổ hợp được liệu
Ghi chú: (+): Chất chuẩn gallic acid với nồng độ 200 pg/mL; (-): Nước cất; (1): mau nước sắc;
(2): Mau cao nước; (*): Thuốc thie
* Polysacchride
Kết quả định tính polysaccharide được ghi nhận theo hình 3.6. Theo đó, mẫu thử xuất hiện kết tủa đỏ gạch tương tự như chứng đương (D-glucose, nông độ 500 qg/mL). Trong khi, chứng âm (nước cất) không cỏ hiện tượng nay.
Điều này cho thấy có các hợp chat polysaccharide có tồn tại trong hai mẫu thử.
Hình 3.6. Kết quả định tính hợp chất polysacchride trong tổ hợp được liệu
Ghi chú: (+): Chat chuẩn D-glucose với nông độ S00 pg/mL; (-): Nước cat; (1): mau nước sắc;
(2): Mau cao nước; (*): Thuốc thie
38
Như vậy, qua kết quả định tinh, nước sắc và cao nước tai các nông độ khảo sát đêu hiện điện các hợp chất hữu co: alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide.
Kết quả tông hợp được trình bày qua bảng 3.4.
Nước sắc Ye ee :
Polyphenol FeCl, 5% Biên đôi màu dung địch
Cao nước sang xanh rêu
Xuất hiện kết tủa đỏ
Polysaccharide Fehling ach
:
3.1.2.2. Kết qua định lượng
Dé xác định hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong được liệu, đè tài đã xác định được các phương trình tương quan của từng chất chuẩn ứng với các đồ thị được thé hiện theo hình 3.7.
39
của các chất chuẩn
Ghi chú: (a) caJ]ein; (b) quecertin; (cÌ gallic acid; (d) D-glucose
Thông qua đồ thị, các phương trình tương quan được xác định lần lượt là:
-(a): y=0,001x— 0,011 (R? =0,991)
- (b): y = 0,0004x + 0.0062 (R? = 0.997) - (c): y = 0,026x + 0,059 (R? = 1)
- (d): y = 0,013x + 0,1 (R? = 0,999)
Từ các phương trình đường chuẩn, với các giá trị OD của mau thử,
hàm lượng các hợp chất thứ cấp được xác định. Kết quả định lượng một số hợp chất thứ cấp trong nước sắc và cao nước được thê hiện ở bảng 3.5. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Bảng 3.5. Hàm lượng các hợp chất thứ cấp trong tổ hợp dược liệu
Hợp chất thứ cap Nước sắc Cao nước
Alkaloid (mg CEíg hoặc cl hà 2
mg CE/mL) 78.73°'+0.9 133,33 + 9,02
26,01"! + 1,12 189,9? + 7,72
Ghi chú: Trong cùng một cột (một hang), các giả trị được theo sau bởi các chữ cái (các sổ) khác nhau thé hiện sự khác biệt có ÿ nghĩa vẻ mat thông kê (LSD, p < 0,05)
Nhận xét:
Theo bảng 3.5. hàm lượng flavonoid trong mẫu nước sắc là cao nhất và hàm lượng polysaccharide thấp nhất. Cao nước được khảo sát cũng cho kết quả tương tự khi flavonoid là hợp chất có ham lượng cao nhất. Tuy nhiên, ở cao nước, polyphenol có hàm lượng thấp nhất trong các hợp chất được khảo sát. Khi so sánh giữa hai mẫu, cao nước có hàm lượng các chất nhiều hơn nước sắc ở cả bốn hợp chất khảo sát. Đặc biệt, hàm lượng polysaccharide của cao nước cao gấp nhiều lần so với nước sắc.
3.2. Thảo luận
Dựa vào các kết quả trên, cao nước tại các nông độ được khảo sát trong đề tài đều thẻ hiện khả năng kháng oxy hoá theo hai phương pháp là năng lực khử và
bắt gốc tự do DPPH. Theo đó, năng lực khử của cao nước tại nông độ có giá trị ODo s
thấp hơn năng lực khử của ascorbic acid (ODp,s) 5.2 lần. Hiệu quả bắt gốc tự do DPPH của cao nước thấp hơn ascorbic acid khoảng 4.75 lần (giá trị ECsa cao nước/ECaa ascorbic acid). Qua đây cho thấy kết quả kháng oxy hoá ở hai phương pháp nay là gần như tương đương nhau. Điều này có thê giải thích dựa theo các công trình nghiên
cứu trong và ngoài nước [4, 7, §, 9, 10, 13]. Theo đó, các tác giả đã chứng minh từng
41
được liệu thành phan bên trong tô hợp gồm Ban chi liên, Bach hoa xà thiệt thảo, Xa đen đều có khả năng kháng oxy hoá.
Khả năng kháng oxy hoá của cao nước có thẻ được giải thích bởi hàm lượng
các hợp chat tự nhiên có trong tô hợp được liệu. Cụ thé, trong cao nước, các hợp chat tự nhiên: alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide déu hiện điện với hàm lượng nhất định. Như đã trình bày ở chương 1, các hợp chất này đều đã được chứng minh là có hoạt tính kháng oxy tốt. Theo các công trình nghiên cứu, tính kháng oxy hoá của một chất sẽ phụ thuộc vào số nhóm hydroxyl (— OH) — nhóm chức phô biến ở các hợp chat flavonoid và phenolic [43]. Ngoài ra, các liên kết C=C và nhóm carbonyl của các hợp chất tự nhiên giúp tạo liên kết bèn vững với các gốc tự do, từ đó giúp loại bỏ chúng [44]. Vi vậy, ham lượng cao flavonoid (chiếm khoảng 50%) và polyphenol (chiếm khoảng 10%) có thé đã góp phan hình thành nên hoạt tính
kháng oxy hoá của cao nước.
Ngoài ra, dé tăng thêm tính thuyết phục, dé tiễn hành định lượng các hợp chat thử cấp trong mỗi được liệu và được thé hiện qua bang 3.7. Khi so sánh kết quả
định lượng nay, Xa den có hàm lượng flavonoid, polyphenol va polysaccharide
nhiều hơn so với Ban chi liên, Bach hoa xà thiệt thảo và ca tổ hợp được liệu.
Kết quả này tương tự ở cả nước sắc và cao nước. Điều nảy cũng giải thích cho kết qua kháng oxy hoá của Xa den tốt hơn hai được liệu còn lại trong kết quả nghiên cứu
của Phùng Anh Tai (2021).
42
Bảng 3.6. Kết quả định lượng một số hợp chất tự nhiên trong tổ hợp được liệu và các dược liệu thành phần
CÔ MẪU Alkaloid Polyphenol | Polysaccharide
: a2 hị
Nước sắc | 95.2%25,78 | 46 * | MSE | 240? + 1,56
Cã BI
Cao nước | APE # | 30622008) “II * | 97,428 + 4,46
1 ơx bị 2425* +
Bạch hoa Nước sắc | 70,13”' + 4,46 Lil xà thiệt
14,1°°+0,96 | 19,84* + 1,28
0,71
; b2 ¿ dy
Nước sắc | 29,07"! + 2,12 cet id 4 29,52°! + 2,78
D3 4 D2 5
Cao nước | 57,678! + ae | og | | 17331 #7.5
, 2 d4 c2
Nước sắc | 78739+0ứ | 710220 * | “để ° | 2609x112
Tô hợp : :
dược liệu CI cs cl
Cao nước | GT ® | #7 | HHỂY # | 189.910? £7.72
Ghi chi: Trong củng mot cot, các chữ cái a, b,c, d (A, B,C, DJ thé hiện sự khác biết có ý nghia vẻ
mặt thống kể với a = 0,05 của mẫu nước sắc (cao nước}
Trong cùng một hàng, các chữ số 1, 2, 3, 4 thể hiện sự khác biết có ý nghĩa về mat thông kê với
ô = 0,05
Khi phân tích kết quả kháng oxy hoá cũng như kết quả định lượng các hợp chất thứ cấp cho thay cao nước tốt hơn nước sắc. Điều này có thé giải thích do trong
phương pháp thu nhận cao nước, các được liệu được ủ trong thời gian lâu hơn theo
phương pháp chiết kiệt. Vì vậy, khả năng thu nhận các hợp chất hữu cơ cao hơn.
Trong đông y, Xa den là dược liệu được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư.
Một số công trình nghiên cứu cho thấy trong cao chiết Xạ đen chứa các chất có khả năng gây độc tế bao thuộc các nhóm flavonoid va polyphenol như: methyl caffeate, oresbiusin B [45], maytenfolone-A [46]. Trên cơ sở lí luận của tông quan
43
dé tai, sự gia tăng gốc tự do và stress oxy hoá có mối quan hệ mật thiết với các van đề sức khoẻ. Vi vậy, tổ hợp được liệu với Xa đen là thành phan chủ yếu có thé được sử dụng hằng ngày như một nguồn chat kháng oxy hoá bô sung trong việc phòng các van dé sức khoẻ liên qua đến gốc tự do cũng như trong chữa trị bệnh ung thư.
; KET LUAN VA KIEN NGHI
I. KET LUẬN
Đề tải đã xác định khả năng kháng oxy hoa của cao nước tô hợp dược liệu theo
hai phương pháp thông qua phương pháp năng lực khử và bắt gốc tự do DPPH. Dong
thời, dé tai cũng định tính, định lượng các hợp chat thử cap. Cy thẻ:
Về khảo sát khả năng khang oxy hoá:
- Phương pháp năng lực khử: cao nước có giá trị OD tăng từ 0,124 + 0,011 đến 1,118 + 0,026 tương ứng theo chiều tăng nông độ từ 50 g/mL đến 1000 g/mL.
- Phương pháp bất gốc tự do DPPH: cao nước có giá trị ECso là
38,47 + 1,89 g/mL.
Vẻ định tính, định lượng một số hợp chat thứ cấp: dé tài đã xác định sự hiện điện và hàm lượng của bốn hợp chất thử cấp gồm: alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide. Trong đó, flavonoid là hợp chất có hàm lượng cao nhất ở cả nước sắc và cao nước với giá trị lần lượt là 216,95 + 14,89 mg QE/mL và
487,25 + 19,3 mg QE/g.
Il. KIÊN NGHỊ
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của tô hợp được liệu theo cơ chế phân tử thông qua xác định sự biểu hiện các gene kháng oxy hoá.
45