Nhóm 1

Thí nghiệm 2: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau .... Thí nghiệm 2: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau .... Kết quả

KỸ THUẬT SẮC KÍ NÂNG CAO

TS TRỊNH THỊ PHI LY PHAN THANH BẠCH - 21126282

TRẦN NGỌC BẢO CHÂU - 21126288 PHẠM THÀNH CÔNG - 21126294

LÊ HỒNG DUY - 21126314

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về cỏ Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides L.) 1

1.2 Sắc ký cột (Column Chromatography) 3

1.3 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 4

1.4 Dung môi Ethanol 5

1.5 Dung môi N - Hexane 5

1.6 Dung môi Acetone 5

CHƯƠNG 2 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI ĐẾN HIỆU SUẤT CHẤT CHIẾT THÔ 7

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 7

2.2 Vật liệu thí nghiệm 7

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm 7

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 7

2.2.3 Hóa chất 7

2.3 Phương pháp thí nghiệm 7

2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy 7

2.3.2 Thí nghiệm 2: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 8

2.4 Kết quả 9

2.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy 9

2.4.2 Thí nghiệm 2: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau 9

2.5 Thảo luận 10

CHƯƠNG 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ CỘT VÀ SẮC KÍ BẢN MỎNG 11

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 11

3.2 Vật liệu thí nghiệm 11

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 11

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 11

3.2.3 Hóa chất 11

3.3 Phương pháp thí nghiệm 11

3.3.1 Chuẩn bị dịch chiết cỏ ngũ sắc 11

3.3.2 Thí nghiệm 1: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột 12

3.3.3 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng 13

3.4 Kết quả 14

3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột 14

3.4.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng 15

3.5 Thảo luận 18

3.5.1 Thí nghiệm 1: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột 18

3.5.2 Thí nghiệm 2: Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng 18

BÀI TẬP 20

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

OD: Optical Density Meters

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Kết quả xác định độ ẩm của bột cỏ Ngũ Sắc 9 Bảng 2.2 Kết quả tính hiệu suất chất chiết thô của hai loại dung môi là ethanol và n -

hexane 10

Bảng 4.1 Kết quả phân tách sắc tố dịch chiết cỏ ngũ sắc bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng

- TLC trong hỗn hợp dung môi n - hexane và acetone tỉ lệ 6:4 15

Bảng 4.2 Kết quả phân tách sắc tố dịch chiết cỏ ngũ sắc bằng kĩ thuật sắc ký bản mỏng

- TLC trong hỗn hợp dung môi n - hexane và acetone tỉ lệ 7:3 16

Bảng 4.3 So sánh hai pha động hỗn hợp n - hexane và acetone ở tỉ lệ 7:3 và 6:4 19

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cỏ ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.) 2

Hình 2.1 Mẫu chuẩn bị cho vào tủ sấy 8

Hình 2.2 Dịch chiết bột cỏ Ngũ Sắc khi chiết với 2 loại dung môi khác nhau 9

Hình 3.1 Dịch chiết cỏ ngũ sắc 12

Hình 3.2 Cho mẫu vào cột 13

Hình 3.3 Rửa giải mẫu 13

Hình 3.4 Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký lớp mỏng – TLC 14

Hình 4.1 Các nhóm sắc tố thu từ dịch chiết cỏ Ngũ Sắc bằng kĩ thuật sắc ký cột 15

Hình 4.2 Các nhóm sắc tố thu từ dịch chiết cỏ Ngũ Sắc bằng kĩ thuật sắc kí TLC trong hỗn hợp dung môi n - hexane và acetone tỉ lệ 6:4 16

Hình 4.3 Kết quả phân tách sắc tố dịch chiết cỏ ngũ sắc bằng kĩ thuật TLC trong hỗn hợp dung môi n - hexane và acetone tỉ lệ 7:3 17

Hình 4.4 Kết quả soi dưới đèn UV 254 nm 18

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cỏ Ngũ Sắc (Ageratum conyzoides L.)

Cỏ Ngũ Sắc có tên khoa học là Ageratum conyzoides L đây là loài cây thuộc họ cúc

Asteraceae (Compositae), hay còn có nhiều tên gọi khác như cỏ hôi, cây bù xích, hoa ngũ

vị, thắng hồng kế, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ A conyzoides thường mọc ở

khu vực đồng cỏ, đất nông nghiệp, đất ngập nước, bờ sông và cồn ven biển, phổ biến ở các khu vực bị xáo trộn hay thoái hóa Đây là một loại cỏ dại quan trọng đối với cây trồng và đồng cỏ

Đặc điểm: A conyzoides là một loài thực vật thân thảo mọc thẳng, phân nhánh, với

mùi thơm nhẹ đặc trưng, sinh trưởng quanh năm Cây có bộ rễ nông, dạng sợi, và có thể phát triển đến chiều cao khoảng 1m Thân và lá được phủ lớp lông mịn màu trắng Lá có hình trứng, rộng ở gốc, mọc đối, màu xanh lục với mặt dưới nhạt hơn mặt trên Phiến lá nguyên, mép có răng cưa tròn mềm mại Hoa của cây nhỏ, mang sắc tím, xanh lam, hơi hồng hoặc trắng, tập hợp thành cụm hoa hình đầu, mỗi cụm gồm 30–50 hoa mọc gần nhau

Lá bắc tổng bao xếp thành hai hàng đều nhau, tồn tại đến khi quả rụng Mỗi hoa có năm lá đài dạng vảy tam giác, đầu kéo dài thành mũi nhọn Quả bế màu đen, có năm cạnh với gai thưa, đỉnh quả có năm vảy nhọn, chứa duy nhất một hạt Loài này sinh sản chủ yếu qua hạt, được phát tán nhờ lông bám vào động vật, quần áo, hoặc máy móc nông nghiệp Cây có vòng đời rất ngắn, chỉ mất chưa đầy hai tháng từ khi nảy mầm đến khi ra hoa Hạt giống nảy mầm khi gặp ánh sáng (sinh quang) và thường mất khả năng nảy mầm sau 12 tháng

Hình 1.1 Cỏ ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.)

Một số hợp chất chính có trong cây A conyzoides:

Flavonoids: Chứa một số flavonoids bao gồm quercetin và kaempferol Các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư và có thể có tác dụng bảo

vệ tế bào

Pyrrolizidine Alkaloids: Chứa một số alkaloid chính như epi-isoarborinol,

senecionine, retrorsine, crotaline Đây là nhóm hợp chất chính có mặt trong A conyzoides

và có thể gây độc đối với gan nếu sử dụng lâu dài hoặc ở liều cao

Phenolic acid: Bao gồm caffeic acid có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm Terpenoids: Bao gồm caryophyllene, caryophyllene oxide, alpha - pinene, beta - pinene Đây là nhóm hợp chất có khả năng kháng viêm, chống vi khuẩn, và có tác dụng giảm đau Các terpenoid này có mặt trong tinh dầu của cây và cũng góp phần tạo nên mùi hương đặc trưng của cây

Saponins: Ageratoid (chất đặc trưng từ loài cây này), là các hợp chất có thể có tác dụng kháng vi khuẩn và kháng nấm Tuy nhiên, saponins cũng có thể gây tác dụng phụ như kích ứng dạ dày

Triterpenes: Chứa các chất chính như oleanolic acid, betulinic acid có tác dụng chống viêm, chống ung thư, hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến hệ miễn dịch và da

Chlorophyll: Bao gồm Chlorophyll a và chlorophyll b là hai loại diệp lục chính có mặt trong hầu hết các loài thực vật với đặc trưng hợp chất màu xanh lục, có vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp, giúp cây chuyển hóa năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học để phát triển

Carotenoid: Bao gồm Beta-carotene, lutein, zeaxanthin, thường có mặt chủ yếu trong phần hoa của cây, vì hoa có màu sắc rực rỡ như cam, vàng, đỏ và tím Mặc dù carotenoid không phải là hợp chất chính trong cây, nhưng vẫn góp phần tạo ra màu sắc hấp dẫn của hoa và có tác dụng bảo vệ cây khỏi các tác nhân gây hại từ môi trường, có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, bảo vệ tế bào khỏi sự hư hại do các gốc tự do

Ứng dụng: Trong y học dân gian, cây A conyzoides được sử dụng để điều trị nhiều

bệnh như viêm khớp, cảm lạnh, sốt, và các vấn đề về tiêu hóa Tuy nhiên, cần thận trọng khi sử dụng vì các chất alkaloid pyrrolizidine có thể gây hại cho gan nếu sử dụng lâu dài hoặc ở liều cao

1.2 Sắc ký cột (Column Chromatography)

Sắc ký cột (Column Chromatography) là một kỹ thuật phân tích và tách các hợp

chất trong một hỗn hợp dựa trên sự khác biệt về độ tương tác giữa các thành phần trong mẫu với pha tĩnh và pha động Kỹ thuật này thường được sử dụng trong hóa học phân tích

và tổng hợp để tách các hợp chất hữu cơ, dược phẩm hoặc các hợp chất sinh học Sắc ký cột có thể được thực hiện theo hai phương pháp chính: sắc ký lỏng (liquid chromatography) và sắc ký khí (gas chromatography), tùy thuộc vào loại pha động sử dụng Cấu tạo của hệ thống sắc ký cột bao gồm:

Cột sắc ký: Là một ống dài, thường làm bằng thủy tinh hoặc nhựa, chứa pha tĩnh (thường là silica gel hoặc alumina) Pha tĩnh có chức năng hấp phụ tốt các hợp chất trong mẫu, có hình dạng và kích thước đồng đều (40 – 200 µm), không phản ứng với hợp chất, không màu, rẻ tiền và phù hợp trong phân tách nhiều thành phần

Pha động: Là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi được đưa qua cột, giúp di chuyển các hợp chất trong mẫu qua pha tĩnh Pha động có thể là dung môi không phân cực, phân cực hoặc hỗn hợp dung môi tùy thuộc vào bản chất của các hợp chất cần tách

Bước 4: Quá trình rửa giải các hợp chất tách biệt có thể được thu thập ra từ các phần cột khác nhau (gọi là fracciones) và xác định bằng các phương pháp phân tích khác

Ứng dụng: Tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp, cô lập các hợp chất mới, tinh sạch hợp chất quan tâm, loại bỏ hợp chất

1.3 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) là một kỹ thuật sắc ký đơn giản, hiệu quả và thường được sử dụng để phân tích và tách các hợp chất trong một hỗn hợp, đặc biệt là trong nghiên cứu hóa học và sinh học Kỹ thuật này hoạt động dựa trên sự khác biệt trong độ di chuyển của các hợp chất qua một lớp pha tĩnh trên bề mặt của một bản mỏng Cấu tạo của hệ thống sắc kí bản mỏng:

Bản mỏng (pha tĩnh): Thường được làm từ kính, nhựa hoặc nhôm với một lớp mỏng

của chất hấp phụ (thường là silica gel, alumina hoặc cellulose) được phủ lên bề mặt, dày khoảng 0,1 – 0,2 mm

Pha động: Là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi được sử dụng để vận chuyển các hợp chất trên bề mặt bản mỏng Pha động sẽ di chuyển theo chiều thẳng đứng hoặc theo một góc nghiêng trên bản mỏng dựa vào lực mao dẫn

Bước 4: Thực hiện sắc ký Bản mỏng được đặt vào một bể sắc ký có chứa pha động

và lưu ý điểm xuất phát không bị ngập trong dung môi Pha động sẽ di chuyển lên trên qua lớp pha tĩnh, mang theo các hợp chất trong mẫu Các hợp chất trong mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào độ tương tác với pha tĩnh và pha động Các hợp chất tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn, trong khi các hợp chất tương tác yếu sẽ di chuyển nhanh hơn

Bước 5: Phát hiện và phân tích Sau khi pha động di chuyển hết trên bản mỏng, các hợp chất sẽ được nhìn thấy dưới ánh sáng tử ngoại hoặc nhuộm màu (nếu cần thiết) Các vết xuất hiện sẽ được đo khoảng cách di chuyển, gọi là hệ số lưu giữ (Rf) Hệ số lưu giữ là

tỷ lệ giữa khoảng cách mà hợp chất di chuyển và khoảng cách pha động di chuyển Dựa trên giá trị Rf có thể xác định các hợp chất trong mẫu

Ứng dụng: Kiểm tra độ tinh khiết, kiểm tra sự khác biệt giữa hai hay nhiều hợp chất, bán định lượng hợp chất và theo dõi phản ứng tổng hợp theo thời gian

1.4 Dung môi Ethanol

Ethanol (C₂H₅OH) là một dung môi phân cực do có nhóm hydroxyl (-OH) có khả năng tạo liên kết hydrogen, giúp ethanol dễ hòa tan trong nước và có tính chất phân cực Cấu trúc phân tử của ethanol cũng có sự phân bố không đều của điện tích, với phần -OH mang điện tích âm và phần -C₂H₅ mang tính kỵ nước, tạo nên sự phân cực trong phân tử

1.5 Dung môi N – Hexane

N-hexane (C₆H₁₄) là một dung môi kém phân cực là do phân tử n-hexane chỉ chứa các liên kết C - H và C - C, mà các liên kết này không tạo ra sự phân cực đáng kể Các nguyên tử cacbon và hydro trong n-hexane có độ âm điện khá giống nhau, vì vậy không có

sự phân cực trong toàn bộ phân tử Vì vậy, n-hexane có khả năng hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, chẳng hạn như dầu mỡ, chất béo, và nhiều polymer không phân cực Nó thường được sử dụng trong các ứng dụng như tẩy rửa, chiết xuất, và phân tích hóa học, đặc biệt là trong các phản ứng với các chất không phân cực

1.6 Dung môi Acetone

Acetone là một dung môi phân cực mặc dù phân tử acetone có một nhóm metyl (– CH₃) không phân cực, nhưng nhóm carbonyl (C = O) tại vị trí trung tâm của phân tử tạo ra một cực điện Nhóm carbonyl này có độ âm điện cao, gây ra sự phân cực trong phân tử acetone, tạo nên một cực dương tại nguyên tử cacbon và cực âm tại nguyên tử oxy

Vì lý do này, acetone có khả năng hòa tan tốt các hợp chất phân cực, chẳng hạn như các hợp chất có nhóm hydroxyl (–OH) hoặc các hợp chất chứa nhóm carbonyl (– C = O),

và do đó, acetone thường được sử dụng làm dung môi trong các phản ứng hóa học và trong công nghiệp

CHƯƠNG 2 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG MÔI ĐẾN HIỆU SUẤT CHẤT CHIẾT THÔ

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thời gian thực hiện: 8 giờ ngày 06/11/2024

Địa điểm: Phòng thí nghiệm 306 – Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (RIBE), Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Cỏ ngũ sắc được sấy khô và xay nhuyễn thành dạng bột, cung cấp bởi phòng thí nghiệm 306 – RIBE, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2.3 Hóa chất

Dung môi n-hexane và ethanol

2.3 Phương pháp thí nghiệm

2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy

Bước 1: Cân chén sấy, ghi nhận lại số liệu

Bước 2: Cân 2 g mẫu hoa ngũ sắc cho vào chén sấy, lặp lại nghiệm thức hai lần Bước 3: Sấy khô mẫu ở 105oC cho đến khi khối lượng không đổi Sau đó, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm

Bước 4: Tiến hành cân chén mẫu sau khi sấy, ghi nhận số liệu ở hai lần lặp lại nghiệm thức để thực hiện tính toán kết quả

Hình 2.1 Mẫu chuẩn bị cho vào tủ sấy

2.3.2 Thí nghiệm 2: Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bằng các dung môi khác nhau

Bước 1: Cân 1 g mẫu hoa ngũ sắc cho vào bình erlen, lặp lại nghiệm thức hai lần Bước 2: Hai dung môi được chọn để ly trích chất chiết thô trong mẫu là ethanol và n-hexane Thêm vào bình erlen 15 mL mỗi loại dung môi cho thấm ướt mẫu và thực hiện ủ sóng siêu âm trong 15 phút Sau đó, lọc dịch chiết qua giấy lọc (đã biết khối lượng)

Bước 3: Tiến hành tương tự lần thứ hai cho mỗi loại dung môi và lọc hết phần bã trong bình erlen qua giấy lọc

Bước 4: Sấy khô cả bã và giấy lọc cho mỗi loại dung môi trên ở 105oC đến khi khối lượng không đổi

Bước 5: Tiến hành cân giấy lọc sau khi sấy, ghi nhận số liệu cho mỗi loại dung môi trên để thực hiện tính toán kết quả

Hình 2.2 Dịch chiết cỏ Ngũ Sắc khi chiết với hai

loại dung môi khác nhau

2.4 Kết quả

2.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy

Độ ẩm của mẫu được xác định theo công thức:

W % = 𝑤1−𝑤2

× 100

𝑚 Trong đó: w1: khối lượng mẫu thử và chén trước khi sấy (g)

w2: khối lượng mẫu thử và chén sau khi sấy (g) m: khối lượng mẫu thử trước khi sấy (g)

Trong đó: m1: khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

m2: khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

m0: khối lượng giấy lọc (g) m: tổng khối lượng giấy lọc và bã sau khi sấy khô kiệt (g)

Bảng 2.2 Kết quả tính hiệu suất chất chiết thô của hai loại dung môi là ethanol và n-

hexane

Dung môi m1 (g) m (g) m0 (g) H (%) Ethanol 1,0002 × 90,3%

= 0,9032 1,6316 0,7738 5,02 N-hexane 1,0032 × 90,3%

= 0,9059 1,6597 0,7704 1,83

2.5 Thảo luận

Kết quả từ thí nghiệm ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu bột cỏ Ngũ Sắc cho thấy hiệu suất chiết của nguyên liệu trong dung môi phân cực ethanol đạt 5,02 % hiệu quả hơn so với dung môi không phân cực n- hexane đạt 1,83 % Vì ethanol là dung môi có nhiều gốc -OH nên độ phân cực cao, hoà tan tốt chất phân cực trong mẫu bột cỏ Ngũ Sắc