Nhóm 1 thứ 5 ca 3 lý thuyết chẩn Đoán tv bằng shpt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC ỨNG DỤNG LATERAL FLOW IMMUNOASSAY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH XOĂN LÁ TRÊN CÂY NHO BẰ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG LATERAL FLOW IMMUNOASSAY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH XOĂN LÁ TRÊN CÂY NHO

BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Nhóm thực hiện : NHÓM 1-CA 3-THỨ 5

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG LATERAL FLOW IMMUNOASSAY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH XOĂN LÁ TRÊN CÂY NHO

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện:

STT Mã số sinh viên Họ và tên Ký tên

1 21126482 Đặng Thị Bảo Quyên

2 21126413 Dương Võ Phương Ngân

3 21126037 Huỳnh Ngọc Thùy Dương

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH SÁCH CÁC HÌNH 6

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quát về bệnh thực vật 2

2.2 Tổng quan về cây nho 2

2.2.1 Giới thiệu chung 2

2.2.2 Đặc điểm hình thái 3

2.2.3 Điều kiện sinh trưởng 3

2.3 Bệnh xoăn lá trên cây nho 3

2.3.1 Nguyên nhân 3

2.3.2 Triệu chứng bệnh 4

2.3.3 Phân bố bệnh và mức ảnh hưởng 4

2.3.4 Biện pháp phòng ngừa và quản lý bệnh 5

2.4 Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thực vật 6

2.5 Lateral Flow Immunoassay 6

2.5.1 Lịch sử phát triển 6

2.5.2 Giới thiệu nguyên lý 7

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả 7

2.5.4 Ứng dụng Lateral Flow Immunoassay trong chẩn đoán bệnh thực vật 8

2.3.5 Một số nghiên cứu ứng dụng Lateral Flow Immunoassay trong chẩn đoán bệnh thực vật 8

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP LFIA TRONG 9

CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT 9

3.1 Cấu tạo 9

3.2 Nguyên lý chẩn đoán 10

3.3 Quy trình kiểm tra mẫu bệnh thực vật 11

3.4 Cách đọc kết quả 12

3.5 Lợi ích và hạn chế 13

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 14

4.1 Thảo luận 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

GLRaV : Grapevine leafroll-associated virus

LFA : Lateral Flow Assay

LFIA : Lateral Flow Immunoassay

PCR : Polymerase Chain Reactio

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nho là một loại quả mọng lấy từ các loài cây thân leo thuộc chi Vitis Ở nước ta câynho thường được trồng tập trung nhiều tại tỉnh Ninh Thuận, do đặc tính khí hậu, thổnhưỡng nơi đây phù hợp với sự sinh trưởng của cây nho Theo Sở Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn Ninh Thuận (2023), cây nho là cây có giá trị kinh tế cao trong các loạicây trồng, đem lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân Năm 2022 diện tích trồng nho trênđịa bàn toàn tỉnh là 1.052,8 ha (trong đó diện tích cho thu hoạch đạt 1.000,8 ha), năngsuất đạt 256,8 tạ/ha, sản lượng đạt 25.705 tấn Diện tích trồng nho tập trung nhiều ở cáchuyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn, Thuận Nam và thành phố Phan Rang - ThápChàm Quy mô diện tích trồng nho của các hộ dân dao dộng từ 0,1-3 ha/hộ

Tuy nhiên, song song với giá trị kinh tế lớn, năng suất và chất lượng nho vẫn cònnhiều hạn chế do ảnh hưởng của các loại bệnh hại Bên cạnh những bệnh phổ biến nhưthán thư, phấn trắng, mốc sương, bệnh xoăn lá đang ngày càng trở thành một mối đe dọanghiêm trọng đối với ngành trồng nho Bệnh xoăn lá trên cây nho (Grapevine leafrolldisease - GLD) là một trong những bệnh virus quan trọng nhất ảnh hưởng đến các giốngnho làm rượu vang, nho ép nước và nho ăn tươi, cũng như gốc ghép Hiện tại, nó đượcxếp hạng là một trong những bệnh quan trọng nhất ảnh hưởng đến các giống nho làmrượu vang, tương đương với một số bệnh nấm (Naidu, 2008) Tác nhân chủ yếu gây ra

bệnh xoăn lá trên cây nho là virus Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV), chúng

làm lá cây nho bị xoăn lại, mép lá cong vào trong, phiến lá dày lên và trở nên cứng hơnbình thường Cây bị bệnh xoăn lá thường sinh trưởng kém, cành non ngắn, chùm hoa vàquả ít Để đưa ra các biện pháp phòng trừ kịp thời và hiệu quả, việc chẩn đoán chính xác

và nhanh chóng bệnh là vô cùng quan trọng Phương pháp Lateral Flow Immunoassay(LFIA) nổi lên như một giải pháp tiềm năng Với ưu điểm đơn giản, nhanh chóng, dễ sửdụng và cho kết quả trực quan, từ đó có thể đưa ra các biện pháp can thiệp phù hợp, hạnchế sự lây lan của bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định phương pháp Lateral Flow Immunoassay giúp chẩn đoán bệnh xoăn lá trêncây nho

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quát về bệnh thực vật

Bệnh thực vật là bệnh ở thực vật do tác nhân gây bệnh (sinh vật truyền nhiễm) vàđiều kiện môi trường (yếu tố sinh lý) gây ra Các sinh vật gây bệnh truyền nhiễm baogồm nấm, oomycetes, vi khuẩn, virus, viroid, phytoplasma, động vật nguyên sinh, tuyếntrùng và thực vật ký sinh Thực vật bị bệnh là hiện tượng khi thực vật không đủ khả năngthích ứng với những biến đổi của môi trường hoặc với những kích thích của những sinhvật khác, làm đảo lộn hoạt động sinh lý, gây bất lợi đến sinh trưởng hoặc làm thực vật bịchết, nếu trên diện lớn có thể dẫn đến tổn thất về kinh tế và sinh thái Việc chẩn đoánchính xác tác nhân gây bệnh là vô cùng cần thiết trước khi đưa ra biện pháp quản lý bệnhhại tổng hợp

2.2 Tổng quan về cây nho

2.2.1 Giới thiệu chung

Vitis vinifera (Nho thường) phân bố bản địa của vùng Địa Trung Hải, trung châu Âu

và tây nam châu Á, từ Maroc và Bồ Đào Nha bắc đến phía nam Đức và đông đến bắcIran Đó là một dây leo cao tới 35 m, với vỏ cây dễ bong Các lá so le, thùy chân vịt, dài 5 – 20 cm và rộng Quả là loại quả mọng, được gọi là quả nho, quả có đường kính 6 mm vàchín màu tím sẫm đến đen với một hoa sáp nhạt, cây trồng thường lớn hơn nhiều, lên đến

3 cm, và có thể có màu xanh lá cây, đỏ, hoặc tím Loài này thường hiện diện trong cáckhu rừng ẩm ướt và ven suối

Nho được trồng trên mọi lục địa trên Trái Đất trừ châu Nam Cực Tại châu Âu, ở khuvực miền Trung và miền Nam; ở châu Á, ở khu vực phía Tây (Tiểu Á, Caucasus, TrungĐông) và tại Trung Quốc

Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Vitales

Họ (familia): Vitaceae

Chi (genus): Vitis

Loài (species): V vinifera Hình 2.1 Vitis vinifera.

2.2.2 Đặc điểm hình thái

Nho là cây thân thảo, dạng leo Trên thân cây có tua cuốn ở vị trí đối diện lá đượchình thành từ thân và cành Tua cuốn giữ chức năng bám vào giàn leo giúp cây vữngchắc Cây nho có lá đơn, hình trái tim, xung quanh có nhiều khứa nhỏ hình răng cưa Rễcây thuộc dạng rễ chùm, ăn sâu vào đất khoảng 30 – 60 cm và trải rộng quanh vùng táncây Hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trên các đốt cành, kích thước hoa nhỏ và có màuxanh nhạt Một số giống nho có nguồn gốc từ Mỹ có hoa đơn tính (chỉ mang tính đựchoặc tính cái) Quả có kích thước nhỏ, hình tròn, đường kính quả trung bình từ 1,5 – 3

cm, vỏ mỏng và hơi dính vào thịt quả Khi chín, quả có màu xanh, đỏ hoặc tím tùy vàotừng loại giống Trong quả có các hạt nhỏ, một số giống thì không có hạt

2.2.3 Điều kiện sinh trưởng

Nho thích hợp trồng ở vùng có khí hậu khô, độ ẩm không khí thấp, lượng mưa khôngquá lớn Khu vực lí tưởng để trồng nho là phải đảm bảo có mùa nắng kéo dài 4 - 5 tháng

để cây có đủ thời gian tích trữ đường Cây nho sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ khôngquá cao Thực tế, cây có thể chịu lạnh tới - 20ºC và chịu nóng đến 45ºC Tuy nhiên, nhiệt

độ quá cao hoặc quá thấp ảnh hưởng đến khả năng cho hoa đầu trái của cây

Nho là một loại cây ưa ánh sáng và ưa nắng Vì thế nên trồng nho ở những nơi hứngnắng, nhưng phải che chắn gió tốt để tránh gió to làm đó giàn, dập quả, rụng lá Đất trồngnho nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng, có độ thoát nước tốt Tuy nhiên, nho vẫn có thểđược trồng trên vùng đất cát, đất sỏi nếu bổ sung đủ phân hữu cơ và khoáng vi lượng cao

2.3 Bệnh xoăn lá trên cây nho

2.3.1 Nguyên nhân

Bệnh xoăn lá là một trong những căn bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng cho câynho, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả Bệnh xoăn lá trên cây nho chủyếu do sự tấn công của các tác nhân sinh học như virus, côn trùng hoặc nấm Một trongnhững nguyên nhân phổ biến nhất là do virus Grapevine leafroll-associated virus(GLRaV), đặc biệt là các chủng của virus này, gây ra hiện tượng xoăn và biến dạng lánho Virus GLRaV lây lan chủ yếu thông qua côn trùng môi giới, đặc biệt là rệp phấn.Khi virus xâm nhập vào cây nho, nó ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây, làmgiảm sự phát triển của cây và chất lượng quả Bên cạnh virus, bệnh xoăn lá cũng có thể

do nhiễm nấm hoặc các yếu tố môi trường như thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, hoặc quản lý câytrồng không đúng cách Các yếu tố này gây stress cho cây, làm cho lá bị xoăn, vàng và

kém phát triển, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng nho.

2.3.2 Triệu chứng bệnh

Ở những cây bị nhiễm vi-rút, sự phát triển chậm lại, diện tích lá giảm và chồi trở nênyếu Hàm lượng diệp lục thấp, biểu hiện bằng sự thay đổi màu lá, dẫn đến giảm hoạtđộng quang hợp Các triệu chứng GLD rõ ràng nhất xuất hiện vào mùa thu, khi các giốngmàu đỏ có lá chuyển sang màu đỏ với gân xanh Mặc dù các triệu chứng không rõ ràng ởcác giống màu trắng nhưng có hiện tượng nhiễm clo nhẹ ở lá Cả hai giống màu đỏ vàtrắng đều có hiện tượng mép lá cuộn xuống và sự phá vỡ mạch rây

Có những bệnh khác cũng ảnh hưởng đến hình thức bên ngoài của lá (các loại viruskhác trên nho, túi mật do vi khuẩn, bệnh ở rễ, bệnh ở thân nho) Sự thiếu hụt chất dinhdưỡng cũng có thể ảnh hưởng đến đặc điểm của lá và gây ra các triệu chứng giống nhưbệnh cuộn lá nho Ví dụ, những cây nho thiếu phốt pho, kali hoặc magie có xu hướng bịđổi màu các lá già với các gân chính màu xanh lục Chỉ riêng triệu chứng không phải làđặc điểm chẩn đoán đáng tin cậy của bệnh cuộn lá nho Nếu nghi ngờ nhiễm virus xoăn

lá, nó chỉ có thể được xác nhận thông qua xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.3.3 Phân bố bệnh và mức ảnh hưởng

Bệnh cuộn lá nho rõ ràng nhất và là vấn đề rắc rối nhất ở những vùng có khí hậu mát

mẻ, có mặt ở hầu hết các vùng trồng nho thương mại Sự phân bố của nó được cho là dovận chuyển vật liệu thực vật bị nhiễm vi rút trong khu vực, lục địa và liên lục địa Mặc dùGLD (Grapevine leafroll dease) từ lâu đã có mặt ở các vùng trồng nho lớn, nhưng gầnđây nó mới được công nhận là một căn bệnh có tầm quan trọng kinh tế

Hậu quả nhiễm GLD là hàm lượng đường trong quả giảm 30%, quả trở nên nhỏ hơn

và thời gian chín của chúng tăng lên Sự phức tạp của các thay đổi bệnh lý do vi-rút gây

ra dẫn đến giảm giá trị thương mại của nho Năng suất giảm khi cây bị nhiễm vi-rút

Hình 2.2 Mẫu cây nho nhiễm bệnh xoăn lá.

GLRaV tùy thuộc vào giống nho, gốc ghép, sự hiện diện của nhiễm trùng hỗn hợp vàđiều kiện khí hậu và đất đai, dao động từ 15% đến 40%

Tác động kinh tế của GLD vẫn chưa được hiểu rõ cũng như tác động của các chiếnlược kiểm soát khác nhau Một nghiên cứu gần đây của Atallah và ctv (2012) ước tính tácđộng kinh tế của GLD dao động từ 25.000 USD đến 40.000 USD mỗi ha đối với nhữngvườn nho có tuổi thọ 25 năm

Liên quan đến những tác động tiêu cực được mô tả ở trên, virus liên quan đến bệnhxoăn lá nho được Tổ chức Bảo vệ Thực vật Châu Âu và Địa Trung Hải (EPPO) đưa vàodanh sách các tác nhân gây bệnh cho nho được kiểm soát

2.3.4 Biện pháp phòng ngừa và quản lý bệnh

Bất kỳ vật liệu thực vật nào dùng để nhân giống, ghép hoặc trồng phải đến từ câygiống đã được kiểm tra vi rút hoặc vườn ươm được chứng nhận Tránh sử dụng chồi hoặccành giâm không rõ tình trạng sức khỏe hoặc từ những nơi đã phát hiện bệnh cuộn lánho. 

Làm quen với các triệu chứng bệnh cuộn lá nho và theo dõi những cây nho có biểuhiện kiểu phát triển bất thường Gắn cờ những cây nho đáng ngờ để kiểm tra tình trạngsức khỏe của chúng và theo dõi sự lây lan của bệnh Mặc dù không phải tất cả các loạivirus liên quan đến cuộn lá nho đều được biết là lây lan qua côn trùng, nhưng nên quansát cẩn thận và chặt chẽ các dây leo để tìm rệp sáp và côn trùng vảy hoặc các dấu hiệu về

sự hiện diện của chúng, chẳng hạn như dịch ngọt dính (tiết ra dưới dạng chất thải), kiến(bảo vệ rệp sáp để lấy dịch ngọt) và nấm mốc (nấm mọc trên dịch ngọt)

Việc xét nghiệm không chỉ nên được thực hiện khi nghi ngờ có bệnh mà còn khikhông xác định được tình trạng sức khỏe của vườn nho hoặc thường xuyên như một phầncủa ngân sách quản lý vườn nho Số lượng mẫu cần xét nghiệm sẽ tùy thuộc vào mụcđích xét nghiệm (tức là chẩn đoán hoặc sàng lọc)

Khi nghi ngờ có bệnh, lấy mẫu trực tiếp từ cây có triệu chứng Thử nghiệm là mộtphần của kế hoạch quản lý bệnh tổng hợp, khuyến nghị tạo một mẫu tổng hợp từ 5 câynho cho mỗi 1.000 cây nho trong một khu vườn nho Khi các triệu chứng trên lá biểu hiện

rõ ràng, việc loại trừ các bệnh khác trước tiên có thể rất hữu ích trong việc giảm chi phíkiểm tra và quản lý

Không thể kiểm soát virus bằng cách sử dụng thuốc trừ sâu Tuy nhiên, trong trườnghợp có côn trùng, việc kiểm soát bằng hóa chất có thể được sử dụng để kiểm soát quần

thể côn trùng Việc phun dầu hoặc thuốc trừ sâu không hoạt động muộn có thể làm giảmrệp sáp và côn trùng gây bệnh qua mùa đông Vào cuối vụ, việc phun thuốc trừ sâu nhắmvào rệp sáp phải đảm bảo phun vào các kẽ hở trên tán và vỏ cây Thuốc trừ sâu toàn thânnhiều khả năng có hiệu quả chống lại côn trùng ở những vị trí khó tiếp cận này.

2.4 Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thực vật

Kỹ thuật Sắc ký miễn dịch dòng chảy (Lateral Flow Assay) đã trở thành một công cụquan trọng trong chẩn đoán bệnh thực vật, giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác cáctác nhân gây bệnh LFA hoạt động dựa trên nguyên lý dòng chảy của dung dịch quamàng thử chứa các chất phản ứng, với sự tham gia của kháng thể hoặc kháng nguyên đặchiệu LFA (Lateral Flow Assay) là khái niệm chung bao quát các kỹ thuật này, trong khiLFIA (Lateral Flow Immunoassay) là một nhánh đặc biệt của LFA, chuyên sâu vào ứngdụng trong chẩn đoán bệnh thực vật Các kỹ thuật SHPT, đặc biệt là LFIA, được sử dụng

để phát hiện các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm hoặc ký sinh trùng trongthực vật, mang lại ưu điểm về độ nhạy và tính dễ sử dụng

Ngoài LFA, các kỹ thuật khác như PCR (Polymerase Chain Reaction) hay ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) cũng được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoánbệnh thực vật Tuy nhiên, LFA và LFIA có những lợi thế vượt trội về tính đơn giản,nhanh chóng, không yêu cầu thiết bị phức tạp, giúp nông dân và nhà nghiên cứu dễ dàngthực hiện tại hiện trường mà không cần đến phòng thí nghiệm chuyên sâu

2.5 Lateral Flow Immunoassay

2.5.1 Lịch sử phát triển

Năm 1956, cơ sở kỹ thuật của xét nghiệm miễn dịch dòng chảy bên được bắt nguồn

từ xét nghiệm ngưng kết latex, xét nghiệm đầu tiên được phát triển bởi Plotz và Singer.Năm 1950, Berson và Yalow phát minh máy xét nghiệm miễn dịch vô tuyến (RIA)đầu Sau đó vào năm 1960, xét nghiệm miễn dịch enzyme (EIA) được giới thiệu và manglại những ưu điểm đáng kể

Các nguyên tắc cơ bản của công nghệ dòng chảy bên tiếp tục được tinh chỉnh chođến đầu những năm 1980 và được thiết lập vững chắc trong những năm cuối của thập kỷ

đó, với việc nộp một số bằng sáng chế lớn về định dạng công nghệ này bởi các công tynhư Becton Dickinson & Co và Unilever và Carter Wallace

Ứng dụng thử nghiệm cụ thể này đã đạt được những bước tiến lớn trong những năm

1970, nhờ những cải tiến trong công nghệ tạo kháng thể và những hiểu biết đáng kể về