Nhóm 1 st3 sắc ký

LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU .... Thành phần hóa học Các đặc tính của nguyên liệu thực vật thu được từ Chromolaena odorata gồm các hợp chất này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NHÓM 1 SÁNG THỨ 3 : 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 11/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên

TS TRỊNH THỊ PHI LY HUỲNH TẤN AN

NGUYỄN LAN ANH NGUYỄN THỊ LAN ANH HUỲNH THỊ DIỆU

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

Thí nghiệm 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Giới thiệu chung 1

1.1.1 Tổng quan về cây cỏ lào 1

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3

1.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

1.2.2 Vật liệu 3

1.2.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 4

1.2.4 Phương pháp nghiên c ứu 4

1.3 Kết quả và thảo luận 7

1.3.1 Xác định dung môi ly trích 7

1.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu 8

Thí nghiệm 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT .10

2.1 Giới thiệu chung 10

2.1.1 Sắc ký cột (Column Chromatography) 10

2.1.2 Sắc tố thực vật 10

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

2.2.2 Vật liệu 11

2.2.3 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ 11

2.2.4 Phương pháp nghiên c ứu 11

ii

2.2.5 Đưa mẫu vào cột 12

2.2.6 Rửa giải 13

2.3 Kết quả và thảo luận 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

3.1 Giới thiệu chung 15

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2.2 Vật liệu 15

3.2.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 15

3.2.1 Phương pháp nghiên c ứu 15

3.3 Kết quả và thảo luận 166

Bài tập Xác định nồng độ 1 số hợp chất có trong chiết xuất quả cafe đã phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo – cột C18 18

4.1 Kết quả 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 7

Bảng 4.1 .19

Bảng 4.2 .19

Bảng 4.3 .20

Bảng 4.4 .21

v

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 1

Hình 1.2 4

Hình 1.3 5

Hình 1.4 5

Hình 1.5 5

Hình 1.6 6

Hình 1.7 6

Hình 1.8 7

Hình 2.1 11

Hình 2.2 11

Hình 2.3 11

Hình 2.4 .12

Hình 2.5 .12

Hình 2.6 .13

Hình 2.7 .14

Hình 3.1 .17

Hình 3.2 .17

Hình 4.1 .18

Hình 4.2 .19

Hình 4.3 .20

Hình 4.4 .20

Hình 4.5 .21

1

Thí nghiệm 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1.1 Giới thiệu chung

1.1.1 Tổng quan về cây cỏ lào

1.1.1.1 Giới thiệu chung

Cỏ lào (Chromolaena odorata), thuộc họ Cúc (Asteraceae), là một loài thực vật

thân thảo đa niên có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ Hiện nay, loài này đã lan rộng đến các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, trong đó có Đông Nam Á, châu Phi, và các đảo Thái Bình Dương Với khả năng sinh trưởng nhanh và tính xâm lấn mạnh, cỏ lào được coi là một trong những loài thực vật xâm lấn nguy hiểm nhất trên thế giới

Hình 1.1 Lá và hoa của Chromolaena odorata (a) kiểu sinh học Nam Phi (b) kiểu sinh

học châu Á / Tây Phi Michael Hickman (Hlem, Nam Phi)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Về mặt hình thái, Chromolaena odorata là một loại cây bụi có thân thẳng và giòn,

có nhiều nhánh và khả năng phát triển chiều cao lên tới 2-3 m Cây có lá có hình dạng như đầu mũi tên (lần lượt là 6-12 cm và 3-7 cm chiều dài và chiều rộng) với mặt phủ lông mịn Hơn nữa, các lá trên thân và cành được sắp xếp theo cặp đối diện, với khoảng

15 -25 bông hoa có màu sắc từ xanh, hồng, trắng hoặc tím Hạt có màu đen, xám hoặc nâu với pappus nâu nhạt dài 5-6 mm, trong khi rễ xơ và hẹp có thể đạt tới 0,3 km vào

2

đất Tuy nhiên, các biến thể có thể được quan sát thấy về hình dạng lá, màu hoa, mùi hương lá và kiến trúc tổng thể của cây tùy thuộc vào thảm thực vật mà nó phát triển

1.1.1.3 Phân bố và sinh thái

Cỏ lào ưa các vùng đất trống, nghèo dinh dưỡng, hoặc các khu vực bị can thiệp như đất hoang hóa, bìa rừng, và ven đường Cây phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1200–2500 mm Một đặc điểm sinh thái đáng chú ý của loài này là khả năng sinh trưởng nhanh và phát tán rộng thông qua hạt và thân rễ

1.1.1.4 Thành phần hóa học

Các đặc tính của nguyên liệu thực vật thu được từ Chromolaena odorata gồm

các hợp chất này bao gồm các axit phenolic như axit protocatechuic, axit ferulic, axit vanillic, và hỗn hợp các aglycone flavonoid như sinensetin, rhamnetin, tamarixetin,

kaempferide, được xác định trong các phần cột của chiết xuất ethanol từ lá C odorata

Ngoài ra, tinh dầu chưng cất thủy lực từ rễ cây chứa các thành phần hoạt tính sinh học, chủ yếu bao gồm himachalol (một sesquiterpene), 7-isopropyl-1,4-dimethyl-2-azulenol, androencecalinol và 2-methoxy-6-(1-methoxy-2-propenyl) naphthalene Ngoài ra, các hợp chất như acacetin, luteolin, isosakuranetin, persicogenin, 5,6,7,4′-tetramethoxyflavanone, 4′-hydroxy-5,6,7-trimethoxyflavanone, và một số chalcones khác đã được phân lập từ chiết xuất dichloromethane của hoa cây này

Các nghiên cứu đã phát hiện trong cỏ lào nhiều hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm:

Flavonoid: Có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm

Mặc dù nổi tiếng là một loại cỏ dại xâm lấn, theo truyền thống, C odorata có giá

trị cho các tính chất dược liệu khác nhau Các chuyên gia y tế địa phương sử dụng cây

để điều trị kiết lỵ, nhức đầu, đau răng, tiêu chảy, các vấn đề về dạ dày, nhiễm nấm, ho, nhiễm trùng da và vết thương Mặc dù một số cách sử dụng văn hóa dân gian này chưa được xác minh một cách khoa học, nhưng bằng chứng dược lý có sẵn cho thấy cây sở

b Trong nông nghiệp:

Cỏ lào được sử dụng làm phân xanh, cải tạo đất và bổ sung chất hữu cơ

Cây có khả năng bảo vệ đất chống xói mòn và phục hồi đất hoang hóa nhờ tốc

độ sinh trưởng nhanh

c Trong nghiên cứu môi trường:

Các nghiên cứu đang khai thác khả năng của cỏ lào trong xử lý ô nhiễm, như hấp phụ kim loại nặng hoặc cải tạo đất bị thoái hóa

1.1.1.5 Mặt tiêu cực

Cỏ lào là một trong những loài thực vật xâm lấn nguy hiểm, cạnh tranh trực tiếp với các loài bản địa, làm suy giảm đa dạng sinh học và ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất nông nghiệp Việc kiểm soát cỏ lào đòi hỏi các biện pháp quản lý tích hợp, bao gồm

cơ học (nhổ bỏ), hóa học (sử dụng thuốc diệt cỏ), và sinh học (sử dụng thiên địch)

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm 304 - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

1.2.2 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu: Bột cây cỏ lào

4

Hình 1.2 Bột cỏ lào

1.2.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Hóa chất: Hexan, ethanol

Thiết bị: tủ sấy, cân điện tử, máy siêu âm đồng nhất selecta Tây Ban Nha (Tần số: 40 KHz, công suất điện: 250W) …

Dụng cụ: Bình tam giác, giấy lọc, pipet Pasteur, cốc thủy tinh,

1.2.4 Phương pháp nghiên cứu

1.2.4.1 Ly trích chất chiết thô trong nguyên liệu

Quá trình trích ly là quá trình khuếch tán cấu tử của hợp chất từ nguyên liệu vào dung môi Dung môi thấm qua màng tế bào dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm làm hòa tan các hợp chất vào trong dung môi Hiện tượng thẩm thấu xảy ra đến khi đạt cân bằng

Dung môi thường dùng trong quá trình này là nước, ether dầu hỏa, hexan, ethylic ether, chloroform, dichlorometane, ethanol…

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô (hiệu suất chiết cao)

Phương pháp chiết: chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm (hóa lý)

Dung môi: Hexan, ethanol

Nguyên liệu: bột cây cỏ lào

Điều kiện chiết: sóng siêu âm (40 KHz, 250W), nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút (15 phút x2 lần)

Quy trình thực hiện

Bước 1: cân 1 g bột nguyên liệu vào erlen, sau đó thêm 15 ml dung môi để làm thấm ướt nguyên liệu

5

Hình 1.3 Chiết thô bột cỏ lào bằng hai loại dung dịch ethanol và

hexan (a) Cân 1 g nguyên liệu, (b) Ngâm nguyên liệu trong dung môi

Bước 2: tiến hành siêu âm trong 15 phút, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc đã biết trước khối lượng

Hình 1.4 Đánh sóng siêu âm dịch chiết (a) Mẫu được đánh sóng

siêu âm; (b) Máy siêu âm

Bước 3: tiếp tục thêm 15 ml dung môi vào bã để chiết lần hai, cũng trong 15 phút

Hình 1.5 Chiết thô bột cỏ lào bằng hai loại dung dịch

ethanol và hexan (a) Chiết lần 1, (b) Chiết lần 2.

Bước 4: sau khi chiết, lọc toàn bộ bã qua giấy lọc Đem sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy, sau đó cân để xác định khối lượng bã còn lại

a)

a)

b)

b)

6

Hình 1.6 Mẫu bã sau khi lọc

Hàm lượng chất chiết thô (%) được tính bằng công thức:

H (%) = 100 × m1 - m2

m1Trong đó, m1 là khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g) và m2 là khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

1.2.4.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm nguyên liệu là tỷ lệ phần trăm nước có trong hỗn hợp nguyên liệu Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy xác định sự chênh lệch về khối lượng của nguyên liệu trước và sau khi sấy

Độ ẩm của bột lá khế được xác định dựa vào khối lượng của nguyên liệu trước khi sấy và sau khi sấy

Mục đích: đánh giá độ ẩm nguyên liệu bột cỏ lào trong quá trình bảo quản Phương pháp khối lượng: Xác định bằng phương pháp sấy

Nguyên liệu: bột cây cỏ lào

1.3 Kết quả và thảo luận

1.3.1 Xác định dung môi ly trích

Hiệu suất chiết và khối lượng nguyên vật liệu ly trích (Bảng 1.1.) cho biết phần

trăm chất tan đã được tách ra khỏi nguyên liệu ban đầu và chuyển vào dung môi

Bảng 1.1 Khối lượng vật liệu qua các lần cân

Dung môi sử dụng m 1 (g) ban đầu (g) Giấy lọc Bã và giấy lọc sau sấy (g) H (%)

Hiệu suất chiết của bột cỏ lào khi sử dụng dung môi ethanol là:

Từ kết quả Bảng 1.1 cho thấy hiệu suất chiết của dung môi ethanol cho hiệu suất

chiết cao hơn (19,2842%) so với dung môi hexan (14,2129%) do sự khác biệt về độ phân cực Điều này cho thấy dung môi ethanol có khả năng chiết xuất các hợp chất trong mẫu hiệu quả hơn so với hexan Ethanol là dung môi phân cực tốt và được ưu tiên khi mục tiêu là chiết xuất các hợp chất có giá trị sinh học đặc biệt là các hợp chất phân cực như polyphenol, flavonoid hoặc các hợp chất chứa nhóm chức phân cực (hydroxyl, ) nhờ hiệu suất cao và khả năng chiết tốt Trong khi đó, dung môi hexan không phân cực

và hòa tan tốt trong các hợp chất không phân cực Vì vậy, khi tiến hành nghiên cứu cần xác định được thành phần mục tiêu và lựa chọn dung môi tối ưu để tăng hiệu quả của quy trình chiết xuất, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng

Kết quả tính toán cho thấy độ ẩm của mẫu sau khi sấy không có sự thay đổi đáng

kể giữa lần 1 và lần 2, với giá trị lần lượt là 12,33% và 12,45%, thấp hơn so với tiêu

9

chuẩn TCVN 10788:2015 quy định độ ẩm dược liệu là 13% Sau hai lần sấy, độ ẩm của

mẫu vẫn giữ ở mức thấp và không thay đổi nhiều, chứng tỏ rằng quá trình tiền xử lý

mẫu cỏ lào bằng phương pháp sấy đã gần như loại bỏ hết lượng nước trong mẫu Sau

một số lần sấy, mẫu không còn nước dễ bay hơi, và độ ẩm chỉ thay đổi rất ít Điều này

cho thấy quá trình sấy đã diễn ra hiệu quả

Điều này cho thấy mẫu đã gần như đạt đến độ khô ổn định sau hai lần sấy

Sắc ký cột là một phương pháp phân tách các hợp chất trong một mẫu dựa trên

sự khác biệt về độ tương tác của chúng với pha tĩnh (chất hấp phụ trong cột) và pha động (dung môi)

Nguyên tắc sử dụng sắc ký cột:

Sắc kí cột được tiến hành dựa trên nguyên tắc tính phân cực

Phân chia hỗn hợp các chất thành 2 pha là pha động và pha tĩnh để sắc ký Pha tĩnh là chất hấp thụ – các chất phổ biến sử dụng làm pha tĩnh là oxit nhôm, silicagel, CaCO3,

Pha động là dung môi rửa cột, chảy qua chất hấp thụ

Ứng dụng của sắc ký cột rất đa dạng và bao gồm các lĩnh vực như hóa học, dược học, thực phẩm, môi trường, công nghiệp, và nghiên cứu sinh học Phương pháp này là công cụ quan trọng trong việc phân tách, tinh chế, và phân tích các hợp chất hóa học và sinh học có mặt trong các mẫu phức tạp

2.1.2 Sắc tố thực vật

Trong thực vật, có một loạt các sắc tố (pigment) tham gia vào các quá trình sinh

lý quan trọng Các sắc tố trong thực vật có thể được chia thành nhiều nhóm chính, bao gồm chlorophyll (diệp lục), carotenoid, flavonoid, và anthocyanin Mỗi nhóm sắc tố này

có màu sắc và chức năng khác nhau

Chlorophyll (Diệp lục: Chlorophyll a, Chlorophyll b): Màu xanh lá cây, giúp quang hợp

Carotenoid: Màu cam, vàng, đỏ, bảo vệ cây khỏi tổn thương do ánh sáng

Flavonoid: Màu vàng, vàng cam, hồng, có tác dụng chống oxy hóa

Anthocyanin: Màu đỏ, tím, xanh lam, chịu trách nhiệm tạo màu sắc cho hoa và trái cây

Betalain: Màu đỏ và vàng, xuất hiện trong củ dền và một số loài thực vật khác Phycoerythrin: Màu đỏ, có trong tảo đỏ, giúp hấp thụ ánh sáng

11

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm 305 - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Hexane, Acetone, Silicagel

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu

12

Cân 2 lần: lần 1: 0,7516 g; lần 2:0,7518 g silica gel 60 (kích thước hạt 0,015 – 0,040 mm) vào cốc thủy tinh khô, thêm vào 10 ml hexan ngâm trong 5-10 phút (nhồi cột ướt)

tinh

2.2.5 Đưa mẫu vào cột

Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1 mm, thêm khoảng 1 mL hỗn hợp sắc tố vào cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt pha tĩnh

a

b

c

13

Tiếp tục cho pha động là n-hexane qua cột, tránh để cột khô

Sau đó để cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây

Hình 2.6 Sắc tố phân

tách trong cột sắc kí bằng pipet Pasteur a) chloropyll b; b) chloropyll a; c) carotenoid

2.3 Kết quả và thảo luận

Thu được 2 sắc tố có sự khác biệt rõ rệt về màu sắc là catotenoid và diệp lục Catotenoid thu trước được rửa giải bằng dung môi n – hexane

c

b

a

14

Diệp lục thu sau được rửa giả bằng dung môi 70% n-hexan+ 30% aceton

Hình 2.7 Sắc tố thu được 2 loại

chính a) carotenoid; b) diệp lục

Trong sắc ký cột, carotenoid (caroten) thu trước diệp lục (chlorophyll) chủ yếu

là do sự khác biệt về tính chất hóa lý của các sắc tố này, đặc biệt là về độ tan trong dung môi và khả năng tương tác với pha tĩnh (solid phase)

Những nguyên nhân carotenoid thu trước (tách ra trước) so với diệp lục trong quá trình sắc ký cột do sự khác biệt về độ tan trong dung môi và tính tương tác với pha tĩnh

Carotenoids là các sắc tố không phân cực (hoặc ít phân cực), thường có cấu trúc phân tử chứa nhiều liên kết đôi, không chứa nhóm chức có độ phân cực cao (như nhóm hydroxyl hoặc nhóm carboxyl) Do đó, carotenoids dễ hòa tan trong các dung môi hữu

cơ không phân cực như hexane Diệp lục (chlorophyll) lại là sắc tố có tính phân cực hơn

do chứa các nhóm chức hydroxyl (-OH) trong cấu trúc của nó Diệp lục dễ hòa tan trong dung môi có tính phân cực hơn như acetone Do đó, khi sử dụng dung môi phân cực thấp hoặc dung môi hữu cơ ít phân cực (như hexane hoặc chloroform) trong sắc ký cột, carotenoids sẽ di chuyển nhanh hơn và tách ra khỏi cột trước diệp lục, vì chúng dễ dàng hòa tan và tương tác với pha động (dung môi)

Pha tĩnh trong sắc ký cột có thể là các chất như silica gel có bề mặt phân cực Diệp lục có tính phân cực cao hơn carotenoids, nên nó sẽ có xu hướng tương tác mạnh

mẽ hơn với pha tĩnh Carotenoids, với tính chất ít phân cực hơn, tương tác yếu hơn với pha tĩnh và do đó di chuyển nhanh hơn trong cột sắc ký Khi các sắc tố đi qua cột sắc

ký, những sắc tố tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ bị giữ lại và tách ra muộn hơn, trong khi những sắc tố ít tương tác sẽ di chuyển nhanh hơn và tách ra đầu tiên