Nhóm 8 thứ 4 ca chiều

steartii đã được sử dụng để nghiên cứu một loạt các quá trình trong sinh lý vi khuẩn bao gồm cảm biến số đại biểu, sản xuất sắc tố vikhuẩn, enzyme endglucanase, và thu nhận sắt qua trung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN THỰC VẬT

TP Thủ Đức, 11/2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Cây mít 2

2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii 3

2.3 Bệnh đen xơ mít 3

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn 4

2.4.1 Kỹ thuật PCR 4

2.4.2 Kỹ thuật điện di 8

2.5 Trình tự đặc trưng 16S rRNA của vi khuẩn 9

2.5.1 Chức năng của 16S rRNA 9

2.5.2 Ứng dụng của 16S rRNA 10

2.5.3 Phản ứng PCR 16S rRNA 10

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

3.2 Vật liệu 11

3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3.1 Ly trích DNA tổng số 11

3.3.2 Điện di DNA tổng số 13

3.3.3 PCR 16S rRNA 13

3.3.4 PCR với primer tự thiết kế 14

3.3.5 PCR với primer tham khảo bài báo khoa học 16

4.1 Kết quả 18

4.1.1 Kết quả điện di DNA tổng số 18

4.1.2 Kết quả PCR 16S rRNA 19

4.1.3 Kết quả PCR với cặp primer tự thiết kế 20

4.1.4 Kết quả PCR với cặp primer tham khảo từ bài báo khoa học .21

4.2 Thảo luận 21

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 23

5.1 Kết luận 23

5.2 Đề nghị 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR 16S 13 Bảng 3.2 Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR 16S (tiếp theo) 14 Bảng 3.3 Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR với mồi tự thiết kế

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh cây mít 2

Hình 2.2 Tế bào P stewartii đơn lẻ ở độ phóng đại cao 3

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh đen xơ mít 4

Hình 2.4 Kary Mullis nhìn thấy PCR trong một cảnh mộng (giấc mơ) 7

Hình 2.5 Mô hình mô phỏng một hệ thống điện di 8

Hình 2.6 Minh họa các vùng biến đổi khác nhau 10

Hình 3.2 Hỗn hợp dung dịch tách thành 3 lớp sau khi ly tâm 12

Hình 3.1 Sinh khối vi khuẩn sau 3 lần thực hiện 12

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di DNA tổng số 18

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer cho vùng trình tự 16s rRNA 19

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp primer đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii được thiết kể bởi phòng lab RIBE 304 20

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp primer đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii được tham khảo từ bài báo khoa học 21

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Mít là loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, có khả năng thíchnghi rộng, dễ trồng, chăm sóc nên được trồng ở nhiều nơi như TiềnGiang, Hậu Giang, Long An, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh…Hiện nay, trồng mít cho thu hoạch sớm, năng suất cao, đem lại lợinhuận khá lớn vì trái mít bên cạnh tiêu thụ trong nước còn được xuấtkhẩu đi nhiều nơi trên thế giới nên được nông dân ưa chuộng Songthời gian gần đây, bệnh đen xơ đã xuất hiện và gây hại nghiêm trọng

ở hầu hết các vùng trồng mít, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng pháttriển, giảm năng suất, đặc biệt làm giảm giá trị thương phẩm và chấtlượng của trái mít Chính vì thế việc phát triển những phương phápchẩn đoán bệnh chính xác hiệu quả hơn so với chẩn đoán bệnh truyềnthống đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay

1.2 Mục tiêu của đề tài: Khuếch đại các đoạn DNA có chọn lọc

bằng các đoạn mồi đặc hiệu cho vi khuẩn gây đen xơ mít Nắm đượcquy trình chẩn đoán bệnh đen xơ mít thông qua kỹ thuật PCR xác định

sự có mặt của vi khuẩn Pantoea stewartii.

1.3 Nội dung thực hiện: Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn từ mẫu

bệnh phẩm, định tính và bán định lượng DNA bằng điện di tổng số,kiểm tra sự có mặt của DNA vi khuẩn bằng PCR 16S rRNA, và kiểm

tra sự có mặt của DNA vi khuẩn Pantoea stewartii bằng kỹ thuật PCR

với cặp primer đặc hiệu

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây mít

Cây mít (Artocarpus heterophyllus Lam., thuộc họ Dâu tằm

Moraceae) cùng với các chi Ficus, Morus và Machurapamifera thuộc

bộ Gai (Urticales) còn gọi là bộ Tầm ma Có dạng cây gỗ cao 12 - 20m

Lá hình trái xoan nguyên hay chia thùy về một phía Cụm hoa ở trênthân hoặc trên cành già Cụm hoa đực dài, ráp có lông tơ mềm; cụmhoa cái hình bầu dục, gồm nhiều hoa; bao hoa hình trụ tù, mềm, rấthẹp ở đỉnh Quả to hình trái xoan hay thuôn, dài tới 60cm và nặng 20 -30kg Cây Mít là loại cây ăn quả lớn nhất trong các loại cây do conngười đã thuần hóa, quả Mít đạt khối lượng lên tới 50 kg và chiều dài

60 - 90 cm Năng suất trung bình từ 50 - 80 tấn quả/ha đất trồng(APAARI, 2012) Có nguồn gốc phía Tây Nam Ấn Độ, Đông Nam Á, vàvùng nhiệt đới Châu Phi (Love và Paull, 2011) Những phát hiện khảo

cổ học cho rằng mít được trồng cách đây 3.000 – 6.000 năm Tại ViệtNam, mít được trồng rộng rãi từ Bắc vào Nam, trừ những vùng caomiền Bắc Cả nước có khoảng 10.300 ha trồng mít với sản lượng109.600 tấn (Hoàng Quốc Tuấn, 2011) Chỉ riêng miền Đông Nam Bộ

có khoảng 4.620 ha diện tích trồng mít nhưng còn nhỏ lẻ (Nguyễn An

2.2 Vi khuẩn Pantoea stewartii

Pantoea stewartii là một loài vi khuẩn gây bệnh thực vật

gây bệnh héo Stewart trên ngô, bệnh đen xơ mít, cũng như bệnh héovàng mít, bệnh héo lá do vi khuẩn ở mía, và bệnh bạc lá ở

lúa. P.stewartii là một loại vi khuẩn gram âm trong Enterobacterales , một nhóm cũng bao gồm Escherichia coli và một số mầm bệnh khác

ở người, động vật và thực vật.  Hầu hết các nghiên cứu về mầm bệnh

vi khuẩn này cho đến nay đều được thực hiện trên các chủng lâynhiễm trên ngô vì các bệnh khác đã được xác định gần đây hơn. Do

tương đối dễ sử dụng trong nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, P steartii đã được sử dụng để nghiên cứu một loạt các quá trình trong

sinh lý vi khuẩn bao gồm cảm biến số đại biểu, sản xuất sắc tố vikhuẩn, enzyme endglucanase, và thu nhận sắt qua trunggian siderophore

xuất hiện vào mua mưa, và trái bị dị dạng, méo mó thì tỷ lệ xơ đen caonhưng trong thực tế những trái mít cân đối và đẹp vẫn bị xơ đen.Đồng thời, mưa nhiều và cây bị thiếu dinh dưỡng cũng có thể gâybệnh xơ đen (Le, 2015) Tuy nhiên, trong thực tế bệnh đen xơ mít vẫnxảy ra trên cả vùng giàu dịnh dưỡng khu vực Đông Nam Bộ và TâyNguyên (Cục bảo vệ thực vật 2021) Năm 2017, trên cây mít Thái, Le

và cộng sự nhận thấy bệnh đen xơ mít do vi khuẩn gây ra, nếu sử dụng

ly nhựa bao quanh hoa cái hoặc sử dụng miếng nylon làm mái chenước mưa lúc hoa cái chưa nhận phấn có thể làm giảm đáng kể bệnh

xơ đen Bên cạnh đó, theo Nguyen năm 2018, vệt đen xuất hiện có thể

là do vi khuẩn xâm nhập vào hoa cái nhờ nước mưa Nước mưa là yếu

tố để vi khuẩn lây lan và xâm nhiễm bên trong hoa cái Khi gặp nướcmưa, vi khuẩn đi vào của ngỏ là nướm, đi vào vòi nhụy và đến bầunoãn làm cho múi không thụ tinh và hột bị lép Con đường thứ hai là vikhuẩn xâm nhập qua khẽ hỡ giữa các múi mít Theo Gapasin và cộng

sự năm 2014, bệnh đen xơ mít này được ghi nhận lần đầu tiên tại Nam

và Trung Mỹ năm 2011, sau đó là các nước như Philippines, Mexico,Malaysia cũng lần lượt công bố sự xuất hiện và gây hại của bệnh

Bệnh đen xơ mít do loài vi khuẩn Pantoea stewartii gây ra Theo Vo và công sự năm 2023, tổng quan về Pantoea stewartii như sau, là loại vi

khuẩn Gram âm, không di động, hình que ngắn, có màu vàng hoặctrắng, catalase dương tính, thủy phân gelatin và tinh bột nhưngkhông thủy phân tween 80, tạo acid từ glucose, sucrose và lactose vàkhông phản ứng mẫn cảm với cây thuốc lá

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh đen xơ mít.

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn

2.4.1 Kỹ thuật PCR

Trong số tất cả những tiến bộ về kỹ thuật trong sinh học phân tửhiện đại, Polymerase Chain Reaction (PCR) là một trong nhữngphương pháp hữu ích nhất PCR cung cấp một phương tiện khuếchđại các trình tự DNA riêng biệt, bắt đầu với lượng DNA cực kỳ nhỏ vàtạo ra lượng lớn các bản sao đủ lớn để phân tích Thật vậy, PCR đủnhạy để khuếch đại DNA từ một tế bào đơn lẻ để thu được số lượng đủ

để phân tích PCR cũng có thể thêm hoặc xóa và sửa đổi DNA Mặc dùPCR đòi hỏi phải có kiến thức trước về thông tin trình tự đích, nhưngnhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để khắc phục hạnchế này Không có gì đáng ngạc nhiên, PCR đã tìm thấy các ứng dụngtrong mọi lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học, cả cơ bảnlẫn ứng dụng Chúng bao gồm phân tích và thao tác DNA, xây dựngthực vật và động vật chuyển gen, khoa học pháp y, chẩn đoán y tế,liệu pháp gen và phân tích môi trường PCR cũng đã được sửa đổi đểxác định lượng mRNA được tìm thấy trong các mô hoặc sinh vật khácnhau, điều này giúp hiểu rõ hơn về môi trường tế bào và những gennào đang được biểu hiện để thích ứng với những thay đổi trong sinhvật PCR đã cách mạng hóa sinh học vì khả năng lấy một lượng DNA

vô cùng nhỏ và khuếch đại nó thành số lượng có thể phân tích được.Trước đây, cách duy nhất để khuếch đại DNA là sử dụng vi khuẩn đểtạo ra nhiều bản sao hơn Quá trình tốn thời gian này bao gồm việcchuyển một đoạn DNA thành một plasmid hoặc vectơ khác, biến đổiDNA kết hợp thành tế bào vi khuẩn, nuôi cấy một lượng lớn vi khuẩn

và tinh chế đoạn DNA từ vi khuẩn một lần nữa PCR cho phép tạo ranhanh chóng một lượng lớn các trình tự DNA cụ thể, dễ dàng tinh chếhơn mà không cần chuyển DNA vào vi khuẩn để tạo bản sao Đúng

như tên gọi, DNA polymerase được sử dụng để sản xuất bản sao DNA

sử dụng phân tử DNA có sẵn Mỗi DNA mới được tổng hợp sẽ trởthành khuôn mẫu để tạo ra nhiều DNA hơn, từ đó tạo ra phản ứng dâychuyền tạo ra DNA sao chép theo cấp số nhân PCR điển hình thực sựchỉ khuếch đại một vùng hoặc chuỗi mục tiêu đã chọn trong mẫu DNAphức hợp được xác định bởi hai đoạn DNA chuỗi đơn nhỏ gọi là mồiPCR Mồi PCR là chìa khóa để chỉ khuếch đại trình tự mục tiêu xácđịnh từ một mẫu phức tạp, thậm chí phức tạp như mẫu DNA phân lập

từ đất hoặc nước có thể chứa hàng triệu gen khác nhau Các đoạnDNA từ vi khuẩn và các sinh vật khác sống trong môi trường này Vìtrình tự mồi PCR phải bổ sung cho điểm bắt đầu và điểm kết thúc củatrình tự đích nên cần có một số kiến thức về trình tự của mẫu DNA Vìrất nhiều sinh vật đã được giải mã toàn bộ bộ gen nên thông tin này cóthể dễ dàng thu được Các trình tự chưa biết được xử lý theo nhiềucách khác nhau PCR có thể được tóm tắt như sau Đầu tiên, mẫu DNA

có vùng mục tiêu được tách ra và sau đó được làm nóng cho đến khi

nó trở thành chuỗi đơn Tiếp theo, mồi PCR ủ ở phần đầu và phần cuốicủa vùng mục tiêu Cuối cùng, DNA polymerase tạo ra các bản saocủa vùng mục tiêu Chu trình PCR xem xét chi tiết quy trình, mô tảnhững gì xảy ra ở từng giai đoạn của phản ứng

Bước đầu tiên trong PCR là trộn các thành phần vào ống nghiệm:

1 Phân tử DNA gốc hoặc DNA đích Một lượng nhỏ DNA là đủ.DNA mục tiêu có thể là một phần của mẫu DNA phức tạp, chứa nhiều

bộ gen từ các sinh vật khác nhau, nhưng cũng có thể đơn giản nhưDNA được khuếch đại PCR trước đó

2 Cần có hai đoạn mồi PCR để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA.Đây là những đoạn DNA chuỗi đơn ngắn bổ sung cho các chuỗi ở haiđầu của đoạn DNA mục tiêu Mồi PCR được tạo ra bằng cách tổng hợphóa học DNA

3 DNA polymerase là cần thiết để tạo ra các bản sao DNA PCRbao gồm một số bước nhiệt độ cao nên cần có DNA polymerase chịunhiệt Polymerase chịu nhiệt được phân lập từ vi khuẩn sống trongmôi trường có nhiệt độ lên tới 90°C hoặc cao hơn Taq polymerase từ

Thermus Aquas thường được sử dụng nhiều nhất, nhưng nhiều loài vi

khuẩn ưa nhiệt khác nhau đã mang lại những đặc tính cải tiến để tạo

ra các bản sao của trình tự DNA mục tiêu trong quá trình PCR

4 DNA polymerase cần có nguồn cung cấp nucleotide hoặc khốixây dựng DNA để tạo ra các bản sao DNA mới Chúng được cung cấpdưới dạng deoxynucleoside triphosphates (dNTP)

5 Dung dịch đệm chứa nồng độ ion và dung dịch đệm pH thíchhợp để đảm bảo điều kiện tối ưu

Bước thứ hai của PCR là đặt ống nguyên liệu vào một máy đặc biệt gọi

là máy PCR hoặc máy luân nhiệt, có khả năng thay đổi nhiệt độ củaống phản ứng PCR một cách nhanh chóng và chính xác Máy luânnhiệt luân phiên nhiệt độ từ cao tới 95°C đến thấp nhất là 4°C Thôngthường, phản ứng PCR sẽ được thực hiện trong 20-40 chu kỳ với banhiệt độ khác nhau trong mỗi chu kỳ Mỗi chu kỳ bao gồm nhiệt độbiến tính, nhiệt độ ủ và cuối cùng là nhiệt độ kéo dài/kéo dài

Kary Mullis phát minh ra phương pháp PCR sau một cảnh mộng:

“Khoa học, giống như không có gì khác trong số các tổ chức của nhân loại, phát triển như cỏ dại hàng năm Nghệ thuật tuân theo thời trang tùy tiện, tôn giáo tập trung vào nội tâm và chỉ được thúc đẩy để tự duy trì, luật pháp ngăn cản việc giải phóng chúng ta và bắt chúng ta làm

nô lệ.”_Kary Mullis

Kary Mullis đã đoạt giải Nobel Hóa học năm 1993 nhờ phát triểnPCR PCR là một trong những kỹ thuật hữu ích nhất của sinh học hiệnđại và đã được sử dụng trong hầu hết mọi lĩnh vực sinh học phân tử và

công nghệ sinh học Kary Mullis là một trong những người lập dị thực

sự trong khoa học Ngoài sinh học phân tử, ông còn có đóng góp chocác lĩnh vực khoa học khác Trong khi đang là nghiên cứu sinh tiến sĩ

về lĩnh vực vận chuyển sắt của vi khuẩn, ông đã xuất bản một bài báo

có tựa đề "Ý nghĩa vũ trụ của sự đảo ngược thời gian" [Nature 218:663 (1968)], đề cập đến quan điểm của ông rằng khoảng một nửakhối lượng trong vũ trụ đang chuyển động ngược thời gian KaryMullis đã phát minh ra PCR khi đang làm nhà khoa học cho Tập đoànCetus Ông hình thành ý tưởng này khi đang lái chiếc Honda Civictrên Quốc lộ 128 từ San Francisco đến Mendocino vào tháng 4 năm

1983 Mullis nhớ lại đã nhìn thấy phản ứng chuỗi polymerase rõ ràngnhư thể nó hiện lên trên bảng đen trong đầu ông, với những hình ảnhmàu hồng và xanh lam khủng khiếp Ông dừng lại và bắt đầu viếtnguệch ngoạc Một thành phần cơ bản của PCR là nó khuếch đại DNAbằng cách lặp lại liên tục - giống như các chương trình máy tính màMullis đã tham gia viết vào thời điểm đó Kary Mullis đã được Cetusthưởng 10.000 đô la, người lúc đầu không nhận ra tầm quan trọng củaphát hiện này Sau đó, họ bán công nghệ này cho Roche với giá300.000.000 USD

Hình 2.4 Kary Mullis nhìn

Năm 1999, Kary Mulis lại đề cập đến sự kết nối DNA của máy tính: “

Thật thú vị khi hóa sinh được phát triển cùng với máy tính Nếu máy tính không xuất hiện cùng thời điểm với thời điểm cấu trúc của DNA được phát hiện thì sẽ không có hóa sinh Chúng ta luôn cần máy tính

để xử lý thông tin Nếu không có nó, chúng ta sẽ có rất nhiều căn phòng chứa đầy những tu sĩ để viết ra các trình tự."

Polymerase Chain Reaction được sử dụng như một công cụ phổ biếntrong các phòng chẩn đoán với mục đích để phát hiện hoặc định danhcác vi sinh vật gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm

2.4.2 Kỹ thuật điện di

Hình 2.5 Mô hình mô phỏng một hệ thống điện di.

Phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi nhất trong tất cả cácsinh học phân tử là điện di gel Kỹ thuật này tách và tinh chế các đoạnDNA hoặc RNA cũng như protein Ý tưởng cơ bản của điện di là táchcác phân tử dựa trên điện tích nội tại của chúng Điện tích dương thuhút điện tích âm và đẩy lùi các điện tích dương khác Ngược lại, điệntích âm thu hút điện tích dương và đẩy lùi các điện tích âm khác Haiđiện cực, một dương và một âm, được kết nối với nguồn điện áp cao.Các phân tử tích điện dương di chuyển về phía điện cực âm và cácphân tử tích điện âm di chuyển về phía điện cực dương Vì DNA mangđiện tích âm trên mỗi nhóm phosphate tạo thành xương sống của nó,

nó sẽ di chuyển về phía điện cực dương trong quá trình điện di Một