Nó là một vi khuẩn kỵkhí bắt buộc, có nghĩa là oxy gây độc cho các tế bào của nó, phát triển thích hợp ở 26-28oC.. Độc tố của C.botulinum bản chất là protein, có ái lực với tổ chức thần
GIỚI THIỆU CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Vi khuẩn Clostridium botulinum ( C botulinum )
C botulinum là trực khuẩn Gram dương, hình que, có bào tử Nó là một vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có nghĩa là oxy gây độc cho các tế bào của nó, phát triển thích hợp ở 26- 28oC Tuy nhiên, C botulinum chịu đựng được môi trường có nồng độ oxy thấp do enzyme superoxide dismutase, là một chất bảo vệ chống oxy hóa quan trọng trong hầu hết các tế bào tiếp xúc với oxy C botulinum chỉ có khả năng tạo ra độc tố thần kinh khi ở dạng tạo bào tử, điều này chỉ có thể xảy ra trong môi trường yếm khí Các loài vi khuẩn tạo ra bào tử khi ở trong môi trường sinh trưởng không thuận lợi để duy trì khả năng tồn tại của sinh vật và cho phép tồn tại ở trạng thái không hoạt động cho đến khi bào tử tiếp xúc với điều kiện thuận lợi Vi khuẩn sản xuất ngoại độc tố khi phát triển trong môi trường nuôi cấy kỵ khí hoặc thực phẩm có điều kiện kỵ khí. Độc tố botulinum do C botulinum tạo ra thường được cho là một vũ khí sinh học tiềm năng vì nó mạnh đến mức cần khoảng 75 nanogram để giết một người (LD50 là 1 ng/kg, giả sử một người bình thường nặng ~ 75 kilôgam); 1 kg của độc tố này sẽ đủ để
Hình 1.1 Vi khuẩn C.Botulinum bằng kỹ thuật nhuộm gram ( X 100) giết toàn bộ dân số loài người Để dễ so sánh, một phần tư trọng lượng của một hạt cát điển hình (350 ng) độc tố botulinum sẽ tạo thành liều gây chết người.
C botulinum được chia thành bốn nhóm kiểu hình riêng biệt (I-IV) và cũng được phân loại thành bảy kiểu serotype (AG) dựa trên tính kháng nguyên của độc tố botulinum được tạo ra.
Vi khuẩn C.botulinum có đặc điểm là khả năng sinh độc tố khác nhau tùy vào chủng loại Các chủng tuýp A và B thường có khả năng sinh độc tố cao, còn các tuýp khác có sự thay đổi về khả năng này Độc tố do C.botulinum tiết ra có bản chất là protein, có ái lực với mô thần kinh và tác động lên các tiếp giáp thần kinh cơ, làm ngăn cản sự giải phóng chất dẫn truyền thần kinh acetyl choline từ các đầu tận cùng của các dây thần kinh vận động thuộc hệ cholinergic Ngoài ra, vi khuẩn này còn có kháng nguyên lông và kháng nguyên thân.
Các loại A, B, E và trong một số ít trường hợp là F gây bệnh cho người.
Loại C và D gây bệnh cho chim và động vật có vú.
Loại G, được xác định vào năm 1970, vẫn chưa được xác nhận là nguyên nhân gây bệnh ở người hoặc động vật.
Cho đến đầu những năm 1960, hầu hết tất cả các đợt bùng phát ngộ độc thịt đã được công nhận, trong đó các loại độc tố được xác định là do độc tố loại A hoặc B gây ra và thường liên quan đến việc ăn rau, trái cây và các sản phẩm thịt đóng hộp tại nhà Hầu như tất cả các trường hợp ngộ độc loại E là từ các sản phẩm thủy sinh bị ô nhiễm, có nguồn gốc từ biển hoặc nước ngọt (cá hoặc động vật có vú sống dưới nước) với một số trường hợp được cho là do hải ly Một số lượng hạn chế các đợt bùng phát ngộ độc thịt loại F với một đợt bùng phát bắt nguồn từ thạch thịt nai được chế biến tại nhà.
Vi khuẩn C.botulinum không tìm thấy trong phân người Trong tự nhiên, các bào tử của vi khuẩn C.botulinum phổ biến và có khả năng sống sót cao ở trong đất và bụi, được tìm thấy trong đát vườn, nghĩa trang, bùn, phân động vật tươi hoặc đã ủ, đường tiêu hóa của động vật Vi khuẩn C.botulinum phổ biến trong môi trường nên có thể lây nhiễm qua các khâu sản xuất, vận chuyển, bảo quản và sử dụng thực phẩm Đặc biệt là các lọai thực phẩm đóng hộp như: sữa bột, pho mát, xúc xích, lạp xưởng, thực phẩn lên men yếm khí.
Các thực phẩm đóng hộp thường sử dụng nitric để ức chế độc tố botulinum Các thực phẩm đóng hộp được chế biến thô sơ rất dễ nhiễm khuẩn C botulinum.
Ngoài ra, qua vết thương, nhiễm vi khuẩn C botulinum sẽ tiết độc tố vào máu từ các vết thương hở Trường hợp này phổ biến từ những năm 1990 ở những người nghiện ma túy và tiêm chích heroin vào da.
Một số trường hợp hiếm hoi người được phát hiện bị nhiễm độc tố Botulinum do sử dụng mỹ phẩm chứa Botox không phù hợp.
Bệnh ngộ độc thịt xảy ra khi dùng thức ăn dự trữ, chủ yếu các loại thực phẩm đóng hộp bị nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum hoặc nha bào của chúng.
Khả năng gây bệnh
Bệnh xảy ra do ăn các thực phẩm dự trữ đóng hộp bị nhiễm vi khuẩn C.botulinum hoặc nha bào của chúng Vi khuẩn gặp điều kiện thuận lợi và sản xuất độc tố Khi ăn thực phẩm này vào dạ dày ruột, độc tố không bị phá hủy được hấp thu nhanh vào máu và đến tổ chức của cơ thể.
Triệu chứng
Bệnh xuất hiện nhanh sau 6-48 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc Các triệu chứng điển hình như đau bụng, nôn mửa, nhức đầu choáng váng, nhìn đôi, nói khàn đến mất tiếng, liệt cơ, rối loạn nhịp thở, trường hợp nặng có thể tử vong, các triệu chứng thần kinh do tác động của độc tố lên tổ chức, chúng tác động lên các tiếp nối thần kinh cơ làm ngăn cản sự giải phóng acetyl choline ở các đầu tận cùng hệ thần kinh vận động cholinergic.
Chẩn đoán nhiễm C.botulinum
Chẩn đoán ngộ độc Botulinum dựa trên các tiêu chuẩn: Bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng; kết quả xét nghiệm phát hiện độc tố Botulinum hoặc vi khuẩn C botulinum trong mẫu bệnh phẩm (thực phẩm nghi ngờ, chất nôn, dịch dạ dày, dịch ruột, phân, máu); hoặc bệnh cảnh lâm sàng điển hình và có liên quan về mặt dịch tễ với ca bệnh được chẩn đoán ngộ độc thực phẩm do độc tố Botulinum.
1.4.1 Phương pháp phát hiện độc tố
Phép thử sinh học trên chuột là một phương pháp truyền thống và nhạy cảm để phát hiện độc tố botulinum Mẫu nghi ngờ chứa độc tố được tiêm vào cơ thể chuột và các triệu chứng ngộ độc sẽ được quan sát.
1.4.2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Sử dụng kháng thể để phát hiện sự hiện diện của độc tố botulinum trong mẫu thử.
Phương pháp này nhanh chóng và có độ nhạy cao.
Phát hiện gen mã hóa độc tố botulinum trong mẫu bằng cách khuếch đại các đoạnDNA đặc hiệu của Clostridium botulinum.
Phòng bệnh
Chủ yếu là loại bỏ các thực phẩm nghi ngờ bị nhiễm độc C botulinum, nấu kỹ thức ăn để diệt C.botulinum.
QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU C.BOTULINUM
Vai trò của primer trong phản ứng PCR
Trong phản ứng PCR, primer đóng vai trò thiết yếu trong việc khuếch đại các vùng DNA mục tiêu Primer là những đoạn oligonucleotide ngắn (18-25 nucleotide) có nhiệm vụ xác định vùng DNA cần khuếch đại.
Xác định điểm bắt đầu cho tổng hợp DNA: Primer gắn kết với sợi DNA mẫu tại vị trí cụ thể, đánh dấu điểm bắt đầu cho enzyme DNA polymerase Một cặp primer bao gồm một primer gắn vào sợi đơn DNA theo chiều 5' đến 3' (gọi là forward primer) và một primer gắn vào sợi đơn DNA theo chiều 3' đến 5' (gọi là reverse primer).
Tạo khuôn mẫu cho DNA polymerase: Primer cung cấp đầu mồi cần thiết cho DNA polymerase bắt đầu tổng hợp sợi DNA mới Enzyme này không thể tự bắt đầu tổng hợp DNA từ sợi đơn mà cần một đầu mồi có sẵn để gắn vào.
Primer tăng độ đặc hiệu phản ứng PCR bằng cách chỉ khuếch đại các đoạn DNA có trình tự bổ sung với primer Điều này giúp loại bỏ khuếch đại không mong muốn các đoạn DNA khác Hơn nữa, chiều dài của đoạn DNA khuếch đại được xác định bởi khoảng cách giữa hai primer, cho phép các nhà khoa học kiểm soát kích thước của đoạn DNA mục tiêu bằng cách thiết kế primer một cách chính xác.
Phản ứng PCR gồm ba giai đoạn chính: biến tính (denaturation), gắn kết (annealing) và kéo dài (extension) Primer có vai trò quan trọng nhất ở giai đoạn gắn kết, nơi mà nhiệt độ của phản ứng được giảm xuống để cho phép primer gắn kết chính xác với sợi DNA mục tiêu Sau đó, ở giai đoạn kéo dài, DNA polymerase sử dụng primer làm điểm bắt đầu để tổng hợp sợi DNA mới.
Như vậy, primer không chỉ là "công cụ" khởi đầu cho sự tổng hợp DNA mà còn là yếu tố quyết định đến tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR.
Nguyên tắc thiết kế primer
Độ dài Primer: độ dài tối ưu là khoảng từ 18-25 base.
Nhiệt độ nóng chảy của Tm: rất quan trọng ở pha gắn primer, Tm nên nằm trong khoảng 50-65°C Nhiệt độ Tm của hai primer không chênh lệch nhau quá 2 -5°C.
Công thức tỉnh Tm đơn giản: Tm= 4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) Nhiệt độ gắn primer (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của primer.
Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50-60%.
Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3' của primer để giúp cho đầu 3' của primer liên kết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3' có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3' quá mạnh khiến primer bắt cặp không đặc hiệu.
Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự primer của trình tự đôi (VD:
ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG) Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một primer là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.
Cấu trúc phụ trong primer: Các cấu trúc thứ cấp là sự kết hợp khác nhau của các primer được hình thành giữa chúng (tự và dị vật) thông qua một cấu trúc giống như vòng lặp được tạo ra bởi cùng một primer một.
Kẹp tóc: được hình thành do sự tương tác nội phân giữa các nucleotide của cùng một primer.
Self-dimer (homodimer): những dimer này được hình thành bởi các tương tác giữa hai primer giống nhau.
Cross-dimer (hetero-dimer): được tạo ra bởi tương tác giữa các primer phía trước và đảo ngược.2.3 Sử dụng phần mềm thiết kế primer
Công cụ thiết kế primer
Các phần mềm và công cụ trực tuyến giúp tối ưu hóa quá trình thiết kế primer Một số công cụ phổ biến bao gồm:
Primer3: Một trong những công cụ trực tuyến phổ biến nhất cho việc thiết kế primer.
NCBI Primer-BLAST: Kết hợp giữa thiết kế primer và kiểm tra tính đặc hiệu thông qua BLAST.
OligoCalc: Công cụ để tính toán nhiệt độ nóng chảy, hàm lượng GC, và kiểm tra các cấu trúc thứ cấp.
Chọn hypothetical proteinThiết kế mồi khuếch đại sp có kích thước 200 bp trở lên
Quy trình thiết kế primer qua NCBI, Primer3plus/Primer3 Input, In silico
Bước 1: Tìm kiếm từ khóa “ncbi” hoặc dán link web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Bước 2: Chuyển data thành “Protein”, tìm kiếm từ khóa “Clostridium Botulinum” và thiết lập độ dài của Protein từ 90 đến 250 aa.
Hình 2.1 Trang tìm kiếm “ncbi”.
Bước 3: Chọn trình tự aa với điều kiện có “hypothetical” và trình tự aa dài từ 90 đến 150 aa.
Hình 2.2 Tìm kiếm vi khuẩn Clostridum Botulinum.
Hình 2.3 Trình tự aa điển hình phù hợp với điều kiện
Bước 4: Tiến hành Run Blast trình tự aa của protein
Hình 2.4 Run Blast trình tự của protein.
Bước 5: Kiểm tra tỷ lệ, tóm tắt tỷ lệ và chọn Accession có tỷ lệ 100%.
Bước 6: Chọn “Identical Proteins” để hiển thị vùng Nucleotide sau đó chọn vùng đầu tiên có dấu “-“
Bước 7: Tiến hành Fasta vùng trình tự Nucleotide và copy trình tự Nucleotide
Hình 2.5 Chọn Accession có tỉ lệ 100%.
Hình 2.6 Chọn vùng trình tự nucleotide có chiều âm “-“.
Hình 2.7 Hiển thị vùng trình tự Nucleotide.
Bước 8: Tìm kiếm từ khóa “Primer3splus” vào trang chính và paste trình tự Nucleotide vừa copy và chọn “Pick Primers”
Bước 9: Chọn Primer có trình tự không bắt cặp với nhau
Hình 2.8 Tìm primer trên web Primer3plus.
Bước 10 Vào web “In silico” Thiết lập vi khuẩn “Clostridium” -> “Next step” ->
“APPLY TO ALL Clostridium” sau đó copy và paste primer xuôi và ngược vào tiến hành chạy chương trình.
Bước 11: Kết quả chạy chương trình cho thấy có 6 band của Clostridium Botulinum 7,8,9,10,15,19
Hình 2.10 Thiết lập và chạy chương trình trên web In silico.
Hình 2.9 Primer xuôi và ngược được chọn.
Hình 2.12 Các vị trí của loài Clostridum BotulinumHình 2.11 Kết quả sau khi chạy chương trình.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả
>NZ_JACBCT010000001.1:c1874797-1874126 Clostridium botulinum strain Cbot23- KM43-1 1, whole genome shotgun sequence
ATGAAGACATATAAAGTTCTAGAAATTAAACAAAGTGTTTTCGAAAATAATGATCGCCAAGCAGAGTTACTTAGAGAAGAATTGAAAAAAAAGGGGATATTTTTATTAAATCTTATGTCATCACCTGGTTCAGGAAAAACAACAACTCTTTTAAGAACAGTTAAGGCTTTGAAAAATGAAATGAATATTGGGGTTCTGGAAGCAGATATTGATTCAGAGGTAGATGCAAATAAGGTTTCACAGTCTGGTGTTAAAGTAATTCAGCTACACACTGGAGGAATGTGCCATCTTGATGCTGATATGACAAAACAAAGCTTAAATGGTCTTGGGACTGAGAATATTGATTTGGCAGTACTAGAGAATATTGGGAATTTAGTATGTCCCGCAGAGTTTGATACTGGTGCATCAAGAAATGCTATGATTTTAAGCATACCAGAAGGGGATGATAAACCCTTAAAATATCCTTTAATGTTTTCAATAGTTGATGTTCTACTGATTAATAAAATAGATGCAAAGGACTATTTTCAATTTGATTTGGAAGCAGTAAAAGAAAGGGTAAGAAAATTAAATCCAAATATTAAGGTTATTCCAATTTCAGCAAAGACTGGAGAGGGAATTGAAGAATGGATTGATTGGATACGTAAAGAAGTAAAGATTTGGAAAGAAAGTTAA
>NZ_CP013705.1:c3488496-3487807 Clostridium botulinum strain F160 chromosome, complete genome
GTGAAGGGTAAAAGTAGCCTAGGTATTATATTTCTTGTGATAGGTTTAGGAATATTTTTA GAAGCATTAAATTTATGGGATTTTGGAAATGTTATAAGTAGCTATTGGCCAATGATATTA ATAGTTATTGGTATTAAAAAACTTCTAGAAAAATCAGTTTCATATTTAAATGGAATTGTA TTAATATTATTAGGAGCAATGTTTCAATTAAGAAATTTAAATATATTATATAATGTATCT AAATTCTTTTGGGCAGGAATTTTCCTTTTAATAGGTTTCTATTTATTATCTTATAAAGAA AGCTTTAAACCAAAGGATAGAGCTTTTTTTGGTGGACAGAATGCAGAGGATTTTGTGAAA ACAGGAGCAATATTTTCAGGAGCTAGAACTAAGAATTATTCAAAATCTTTTAAGGGTGGA AGTATCACAACTATGTTTGCAGGAGTAGATTTAGATTTACTAGATGCTGAGCTGAGTTTA GACGGTGCTTATATAGATGTATTTGTAGCTTTTGGAGGAGTAGATATAATGGTTCCTGAA AATTGGAATGTAGTTATAACTGGCATACCAATATTTGGCGGATGGAGTAATAAAACTAGA AATAGAAATATAAATAATGCAGGACCAACTCTAAAAATTAATTGTATAGCAGCTTTTGGG GGACTGGATGTGAAGCATTATTTTAACTAA
Hình 3.2 Số band primer 1 phát hiện Clostridium botulinum.
>NC_012563.1:c1980327-1979908 Clostridium botulinum A2 str Kyoto, complete sequenceATGGATAACAAAAATAATAAAAAAGATATTGATATAGAAGATATAGAGGATATA AAAAATATAGATAGTTTAATAAGCTTATCTGATGATTGTATAGAAAAAACATTAATTAGG
Hình 3.4 Số band primer 2 phát hiện Clostridium botulinum.
Hình 3.3 Thông tin về cặp primer 2.
ATAAGAAGTATAAACGCTTTAAGAGATGAACTAATTAAACTCAATTTAAATCCAGAAGGGTTAATTTATTTTAATAATGAAGTTTATCCTTTACTTTATACTTTAACAAATCTTAGTACCACTTCTCTAAATCTATCTACTTCTGCTAATTTTCTATCAACTGCTGTATATTTAAAGCCTAAGGATTCTAAAATTAAGGATACTCTTAAATTAATCTATGAAATGACTGAGCAATGCGAAGATATATACGATTCTTTAAAATATAAAATAGATACTCTTATATGTATATCTAAAAAATCCAAATAA
>NC_012658.1:c1314783-1314391 Clostridium botulinum Ba4 str 657, complete sequence
ATGGGAAATAATAATTTAGAAATATATATATCCAAGGAAGCTTCAGAAAATTTATCAAAA TTACTAAAAGAAAATGATTACTCTTGCGTTAGGCTTTCCTATGTGAAAAGCTGCTGTGCT AGGGGGCGTTTGGATATAGTATTAGACAATATTAAAGAAAAAGATTTAAAACATGAATAT GCTTCAATCATATTAGTTTATAATAATGAAGTTTCTAATAATATAAAAAAAGTAGAAATA ATTTATAAAAATAATGATTTTATGATGAAAATTACTCCAAGAGACACTAATGGTTGTAAA AATGGTTGCTGCAAAAATAATACTTCCTCTAATTGTAATAATAGTTGTAATAAAAAATGT CCTTATAAGAATAAAACTTGTTCTAAGTCATAG
Hình 3.6 Số band primer 3 phát hiện Clostridium botulinum.
Hình 3.5 Thông số về cặp primer 3.
Biện luận
Biện luận chung về kết quả thiết kế primer và thực hiện PCR cho Clostridium botulinum tập trung vào việc đánh giá tính hiệu quả và đặc hiệu của các primer đã thiết kế, đồng thời phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả PCR Dưới đây là các điểm chính cần xem xét:
Hình 3.8 Số band primer 3 phát hiện Clostridium botulinum.
Hình 3.7 Thông tin về cặp primer 3.
Sản phẩm PCR đúng kích thước: Nếu băng DNA trên gel điện di có kích thước đúng như dự kiến, điều này chỉ ra rằng các primer đã gắn đúng vào vùng mục tiêu của gen Clostridium botulinum và phản ứng PCR đã thành công Thiết kế primer là chính xác và điều kiện PCR đã được tối ưu hóa phù hợp.
Không có sản phẩm hoặc sản phẩm không đúng kích thước: Nếu không có băng DNA hoặc băng có kích thước khác so với dự kiến, có thể do primer không đặc hiệu, điều kiện PCR không tối ưu hoặc chất lượng DNA mẫu không đủ tốt.
Có vấn đề cần được khắc phục trong thiết kế primer hoặc điều kiện phản ứng PCR.
Kiểm tra lại các yếu tố sau:
Để đảm bảo độ đặc hiệu của đoạn mồi, công cụ BLAST được sử dụng trong quá trình thiết kế để kiểm tra trình tự Ngoài ra, quá trình PCR cần được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi, nồng độ MgCl2 và thời gian chu kỳ để đảm bảo hiệu quả khuếch đại.
Chất lượng DNA: Đảm bảo DNA mẫu không bị phân hủy và đủ nồng độ.
3.2.2 Tính đặc hiệu của primer Đặc hiệu cao: Primer chỉ gắn vào vùng đích trên gen Clostridium botulinum mà không gắn vào các vị trí không mong muốn Thiết kế primer thành công và có thể sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán. Đặc hiệu thấp: Nếu primer gắn vào nhiều vị trí khác nhau, kết quả PCR sẽ có nhiều băng với kích thước khác nhau Thiết kế primer cần điều chỉnh để tăng tính đặc hiệu Thiết kế lại primer, chọn các đoạn trình tự ít đồng dạng hoặc tối ưu hóa điều kiện gắn mồi trong PCR.
3.2.3 Nhiệt độ nóng chảy (Tm)
Tm phù hợp: Tm của primer nằm trong khoảng 50-60°C và chênh lệch Tm giữa hai primer không quá 2-3°C, đảm bảo primer gắn kết tốt vào DNA mục tiêu Primer có khả năng gắn tốt vào DNA mục tiêu và phản ứng PCR hiệu quả.
Tm không phù hợp: Tm quá thấp hoặc quá cao có thể làm giảm hiệu quả gắn mồi Cần điều chỉnh lại thiết kế primer hoặc điều kiện PCR để đảm bảo Tm nằm trong khoảng tối ưu Thiết kế lại primer hoặc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi trong PCR.
3.2.4 Cấu trúc bậc hai của primer
Không có cấu trúc bậc hai: Primer không tạo ra các cấu trúc như kẹp tóc hay dimer, giúp gắn kết hiệu quả vào DNA mục tiêu Primer sẽ hoạt động hiệu quả trong phản ứng PCR.
Tiến hành PCR mà không cần thay đổi thiết kế primer.
Có cấu trúc bậc hai: Cấu trúc bậc hai như kẹp tóc hoặc dimer làm giảm hiệu quả gắn mồi.
Thiết kế primer cần thay đổi để loại bỏ các cấu trúc không mong muốn Sử dụng công cụ phân tích cấu trúc bậc hai để thiết kế lại primer.
3.2.5 Nồng độ thành phần phản ứng PCR
Nồng độ phù hợp: Nồng độ MgCl2 và primer tối ưu giúp phản ứng PCR diễn ra hiệu quả. Điều kiện phản ứng tốt, đảm bảo kết quả PCR chính xác và đáng tin cậy Tiến hành PCR mà không cần thay đổi các thành phần.
Nồng độ không phù hợp: Nồng độ không tối ưu có thể làm giảm hiệu quả phản ứng PCR.
Cần điều chỉnh lại nồng độ các thành phần phản ứng.Thử nghiệm với các nồng độ khác nhau để xác định điều kiện tối ưu.
Chất lượng tốt: DNA không bị phân hủy và đủ nồng độ, đảm bảo kết quả phản ứng đáng tin cậy Mẫu DNA phù hợp cho PCR.Tiến hành PCR với mẫu DNA này.
Chất lượng kém: DNA bị phân hủy hoặc không đủ nồng độ sẽ ảnh hưởng đến kết quảPCR Cần kiểm tra và chuẩn bị lại DNA mẫu để đảm bảo chất lượng tốt nhất cho phản ứng PCR Chiết xuất lại DNA hoặc sử dụng DNA có chất lượng tốt hơn.
Kết quả PCR thành công, với sản phẩm DNA đúng kích thước và không có các sản phẩm không mong muốn, chỉ ra rằng các primer đã được thiết kế chính xác và điều kiện PCR là tối ưu
‘ Primer Sequence (5′-3′) Produc t size (bp)
Location on gene (coding region)
Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC
Ar CBMLA2 CGT ATT TGG AAA
Bf CBMLB1 CAG GAG AAG TGG
Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG
Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA
Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA
Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG
Fr CBMLF2 TAA CTC CCC TAG
Dựa trên tính đặc hiệu cho từng loài C botulinum, các primer được công bố sử dụng chuỗi DNA mã hóa độc tố BoNT Bốn cặp mồi mới đặc hiệu cho C botulinum loại A, B, E hoặc F đã được thiết kế Các mồi này được chọn từ các vùng không tương đồng của gen BoNT loại A, B, E và F bằng phần mềm Primer 3.
Bảng 2.1 Primers for multiplex PCR detection of C botulinum types A, B, E, and F aSubscript f, forward primer; subscript r, reverse primer.
