Quy trình thiết kế primer đặc hiệu cho C.botulinum

QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU C.BOTULINUM

Trong phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase), primer đóng vai trò rất quan trọng. Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn (thường dài khoảng 18-25 nucleotide) có chức năng xác định vùng DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Xác định điểm bắt đầu cho tổng hợp DNA: Primer gắn kết với sợi DNA mẫu tại vị trí cụ thể, đánh dấu điểm bắt đầu cho enzyme DNA polymerase.

Một cặp primer bao gồm một primer gắn vào sợi đơn DNA theo chiều 5' đến 3' (gọi là forward primer) và một primer gắn vào sợi đơn DNA theo chiều 3' đến 5' (gọi là reverse primer). Tạo khuôn mẫu cho DNA polymerase: Primer cung cấp đầu mồi cần thiết cho DNA polymerase bắt đầu tổng hợp sợi DNA mới. Tăng độ đặc hiệu của phản ứng: Primer giúp tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách chỉ khuếch đại những đoạn DNA có trình tự tương ứng với primer.

Điều chỉnh chiều dài đoạn DNA khuếch đại: Chiều dài của đoạn DNA được khuếch đại (amplified product) được xác định bởi khoảng cách giữa hai primer. Bằng cách thiết kế primer một cách chính xác, các nhà khoa học có thể kiểm soát kích thước của đoạn DNA mục tiêu. Phản ứng PCR gồm ba giai đoạn chính: biến tính (denaturation), gắn kết (annealing) và kéo dài (extension).

Primer có vai trò quan trọng nhất ở giai đoạn gắn kết, nơi mà nhiệt độ của phản ứng được giảm xuống để cho phép primer gắn kết chính xác với sợi DNA. Như vậy, primer không chỉ là "công cụ" khởi đầu cho sự tổng hợp DNA mà còn là yếu tố quyết định đến tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR. Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3' có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3' quá mạnh khiến primer bắt cặp không đặc hiệu.

Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự primer của trình tự đôi (VD:. ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG). Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một primer là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp. Cấu trúc phụ trong primer: Các cấu trúc thứ cấp là sự kết hợp khác nhau của các primer được hình thành giữa chúng (tự và dị vật) thông qua một cấu trúc giống như vòng lặp được tạo ra bởi cùng một primer một.

Bước 2: Chuyển data thành “Protein”, tìm kiếm từ khóa “Clostridium Botulinum” và thiết lập độ dài của Protein từ 90 đến 250 aa. Bước 8: Tìm kiếm từ khóa “Primer3splus” vào trang chính và paste trình tự Nucleotide vừa copy và chọn “Pick Primers”.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Biện luận

Sản phẩm PCR đúng kích thước: Nếu băng DNA trên gel điện di có kích thước đúng như dự kiến, điều này chỉ ra rằng các primer đã gắn đúng vào vùng mục tiêu của gen Clostridium botulinum và phản ứng PCR đã thành công. Không có sản phẩm hoặc sản phẩm không đúng kích thước: Nếu không có băng DNA hoặc băng có kích thước khác so với dự kiến, có thể do primer không đặc hiệu, điều kiện PCR không tối ưu hoặc chất lượng DNA mẫu không đủ tốt. Đặc hiệu cao: Primer chỉ gắn vào vùng đích trên gen Clostridium botulinum mà không gắn vào các vị trí không mong muốn.

Thiết kế primer thành công và có thể sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu và chẩn đoán. Đặc hiệu thấp: Nếu primer gắn vào nhiều vị trí khác nhau, kết quả PCR sẽ có nhiều băng với kích thước khác nhau. Thiết kế lại primer, chọn các đoạn trình tự ít đồng dạng hoặc tối ưu hóa điều kiện gắn mồi trong PCR.

Tm phù hợp: Tm của primer nằm trong khoảng 50-60°C và chênh lệch Tm giữa hai primer không quá 2-3°C, đảm bảo primer gắn kết tốt vào DNA mục tiêu. Cần điều chỉnh lại thiết kế primer hoặc điều kiện PCR để đảm bảo Tm nằm trong khoảng tối ưu. Không có cấu trúc bậc hai: Primer không tạo ra các cấu trúc như kẹp tóc hay dimer, giúp gắn kết hiệu quả vào DNA mục tiêu.

Có cấu trúc bậc hai: Cấu trúc bậc hai như kẹp tóc hoặc dimer làm giảm hiệu quả gắn mồi. Cần điều chỉnh lại nồng độ các thành phần phản ứng.Thử nghiệm với các nồng độ khác nhau để xác định điều kiện tối ưu. Chất lượng tốt: DNA không bị phân hủy và đủ nồng độ, đảm bảo kết quả phản ứng đáng tin cậy.

Kết quả PCR thành công, với sản phẩm DNA đúng kích thước và không có các sản phẩm không mong muốn, chỉ ra rằng các primer đã được thiết kế chính xác và điều kiện PCR là tối ưu. Primer dựa trên trình tự DNA đã công bố của gen BoNT bốn cặp mồi mới, mỗi cặp mồi đặc hiệu cho C. Các mồi được chọn từ các vùng không tương đồng của gen BoNT loại A, B, E và F bằng cách sử dụng phần mềm Primer 3 (S.