3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Ly trích DNA tổng số: Sử dụng mẫu thực địa được tăng sinh trong môi trường LB, môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn Pantoea stewartii. Mẫu nhóm chọn là mẫu số 3.
3.3.1. Ly trích DNA tổng số
Bước 1: Thu sinh khối vi khuẩn. Dùng Micropipette hút 1 mL dịch tăng sinh cho vào ống Eppendoft 1,5 mL, sau đó ly tâm 10.000 vòng trong 3 phút. Bỏ dịch nổi, thu tủa sau khi ly tâm (lặp lại 2 - 3 lần).
Bước 2: Thờm 400 àL STE (STE dựng để rửa mụi trường và tạp chất, giỳp Lysis Buffer phá vỡ tế bào tốt nhất), vortex 10 giây sau đó đem ly tâm 10.000 vòng trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, thu tủa. Lặp lại 2 lần.
Bước 3: Thờm 400 àL Lysis Buffer, votex 10 giõy sau đú ủ ở 65oC trong 1 giờ.
Bước 4: Bổ sung 300 àL CI Buffer. Ly tõm 13.000 vũng trong 10 phỳt. Hỗn hợp dung dịch tách thành 3 lớp (hình 3.2), lớp trên cùng là DNA của vi khuẩn, lớp giữa bao gồm protein, lipid và cặn tế bào còn sót lại, lớp cuối cùng là CI, hóa chất khác và nước.
Bước 5: Hỳt 300 àL dịch nổi vào ống Eppendorf 1,5 mL mới, thờm vào đú 100 àL Chloroform (tỷ lệ 3:1). Ly tâm 13.000 vòng trong 8 phút.
Bước 6: Thu 200 àL dịch nổi, thờm 100 àL Isopropanol, đảo nhẹ cho đồng nhất mẫu và ủ lạnh 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng trong 13 phút rồi đổ bỏ phần dịch nổi và thu tủa.
Bước 7: Cho 480 àL Ethanol 70% vào sau đú ly tõm 13.000 vũng trong 10 phỳt, đổ bỏ dịch nổi (lặp lại 2 lần) và để khô tự nhiên.
Hình 3.1. Sinh khối vi khuẩn sau 3 lần thực hiện.
Hình 3.2. Hỗn hợp dung dịch tách thành 3 lớp sau khi ly tâm.
3.3.2. Điện di DNA tổng số
Sau khi ly trích, cần tiến hành điện di trên gel agarose 1%, điện thế 100V trong 25 phút nhằm kiểm tra hiệu quả ly trích DNA tổng số.
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1%, cho 0,35 g agarose tinh khiết vào 35 mL dung dịch TBE 0,5X. Đun hỗn hợp trong máy Microwave cho tới khi agarose tan hoàn toàn.
Bước 2: Để gel agarose nguội đến khoảng 65oC, đổ vào khuôn đã được đặt lược trước đó. Đợi đến khi gel agarose đông hoàn toàn.
Bước 3: Lấy lược ra từ từ tránh làm ảnh hưởng đến giếng, đưa gel vào bồn điện di (cho vào bồn điện di một lượng TBE Buffer 0,5X đủ ngập miếng gel).
Bước 4: Trộn đều 3 àL sản phẩm DNA đó ly trớch (được pha loóng 2 lần) với 0,5 àL Loading dye và 1 àL GelRed. Cho vào giếng toàn bộ hỗn hợp trờn.
Bước 5: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút.
Bước 6: Đọc kết quả và ghi nhận hình ảnh.
3.3.3. PCR 16S rRNA
Thực hiện phản ứng PCR 16S rRNA
Bước 1: Tiến hành vortex mẫu số 6 trước khi thực hiện phản ứng.
Bước 2: Mix các thành phần phản ứng PCR.
Chuẩn bị 11 ống eppendorf. Hút lần lượt 64,9 μL nước, 1,1 μL Dream Taq, 5,5 μL Primer F và 5,5 μL Primer R . Mix đều hỗn hợp và tiến hành chia đều ra 11 ống còn lại, mỗi nhóm sử dụng 1 ống chứa 9 μL dung dịch. Thêm 1 μL mẫu vào và chuẩn bị 1 ống làm đối chứng âm cho phản ứng.
Bảng 3.1. Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR 16S
Thành phần Đối với 1 phản ứng (μL)
Nước 5,9
Primer xuôi (63F) 0,5
Primer ngược (1489R) 0,5
Bảng 3.2. Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR 16S (tiếp theo) Thành phần Đối với 1 phản ứng (μL)
Dream Taq 0,1
Buffer 2
Mẫu 1
Tổng 10
Điện di sản phẩm PCR
Bước 4: Đổ gel Agarose 1% bằng dung dịch TBE 0.5X.
Bước 5:Hút 1 μL GelRed và 5 μL mẫu, mix đều hỗn hợp và bơm vào giếng gel được chỉ định
Bước 6: Hút 5 μL đối chứng âm: 1 μL GelRed, mix đều và bơm hỗn hợp vào giếng thứ 2. Làm tương tự đối với mẫu ladder theo tỷ lệ 5 μL ladder : 1 μL GelRed và bơm hỗn hợp vào giếng đầu tiên.
Bước 7: Che chắn bồn điện di tránh ánh sáng và tiến hành điện di ở 100V trong 25 phút. Chụp gel dưới tia UV, thu hình ảnh và đánh giá kết quả thu được.
3.3.4. PCR với primer tự thiết kế
Bước 1: Tiến hành vortex mẫu số 6 trước khi thực hiện phản ứng.
Bước 2: Mix các thành phần phản ứng PCR.
Chuẩn bị 12 ống eppendorf. Hút lần lượt 64,8 μL nước, 1,2 μL MyTaq, 6 μL Primer F và 6 μL Primer R . Mix đều hỗn hợp và tiến hành chia đều ra 11 ống còn lại, mỗi nhóm sử dụng 1 ống chứa 9 μL dung dịch.
Thêm 1,5 μL mẫu vào và chuẩn bị 1 đối chứng âm và 1 đối chứng dương cho phản ứng.
Bảng 3.3. Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR với mồi tự thiết kế
(μL)
Nước 5,4
Primer xuôi 0,5
Bảng 3.4. Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR với mồi tự thiết kế (tiếp theo)
Thành phần Đối với 1 phản ứng (μL)
Primer ngược 0,5
MyTaq 0,1
Buffer 2
Mẫu 1,5
Bước 3: Cài đặt máy thực hiện phản ứng PCR 30 chu kỳ theo bảng sau:
Bảng 3.5. Thời gian và nhiệt độ thực hiện PCR với mồi tự thiết kế Các giai đoạn phản
ứng PCR Thời gian Nhiệt độ Chu kỳ
Tiền biến tính 3 phút 95oC 1
Biến tính 30 giây 95oC
30
Bắt cặp 30 giây 52oC
Kéo dài 30 giây 72oC
Hậu kéo dài 7 phút 72oC
Bảo quản ngắn sản 1X phẩm
2 phút 25oC
Điện di sản phẩm PCR
Bước 4: Đổ gel Agarose 1% bằng dung dịch TBE 0.5X.
Bước 5:Hút 1 μL GelRed và 5 μL mẫu, mix đều hỗn hợp và bơm vào giếng gel được chỉ định
Bước 6: Hút 5 μL đối chứng âm : 1 μL GelRed, mix đều và bơm hỗn hợp vào giếng thứ 2. Làm tương tự đối với mẫu đối chứng dương và ladder theo tỷ lệ 5 μL ladder/mẫu : 1 μL GelRed và bơm hỗn hợp vào giếng (cần tiến hành bơm theo thứ tự lần lượt là mẫu, đối chứng âm, đối chứng dương và cuối cùng là ladder).
Bước 7: Che chắn bồn điện di tránh ánh sáng và tiến hành điện di ở 100V trong 25 phút.
Chụp gel dưới tia UV, thu hình ảnh và đánh giá kết quả thu được.
3.3.5. PCR với primer tham khảo bài báo khoa học
Bước 1: Tiến hành vortex mẫu số 6 trước khi thực hiện phản ứng.
Bước 2: Mix các thành phần phản ứng PCR.
Chuẩn bị 12 ống eppendorf. Hút lần lượt 70,8 μL nước, 1,2 μL DreamTaq, 6 μL Primer F và 6 μL Primer R . Mix đều hỗn hợp và tiến hành chia đều ra 11 ống còn lại, mỗi nhóm sử dụng 1 ống chứa 9 μL dung dịch. Thêm 1 μL mẫu vào và chuẩn bị 1 đối chứng âm và 1 đối chứng dương cho phản ứng.
Bảng 3.6. Tỷ lệ các thành phần phản ứng PCR với mồi tham khảo
Thành phần Đối với 1 phản ứng (μL)
Nước 5,9
Primer xuôi 0,5
Primer ngược 0,5
Dream Taq 0,1
Buffer 2
Mẫu 1
Tổng 10
Bước 3: Cài đặt máy thực hiện phản ứng PCR 35 chu kỳ theo bảng
Bảng 3.7. Thời gian và nhiệt độ thực hiện PCR với mồi tham khảo Các giai đoạn phản
ứng PCR Thời gian Nhiệt độ Chu kỳ
Tiền biến tính 3 phút 95oC 1
Biến tính 30 giây 95oC
35
Bắt cặp 30 giây 52oC
Kéo dài 30 giây 72oC
Hậu kéo dài 7 phút 72oC
Bảo quản ngắn sản 1X phẩm
2 phút 25oC
Điện di sản phẩm PCR
Bước 4: Đổ gel Agarose 1% bằng dung dịch TBE 0.5X.
Bước 5: Hút 1 μL GelRed và 5 μL mẫu, mix đều hỗn hợp và bơm vào giếng gel được chỉ định.
Bước 6: Hút 5 μL đối chứng âm : 1 μL GelRed, mix đều và bơm hỗn hợp vào giếng thứ 2. Làm tương tự đối với mẫu đối chứng dương và ladder theo tỷ lệ 5 μL ladder/mẫu : 1 μL GelRed và bơm hỗn hợp vào giếng (cần tiến hành bơm theo thứ tự lần lượt là mẫu, đối chứng âm, đối chứng dương và cuối cùng là ladder).
Bước 7: Che chắn bồn điện di tránh ánh sáng và tiến hành điện di ở 100V trong 25 phút.
Chụp gel dưới tia UV, thu hình ảnh và đánh giá kết quả thu được.