Tuy nhiên, do tính không đồng nhất của các loài được xếp vào chi này nên việc phân chia chi này được đề xuất vào năm 1969 và tên được đổi thành Alcaligenes eutrophus Davis et al., 1969.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC HÀNH
SINH TIN HỌC ỨNG DỤNG
Trang 2Tp Thủ Đức, tháng 06 năm 2024
Trang 3BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC HÀNH
SINH TIN HỌC ỨNG DỤNG
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
PGS.TS.NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN LƯU VĨNH HẢO – 21126333
TRẦN THỊ KIM NGÂN – 21126419
LÊ THỊ BẢO NGÂN – 21126414
TP Thủ Đức, tháng 06 năm 2024
Trang 4MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC HÌNH ii
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1 Tổng quan về chi Cupriavidus sp 1
1.2 Phân loại loài trong chi Cupriavidus sp 2
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3
2.1 Tìm kiếm thông tin trình tự nucleotide trên NCBI 3
2.2 So sánh trình tự các loài đã nhận được bằng công cụ MEGA 4
2.3 Thiết kế primer đặc hiệu cho chi Cupriavidus sp nhờ công cụ Primer3 4
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 7
TÀI LIỆU THAM KHẢO 12
Trang 5DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Tìm kiếm trình tự loài thuộc chi Cupriavidus sp 3
Hình 2.2 Kết quả tìm kiếm loài thuộc chi Cupriavidus sp 3
Hình 2.3 Lấy trình tự PASTA của loài Cupriavidus yeoncheonensis 4
Hình 2.4 Chọn ClustalW (1.6) để chương trình so sánh các trình tự 4
Hình 2.5 Nhập dữ liệu cần thiết cho thiết kế vào Primer3 5
Hình 2.6 Nhập cặp primer vào in silico PCR amplification 5
Hình 2.7 Nhập cặp primer vừa tìm được vào công cụ 6
Hình 2.8 Tiến hành kiểm tra chéo trên chi khác cho cặp primer 6
Hình 3.1 Kết quả so sánh các đoạn trình tự trên MEGA 7
Hình 3.2 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ nhất 8
Hình 3.3 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ hai 9
Hình 3.4 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ ba 11
Trang 6CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về chi Cupriavidus sp.
Cupriavidus là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, không lên men glucose thuộc họ Burkholderia của ngành Betaproteobacteria, có đặc tính gram âm, hình que và khả năng vận động (Coenye T, 1999; Huang N, 2019) Cupriavidus là một chi vi khuẩn bao gồm chi cũ Wautersia Chúng được đặc trưng với quá trình trao đổi chất oxy hóa.
Chúng có tiên mao peritrichous , là sinh vật hiếu khí bắt buộc và là sinh vật hóa hữu cơ hoặc hóa dưỡng Những sinh vật này đã được tìm thấy trong đất và trong các chủng phân lập lâm sàng (Sardà Carbasse, 2020)
Cupriavidus sp là những sinh vật môi trường có mặt khắp nơi, chủ yếu trong
nước và thực vật C pauculus là thành viên quan trọng nhất trong họ này chịu trách
nhiệm về các bệnh nhiễm trùng cơ hội và đôi khi có thể gây ra các đợt bùng phát
Bộ gen của Cupriavidus sp bao gồm nhiều loại protein có chức năng liên quan
đến stress và khả năng chống chịu kim loại, bao gồm cả siderophores và hemoglobin của vi khuẩn, ngoài ra còn có các gen được dự đoán là có liên quan đến việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật, chẳng hạn như sinh tổng hợp IAA (axit indole-3-acetic) và ACC (axit 1-aminocyclopropane-1-carboxylic) deaminase
Một số loài thuộc chi Cupriavidus là nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng
khác nhau, chẳng hạn như nhiễm trùng đường hô hấp tại cộng đồng hoặc bệnh viện (bao gồm cả viêm phổi liên quan đến thông khí), viêm màng não, viêm bao gân, viêm
mô tế bào, viêm khớp nhiễm trùng, viêm phúc mạc, nhiễm trùng huyết (Balada Llasat
JM, et al., 2010, Almasy E, et al., 2016) Các trường hợp nhiễm trùng bệnh viện đầu tiên do C pauculus gây ra được mô tả ở trẻ em nhập viện (Duggal S, et al., 2013).
Nhiễm trùng đã được xác định ở mọi lứa tuổi, nhưng có mức độ nghiêm trọng cao ở trẻ sơ sinh và bệnh nhân suy giảm miễn dịch (ví dụ như u tân sinh, cấy ghép, AIDS
hoặc bệnh viêm ruột) (Fiel D, et al., 2020; Di Franco M, et al., 2017; Bianco G, et al.,
2018) Nhiễm trùng đường hô hấp ảnh hưởng chủ yếu đến những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch nhưng việc tồn tại trước các ổ nhiễm trùng di căn ở phổi có thể làm
Trang 7tăng nguy cơ nhiễm C pauculus ngay cả ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch bình
thường
1.2 Phân loại loài trong chi Cupriavidus sp.
Việc phân loại Cupriavidus necator đã trải qua một số thay đổi kể từ lần phân lập
đầu tiên vào năm 1957 Các nghiên cứu được công bố đầu tiên đã phân loại nó là
Hydrogenomonas eutropha, do khả năng vi khuẩn phát triển theo phương pháp hóa
thạch dưỡng trên hỗn hợp hydro, oxy và CO 2 Thật vậy, chi Hydrogenomonas, được
thành lập vào năm 1909, bao gồm tất cả các loài có khả năng oxy hóa hydro ( Davis và cộng sự, 1969 ; Repaske, 1962 ; Schlegel và cộng sự, 1961 ) Tuy nhiên, do tính không đồng nhất của các loài được xếp vào chi này nên việc phân chia chi này được đề xuất
vào năm 1969 và tên được đổi thành Alcaligenes eutrophus ( Davis et al., 1969 ) Tên loài lại được thay đổi một lần nữa sau sự sắp xếp lại của họ Burkholderia, trở thành
Ralstonia eutropha, trong đó Ralstonia là một chi mới bao gồm loài A eutrophus
trước đây và hai loài Burkholderia ( Yabuuchi et al., 1995 ) Chi Ralstonia sau đó được chia thành hai chi khác nhau, thay đổi Ralstonia eutropha thành Wautersia
eutropha ( Vaneechoutte et al., 2004 ) Trong cùng năm đó, một thí nghiệm lai
DNA-DNA đã xác nhận rằng W eutropha trên thực tế là cùng một loài với một chủng phân lập khác mà Makkar và Casida thu được vào năm 1987, được đặt tên là Cupriavidus
necator Quyết định gán loài phân lập này cho một chi và loài mới được đưa ra dựa
trên hoạt động săn mồi mà nó thể hiện, hoạt động này không được tìm thấy ở chi
Alcaligenes ( Makkar và Casida, 1987 ) Tuy nhiên, đặc điểm này sau đó đã được
chứng minh là có liên quan đến sự hiện diện của một plasmid cụ thể Do đó, để tuân thủ các quy tắc được thiết lập trong Bộ luật danh pháp quốc tế của Prokaryote ( Bộ luật
danh pháp quốc tế của Prokaryote, 2019 ), W eutropha vào năm 2004 cuối cùng đã được đổi tên thành Cupriavidus necator ( Vandamme và Coenye, 2004 ; Makkar và
Casida, 1987 )
Cupriavidus pauculus là một trực khuẩn gram âm hiếu khí oxidase và catalase
dương tính (hình que), không lên men , di động với tiên mao quanh tế bào (nhiều roi
phân bố ngẫu nhiên xung quanh tế bào) Cupriavidus pauculus (C pauculus), trước đây
có tên là Wautersia paucula, là một loại vi khuẩn gram âm, hiếu khí, không lên men, thuộc loài Cupriavidus Vi khuẩn ban đầu được phân loại là vi khuẩn CDC nhóm IV
Trang 8c-2 và sau đó được các tác giả khác nhau đặt tên là Ralstonia paucula hoặc Wautersia
paucula Dựa trên sự giống nhau về trình tự bộ gen, cả hai đều được đổi tên thành C pauculus (Vandamme P, Coenye T, 2004, Fiel D, et al., 2020)
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.1 Tìm kiếm thông tin trình tự nucleotide trên NCBI
Để xác định primer đặc hiệu cho chi Cupriavidus sp trước tiên cần xác định
thông tin nucleotide của các loài trong chi Sử dụng công cụ NCBI để thực hiện bước này
Hình 2.1 Tìm kiếm trình tự loài thuộc chi Cupriavidus sp.
Hình 2.2 Kết quả tìm kiếm loài thuộc chi Cupriavidus sp.
Trang 9Tiếp theo sẽ lấy trình tự PASTA của từng loài có kích thước tương đương khoảng 1400bp để thực hiện bước tiếp theo
Hình 2.3 Lấy trình tự PASTA của loài Cupriavidus yeoncheonensis.
Sau khi lấy được các trình tự của tất cả các loài, lưu các trình tự vào một tập tin dưới dạng “.txt”
2.2 So sánh trình tự các loài đã nhận được bằng công cụ MEGA
Tiến hành so sánh các đoạn trình tự trên phần mềm MEGA 11 Mở file đã lưu trong phần mềm MEGA sau đó chọn chương trình ClustalW để tiến hành so sánh
Hình 2.4 Chọn ClustalW (1.6) để chương trình so sánh các trình tự.
2.3 Thiết kế primer đặc hiệu cho chi Cupriavidus sp nhờ công cụ Primer3
Đoạn trình tự giống nhau sau khi so sánh sẽ được dùng làm cơ sở để thiết kế
đoạn mồi đặc hiệu cho chi Cupriavidus sp.
Trang 10Hình 2.5 Nhập dữ liệu cần thiết cho thiết kế vào Primer3.
Sau khi có được các cặp primer từ Primer3, tiến hành kiểm tra đoạn gen sản
phẩm từ các cặp primer trên có đạt yêu cầu không Bước này được thực hiện trên in
silico PCR amplification.
Hình 2.6 Nhập cặp primer vào in silico PCR amplification.
Các cặp primer thu được từ Primer3 sẽ được kiểm tra độ đặc hiệu trên chi
Cupriavidus sp bằng công cụ Primer-BLAST Sau khi tìm được cặp primer đặc hiệu
cho chi, tiếp theo sẽ tiến hành kiểm tra chéo trên những chi khác để xác định cặp
primer không khuếch đại những chi khác không thuộc chi Cupriavidus.
Trang 11Hình 2.7 Nhập cặp primer vừa tìm được vào công cụ
Hình 2.8 Tiến hành kiểm tra chéo trên chi khác cho cặp primer
Trang 12CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 3.1 Kết luận
Hình 3.1 Kết quả so sánh các đoạn trình tự trên MEGA.
Đoạn trình tự thứ nhất thu được từ NCBI:
5’CCCGTGCCGAGGTGGGCGTAACGGCGCAGCTTGACCTGCTTGGCCT TGGCGCCGGCAGCCTCGCGCCGCACGAACAGCAGCATCTTGGCGTGGCAC TTGTGCCCGACCACGCCGTAGATGACATGGGCCCCGGCCGATTCCAGCCGC TCGGCCCAGTTGATGTTGGTTTCTTCGTCGAAGCGCGCCAGGAGTTCCACG ACGACCGTGACTTCCTTGCCGTTGCGCGCAGCGGTCATCAGCGCTTCCATG ACCAGCGATTCATTGCCGGTGCGGTAGACCGTCTGCTTGATGGCCACCACG TGCGGGTCGATCGCGGCCTGCTGCAGCAGGTCGAGCACGGAGTTGAAGCT CTCGAATGGATGGTGCAGCAGCACGTCCTGCTGGCGGATGACATCGAAAA TCGGTGCGCCGGTCGTGAATGGCTTGACTGGTGCCGGCACGTGTGGCGGA AACTTCAGCGCCGGACGATCCACCATGTCCGGGATCTGCATCAGGCGAAC CAGGTTCACGGGCCCCGAGACGCGATACAGGTCCTGCTCGCCGAGGCCCG ATTCCAGCAACAGCCGGCGCGACAGCGCCGGCGGCGTGTCCGAGGAAACT TCCAGGCGCACGGTGTCGCCGAAGTGGCGC3’
Trang 13Hình 3.2 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ nhất.
Từ kết quả primer-BLAST nhận thấy cặp primer cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu
trên chi Cupriavidus Thu nhận cặp primer trên.
Sau các bước tiến hành thu được cặp mồi đặc hiệu:
RV: 5’GAGCACGGAGTTGAAGCTCT3’
FV: 5’CAGGACCTGTATCGCGTCTC3’
Đoạn trình tự thứ hai thu được từ NCBI:
5’GTCGGCAGTTCTCCCTGCAGCGCTTCGCGCAGGTCGGTGATTTCGTC TTCGGAAACGAAGAGGTCGGAATTGCGCGTCACGCGGAACTGGTAGCAGC CCAGGACGTCGATCGACGGGAACAGTTCATGCACGAATCCCTGCATGAAC GAGGACAGCATCACGAAGCCGAATGGGTAGCCCGACAGCTTCTCAGGCAT CTTCACCACGCGCGGCAGCGCGCGGGGGGCCTGCACGATGGCCAGGTCCG CTTCGCGGCCAAAAGCGTCCTTGCCCGACAGTTCGACCACGAAGTTCAGGC TCTTGTTCAGTACACGCGGGAACGGGTGGGCCGGGTCCAGGGCGATCGGC GTAAGGACCGGTCCCAGTTCGCGCACAAAGAAATCCCGGGCCCATTCGCG CTGTGCATCGGTCCAGGTGGTCGTCAGGTGAAAAAAGATGCCTTCCTTCTC GAGAAGGGGAAAAATGACGTTCTGCAGCATGTCATACTGCG3’
Cặp primer đặc hiệu thứ 2:
RV: 5’GACCACGAAGTTCAGGCTCT3’
PV: 5’ACATGCTGCAGAACGTCATT3’
Trang 14Hình 3.3 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ hai.
Đoạn trình tự thứ hai thu được từ NCBI:
>NZ_FMSH01000550.1 Cupriavidus necator strain B9, whole genome shotgun
sequence
GCAGGCTCCGCACCGGCGATGCGCCGTTCGCGCAGATGCGCCTTGGCGCG CTGCAGGCGGGGGGCGACGGTGTCGGCGCGCGCCAGCGCCACGCCGGCGG CCAGGACGTCGCCCAGCACCAGGTGGCTGATGCGCGAGGTCATCGGCGTG TAGACCTCGCTGTCTTCCTCGACGTCGCAAAACACGCAGACGTCGGCCAGC CGCGCCAGCGGCGAGCCGCTGTGCGTGATCGCCAGCACGCTGGCGCCGCT GCTGCGCCCAGCGTGGCGGCGGTCAGCATGTCCCAGGTGCGGCCGCTGTT GGAGACCAGCACGGCCACGTCGCCGCGGGCGAGCAGAGCGGCCGACATG CTGAACACATGTGGGTCGGAATATGCAACCGTCGGCATGCCCAGGCGGAA GAACTTGTGCTGGATATCAGCGCGACGATGCCGGAGTTGCCGCAGCCGTA GAACTCGATGCGCCGCGCGCCGGCGAGCAACTGGATGCATGCTCGATCTG GTCGGCCGACAGCGCATTGCGCACGCTCATCAGCGTGGCAATGGTGCGGT CGAAGACCTTGCCGGCAATGTCCGCGGGGCGGTCGTCGGCCGCAACGTCC TGGTGCACGAAGGGCGTGCCGCCGCCGACGTTCTGCGCGAACTGCAGCTT GAATTCGCGGAAGCCGTCGTAGCCCAGCGCCGCGCAGAAGCGCGCGATGG TGGGCTGCGACACGCCGGCGCGCTCGGCCAGTTCGGGCATCGACAGCCGG ATCACGGCGGCGCCATGCCGGGCGACATAGTCGGCCAGGCGGCGTTCAGA AGGGCGGAGCGTGTCGTAGACGGCTAGGATTCGGTCGCGCATGGCGGCGG
Trang 15GCCGCATCTTGCCCGAAATGGTGCTTCGCCCGCCCTTGGGGTTTGCCCTGA TTCCGGGAATTTCTGCGCAATTGTGATGCATGAGCGGGTCGACCGCGCGCT TGCGCTCGGTATAATGGCGGCGATCTGTAGAAAAGTCTCCGCCATGCCTTC TGCCGTCCATGCCGAGCTTCTTGCCGTCACCGAGCGCATCGTCGCGCGCAG CCGCGCCAGCCGCGCCGCCTACCTTGCCCGCTGCGAGCGCGCGCAGGCTG AACTGGGGCCGCTGCGCGGCATGTCCTGCGCCAACCTGGCGCACGGCTTTG CCGCACTGCCGGCCAACGACAAGCTGAAGCTGCGCGTCGATCATGCCCCC AACCTGGGCATCGTCACCGCTTACAACGACATGCTGTCGGCGCACCAGCC GTACGAGCGCTACCCCGCCGTGATCCGCGAGGCCGCGCGCGCGGTGGGCG CGGTGGCGCAGGTGGCGGGCGGCGTGCCGGCGATGTGCGACGGCATCACC CAGGGCAACCCGGGCATGGAGCTGTCGCTGTTCTCGCGCGATGCGATTGCC ATGGGCACCGCGGTGGCGCTGTCGCACAACACCTTTGATGCGGCGCTGAT GCTGGGCGTGTGCGACAAGATCGTGCCGGGCCTGCTGATGGGCGCGCTGC AGTTCGGCCACCTGCCGATGGTGTTCGTGCCGGCGGGCCCGATGGCCAGC GGGCTGCCCAACAAGGAGAAGGCGCGCGTGCGCCAGCTCTACGCCACCGG CCAGGTCGGGCGCGACGCGCTGCTCGAAGCCGAATGCCAGGCCTACCACG GCGCCGGCACCTGCACCTTCTACGGCACCGCCAACAGCAACCAGTTCCTGA TGGAAATCATGGGCCTGCACCTGCCGGGCGCGGCCTTCGTGCACCCGGAC AGCGGCCTGCGCGATGCGCTGAGCGCGGCGGCCGCGCAACGCGCGATCGC CCTGCGCGCGCGCGGCGACGAATACCTGCCGCTGGCGCGCATCGTTGACG AACGCGCCATTGCCAACGCCATGGTCGGCCTGCTGGCGACCGGCGGCTCC ACCAACCACACCATCCACCTGGTGGCGATGGCGCGCGCCGCGGGCATCGT CATCGACTGGAATGATTTCGACCTGCTGTCGCGCATCACGCCGCTGCTGGC GCGCGTCTACCCGAATGGCTCGGCCGATGTGAACCACTTCCATGCCGCGGG CGGCGCCGGCTTCGTCATCCGCGAACTGCTGCAGGCCGGTCTGCTGCACGA AGACGTGCAGACCGTGGCCGGCCCCGGGCTGGCCCGCTATGCGCAGGAGC CGGTGATGACCGACGGCGTGCTGCGCTGGCGCGACGGCGCGGCGCACAGC GGCGACGCGCAGGTGCTGGCGACGGCCGCGGAGCCGTTCTCGGCCGAGGG CGGGTTGCGGCTGATGCAGGGCAACCTGGGCCGCGGCGTGATCAAGGTCT CGGCGGTGGCGCCGGAGCACCGCGTGGTCGAAGCCCCGGTGCGGGTGTTC GATGCGCAGGAGGCGCTGCAGGCGGCCTTCGATGCGGGCGAGCTGACCGG
Trang 16CGACCTGGTCGCGGTGGTGCGTTTCCAGGGGCCGAACGCCAACGGCATGC CCGAGCTGCACCGCCTGACCCCGGTGCTGGGCGCGCTGCAGGAC
Hình 3.4 Kết quả Primer-BLAST của một cặp primer cặp thứ ba
Từ kết quả primer-BLAST nhận thấy cặp primer cho sản phẩm khuếch đại đặc
hiệu trên chi Cupriavidus và 1 số loài cũng thuộc chi Cupriavidus.
Cặp primer đặc hiệu thứ 3:
RV: 5’CGTAGACGGCTAGGATTCG3’
PV: 5’CCATTATACCGAGCGCAAG3’
Trang 17TÀI LIỆU THAM KHẢO
Almasy E, Szederjesi J, Rad P, Georgescu A (2016) A Fatal Case of Community
Acquired Cupriavidus Pauculus Pneumonia Crit Care Med (Targu Mures) 2(4):
201-204
Balada Llasat JM, Elkins C, Swyers L, Bannerman T, Pancholi P (2010) Pseudo-outbreak of Cupriavidus pauculus infection at an outpatient clinic related to rinsing
culturette swabs in tap water J Clin Microbiol 48(7): 2645-2647
Bianco G, Boattini M Audisio E, Cavallo R, Costa C (2018) Septic shock due to
meropenem- and colistin-resistant Cupriavidus pauculus J Hosp Infect 99(3):
364-365
Coenye T, Falsen E, Vancanneyt M, et al Classification of Alcaligenes
faecalis-like isolates from the environment and human clinical samples as Ralstonia gilardii sp.
nov Int J Syst Bacteriol 1999;49(Pt 2):405–413 doi: 10.1099/00207713-49-2-405
Di Franco M, Lucchino B, Spaziante M, Iannuccelli C, Valesini G, et al (2017)
Infections in Systemic Rheumatic Disease: Focus on Opportunistic Infections Int J
Mol Sci 8(2): 293
Duggal S, Gur R, Nayar R, Rongpharpi SR, Jain D, et al (2013) Cupriavidus
pauculus (Ralstonia paucula) concomitant meningitis and septicemia in a neonate:
first case report from India Indian J Med Microbiol 31(4): 405-409
Fiel D, Calça R Cacheira E, Rombo N, Querido S, et al (2020) Cupriavius
pauculus causing a respiratory tract infection in a post-kidney-transplant patient: A
firstly described rare clinical case Pharm Pharmacol Int J 8(1): 34-36
Gamil A Chokephaibulkit K, Phongsamart W, Techasaensiri C, Piralam B, et al
(2021) Pneumococcal disease in Thailand Int J Infect Dis 102: 429-436.
Huang N, Mao J, Zhao Y, Hu M, Wang X Multiple transcriptional mechanisms
collectively mediate copper resistance in Cupriavidus gilardii CR3 Environ Sci
Technol 2019;53(8):4609–4618 doi: 10.1021/acs.est.8b06787
Trang 18Valdés Corona LF, Maulen Radovan I, Videgaray Ortega F (2021) Cupriavidus
pauculus bacteremia related to parenteral nutrition Case series report IDCases 24:
01072
Vandamme P, Coenye T (2004) Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of
lost and found Int J Syst Evol Microbiol 54(6): 2285-2289