Tltb&Ktcnsh Thứ 4 Ca 2 Nhóm 10.Pptx

BÀI TIỂU LUẬNXÁC ĐỊNH VI KHUẨN SALMONELLA TRONG MẪU CÁ TƯƠI NGHI NHIỄM BẰNG CÁC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Môn: T

BÀI TIỂU LUẬN

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN SALMONELLA TRONG MẪU CÁ

TƯƠI NGHI NHIỄM BẰNG CÁC KỸ THUẬT CÔNG

NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Môn: Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học Người thực hiện: Nhóm 10

Giảng viên: TS Huỳnh Văn Biết

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2023

03 Vật liệu và phương pháp

04 Kết quả và thảo luận

05 Kết quả mong muốn và kiến nghị

NỘI DUNG

THỰC HIỆN

Nguồn: knowinsiders.com

Chương 1:

MỞ ĐẦU

đó có vi khuẩn

Salmonella

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1 MỞ ĐẦU

Định danh và phát hiện khuẩn Salmonella trong mẫu cá tươi nghi

nhiễm bằng các kĩ thuật công nghệ sinh học

3

Chương 2:

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu chung về Salmonella

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

Salmonella

Động vật như phó thương hàn lợn, bệnh

sẩy thai cừu và ngựa

Người gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên

phát

Phát hiện trong chất bài tiết của động vật

lành Gây ra bệnh thương

hàn và phó thương hàn

2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

- Salmonella là trực khuẩn gram âm, kích thước

trung bình (0,7 - 1,5 × 2,0 - 5,0) μm, không tạo

bào tử, khống có vỏ

- Salmonella sử dụng tiên mao để di chuyển

(ngoại trừ S pullorum và S gallinarum)

2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella.

2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

2.2.2 Sự phân bố của Salmonella

Hình 2.3 Tự nhiên. Hình 2.4 Ống tiêu hóa của động

vật và người bị nhiễm trùng. Hình 2.5 Thực phẩm.

2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

- Là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi

- Phát triển được trên các môi trường nuôi

cấy thông thuờng

- Có thể phát triển sau 24 giờ

- Có thể mọc trên các môi trường có chất

ức chế chọn lọc như DCA và XLD

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

Hình 2.6 Nuôi cấy

2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

2 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

Salmonlla

Không lên men lactose, sucrose,

salicin và inositol Lên men đường glucose và sinh hơi

Sử dụng được citrate ở môi trường

Simmons

S typhi

Chương 3: VẬT

LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng Salmonella spp phân lập

từ thủy hải sản tươi sống tại các chợ

truyền thống trên địa bàn thành phố

Hồ Chí Minh

3 Vật liệu và phương pháp

Hình 3.1 Hải sản tươi sống tại chợ.

3.2.1 Nội dung 1: Tiến hành định tính Salmonella trong mẫu nghi ngờ nhiễm

3.2.1.1 Môi trường sử dụng

BPW (Buffered

Peptone Water )

RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton)

XLD (Xylose Lysine Deoxychol ate Agar)

HE (Hektoen Entric Agar)

TSA (Tryptone Soya Agar)

Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường không chọn lọc TSA được sử

dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:

+ Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA

MR-VP both (Glucose Phosphate)

RSU (Rustigian- Stuart Urea Broth)

3.2.2 Nội dung 2: Định dạng vi khuẩn Salmondella trong mẫu bằng các

phản ứng sinh hóa

3.2.2.2 Quy trình định dạng Salmonella

Cấy ít nhất

5 khuẩn lạc Môi trường XLD và HE

Môi trường TSA

c n hẹ

C ấy

Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A dung dịch B

6 giọt dd A

2 giọt dd B

Thử nghiệm H2S

Thử nghiệm Urea Thử nghiệm VP

3.2.3 Nội dung 3: Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

Để quá trình tách chiết hoặc ly trích axit

nucleic thành công đòi hỏi ba bước:

+ Phá vỡ tế bào

+ Biến tính của phức hợp nucleoprotein

+ Khử hoạt tính của nuclease

3.2 Bố trí thí nghiệm

3 Vật liệu và phương pháp

Hình 3.3 DNA.

3.2.3 Nội dung 3: Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

3.2.3.1 Tiến hành ly trích DNA

Bước 1: nghiền mẫu trong tube có chứa 700 µL dịch đồng nhất mẫu, li tâm với vận tốc 10.000 rpm/ 5 phút, sau đó hút dịch nổi cho vào ống tube mới.

Bước 2: bổ sung vào tube 1V PCI (và lắc đều, li tâm với vận tốc 10.000 rpm/ 5 phút, sau đó hút dịch nổi cho vào ống tube mới.

Bước 3: bổ sung 1V CI vào, lắc đều, li tâm 10.000 rpm/ 5 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới.

Bước 4: thêm 0,6V isopropanol, lắc nhẹ; để yên trong 30 phút ở -200c.

Bước 5: ly tâm 12.000 rpm/ 10 phút để thu kết tủa dna loại dịch nổi phía

trên.

Bước 6: thêm 500 μL ethanol 70%, ly tâm 12.000 rpm/ 3 phút loại

Bước 9: thêm vào kết tủa DNA 50 µL TE 1x, trộn đều và bảo quản ở -20 o C.

3.2.3 Nội dung 3: Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

3.2.3.3 Một số vấn đề cần lưu ý khi thực hiên phản ứng PCR

để mang lại hiệu quả chính xác hơn

Thiết kế mồi cho phản ứng

PCR Các loại PCR Tối ưu hóa phản ứng PCR

3.2.3 Nội dung 3: Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

3.2.3.4 Điện di phân tích kết quả

1) Chuẩn bị gel agarose

2) Chạy điện di trên gel

thì không có Salmonella

trong mẫu.

4) Kết quả

3.2.3 Nội dung 3: Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

3.2.3.5 Mô phỏng quá trình tách chiếc ADN của vi khuẩn Salmonella

typhimurium

Chu trình nhiệt PCR nhân gen invA

của Salmonella:

94 o C trong 2 phút,

lặp lại 35 chu kỳ.

Thiết kế mồi đặt hiệu bằng phầm mềm primer 3 plus cho gen invA của

Salmonella: Sản

phẩm PCR đặc hiệu chứa gen invA

có chiều dài khoảng 1350 bp. Hình 3.5 Vi khuẩn Salmonella typhimurium

3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng

kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ thủy sản tươi

Khẳng định Salmonella spp bằng kỹ thuật

PCR: gen invA (invasion) được khuếch đại

dựa trên trình tự các cặp mồi đặc hiệu

tương ứng

3.2 Bố trí thí nghiệm

3 Vật liệu và phương pháp

Hình 3.6 PCR.

3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ thủy sản tươi

3.2.4.1 Phương pháp phát hiện gen kháng kháng sinh bằng kỹ thuật m-PCR

Các gen blaTEM, blaSHV mã hóa kháng ampicillin;

gen strA, strB mã

hóa kháng streptomycin.

Các gen tetA, tetB

mã hóa kháng tetracycline và gen sul1, sul2 mã hóa

kháng sulfamethoxazole.

Bảng 3.1 Các mồi đặc hiệu cho từng gen kháng kháng sinh trong mPCR

Hình 3.7 Cơ chế tác động của kháng sinh vào tế bào vi khuẩn

+ Đệm 1X.

+ 0,2 mM dNTP; 1,5

mM MgCl2.

+ AmpliTaq Gold.

3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ thủy sản tươi

3.2.4.1 Phương pháp phát hiện gen kháng kháng sinh bằng kỹ thuật m-PCR3.2.4.1.2 Chương trình khuếch đại trên máy Mastercycler (Eppendorf)

+ Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương

pháp điện di trên thạch agarose 1% ở điện thế

100V trong thời gian 30 phút

+ Kiểm tra kết quả bằng cách soi dưới đèn UV

visualizer

Hình 3.8 Máy PCR

Thời gian điện di là 35

- 40 phút ở 100 V và

100 mA.

Chương 4: KẾT

QUẢ VÀ THẢO

LUẬN

4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Salmonella

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1.2 Thảo luận

4.1 Tiến hành phân lập mẫu nghi ngờ nhiễm Salmonella

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Để có được kết

quả như mong

muốn:

Tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi

cấy.

Thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng

Môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấyđều phải được khử trùng.

Hình 3.5 Thử nghiệm sinh

H2S trên môi trường KIA.

Hình 3.6 Thử nghiệm urea. Hình 3.7 Thử nghiệm VP.

do hóa chất có vấn đề.

4.2.2 Thảo luận

4.2 Định dạng vi khuẩn Salmonella trong mẫu bằng các phản

ứng sinh hóa

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sau khi test phản ứng sinh hóa,

các phản ứng cho kết quả dương

tính thì khẳng định 100% mẫu bị

Salmonell

Các phản ứng sinh hóa cho kết quả âm tính hoặc có xảy ra hiện tượng lạ là do quá trình thao tác chưa chính xác hoặc do hóa chất

có vấn đề.

4.3.1 Kết quả

4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.3.2 Thảo luận

4.3 Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại PCR

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả sẽ

có những

sai lệch do: Quá trình thao tác Hóa chất tiến hành Thời gian Cách thức tiến hành

4.4.1 Kết quả

4.4 Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của

vi khuẩn Salmonella phân lập từ thủy sản tươi

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Mức độ vấy nhiễm Salmonella spp từ thủy hải sản tươi sống là 22,37%

Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella với ít nhất 01 loại kháng sinh (85,88%), từ

02 đến 05 loại kháng sinh (10,59%) và từ 06 đến 11 loại

4.4.2 Thảo luận

4.4 Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của

vi khuẩn Salmonella phân lập từ thủy sản tươi

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả sẽ

có những

sai lệch do: Quá trình thao tác Hóa chất tiến hành Thời gian Cách thức tiến hành

Chương 5: KẾT

QUẢ MONG

MUỐN VÀ KIẾN

NGHỊ

5.1 Kết quả mong muốn

5 KẾT QUẢ MONG MUỐN VÀ KIẾN NGHỊ

Xác định được vi khuẩn Salmonella trong mẫu cá tươi được mua ở chợ

nghi nhiễm bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học

Hình 5.1 Vi khuẩn Salmonella. Hình 5.2 Cá tươi.

5.2 Kiến nghị

5 KẾT QUẢ MONG MUỐN VÀ KIẾN NGHỊ

Để phòng tránh nhiễm trùng, vi khuẩn cần thói quen ăn

uống vệ sinh, an toàn

Để thịt tươi sống riêng biệt với rau và các thực phẩm

ăn sẵn khác

Nấu, bảo quản tủ lạnh, cấp đông thịt, gia cầm, trứng,

cá và các thực phẩm ăn tươi đúng cách

Lựa chọn thực phẩm có địa chỉ uy tín, rõ nguồn gốc xuất sứ để đảm bảo an toàn.

1 Truong, H A V., Nguyen, H K T., Chu, V H., & Huynh, Y H (2021) Antimicrobial susceptibility of Salmonella spp.isolated from raw meats at traditional markets in Ho Chi Minh city Ministry of Science and Technology, Vietnam, 8, 55–59 https://doi.org/10.31276/vjst.63(8).55-59.

2 S.K Eng, P Pusparajah, N.S Ab Mutalib, H.L Ser, K.G Chan, L.H Lee (2015), “Salmonella: a review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistance”, Front Life Sci., 8(3), pp.284-293.

3 Popa, G L., & Papa, M I (2021) Salmonella spp infection - a continuous threat worldwide Germs, 11(1), 88–96 https://doi.org/10.18683/germs.2021.1244.

4 Trương Phước Thiên Hoàng và Lê Phước Thọ 2023 Tài liệu thực hành kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm.

5 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2004)

6 Tôn Bảo Linh và Nguyễn Phan Thành 2019 Tài liệu thực hành sinh học phân tử.

7 Tortora GA (2008) Microbiology: An Introduction.

8 Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J., & De Keersmaecker, S C J (2012) Salmonella biofilms: An overview on occurrence, structure, regulation and eradication Food Research International, 2, 502–531 https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.01.038

9 Rahman, H S., Mahmoud, B M., & Othman, H H (2018a) A Review of History, Definition, Classification, Source, Transmission, and Pathogenesis of Salmonella: A Model for Human Infection Journal of Zankoy Sulaimani - Part A, 3 & 4, 11–20 https://doi.org/10.17656/jzs.10730

10 Adams, D.R., W.R Stensland, C.H Wang, A.M O'Connor, D.W Trampel, K.M Harmon, E.L Strait, and T.S Frana 2013 Detection of Salmonella Enteritidis in pooled poultry environmental samples using a serotype-specific real-time-polymerase chain reaction assay Avian Dis 57: 22–28.

11 Steve Yan, S., Pendrak, M L., Abela-Ridder, B., Punderson, J W., Fedorko, D P., & Foley, S L (2004) An overview of Salmonella typing Clinical and Applied Immunology Reviews, 3, 189–204 https://doi.org/10.1016/j.cair.2003.11.00.

12 Wang, M.; Zhang, Y.; Tian, F.; Liu, X.; Du, S.; Ren, G Overview of Rapid Detection Methods for Salmonella in Foods: Progress and Challenges Foods 2021, 10, 2402 https://doi.org/10.3390/foods10102402.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

THANK

YOU!