Khóa luận tốt nghiệp Hóa học: Chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc một số taxoid chính từ cành, lá thông đỏ (Taxus Wallichiana Zucc.) được trồng tại Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINHKHOA HÓA HỌC * 0 * KHOA LUẬN TOT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HOC Chuyên ngành : Hóa hữu cơ CHIẾT TÁCH, PHAN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

* (0 *

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HOC

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

CHIẾT TÁCH, PHAN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁU TRÚC

MỘT SÓ TAXOID CHÍNH TỪ CÀNH, LÁ THÔNG ĐỎ

(TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) ĐƯỢC TRONG TẠI

LÂM ĐÒNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Công Luận

Người thực hiện: Châu Thị Nhã Trúc

`

| ¡!-HỌC Su-Phae

| TP HO-CHI-MINA

Thành phố Hồ Chi Minh — 2010

thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Với tình cảm chân thành, em xin bày tó lòng biết ơn đến cô Th§ Dương ThịMộng Ngọc đã giúp đỡ động viên và chỉ day em những điều bô ích không chỉ những

kién thức chuyên môn mà còn ca những trai nghiệm cuộc sông.

Em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các thay cô khoa hóa của trường Daihọc Sư phạm thành phê Ho Chí Minh đã vun đắp kiến thức kinh nghiệm quý báu cho

cm trong suốt bôn năm đại học.

Cảm ơn anh Bủi Thế Vinh đã nhiệt tỉnh hỗ trợ, chi bảo cho em những kinh

nghiệm giúp em tim những tải liệu liên quan dé em có thé hoàn thành tốt bai khóaluận nảy Cám ơn chị Lâm Bich Thảo anh Lê Minh Triết đã tạo điều kiện thuận lợi.động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Cám ơn H2 cùng các bạn sinh viên lớp hóa 4C đã luôn ở bên an ủi va giúp đờ

tôi vượt qua những khó khăn trong bổn năm đại học và trong khoảng thời gian thực hiện dé tải này.

Cuối cùng con xin gới tình yêu thương đến những người quan trọng nhất đời

con Con xin cám ơn bố mẹ đã cùng con đi suốt quãng đường dai Cảm ơn bố mẹ va

hai thăng nhóc đã làm điểm tựa cho con vững bước trên con đưởng ma con đã chọn

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Châu Thị Nhã Trúc

Khỏa luận tốt nghiệp

BUA NT MUG SO DO BANG BIẾU, 00c Sen 002160200 8

CHƯỠNG 1: TONG QUAI 5 iaeonticssscccaeen G600) teiceceenractarsacucceraenet 9

Me vì PDH AT ARG TEN AIG P| Ot) | ÔÔÒÔỒÔÓÔỎ 9

2 Đặc điểm sinh hoc] 1], [3| [4] [13] [US peeeccccsesccssescscesesecssescsssececssessessaveeecesnssesesess 9

3:7 1ữ0ng phu ngHiÊn MD as sess yaa eseiscacnsnsanrvecoosasseensoayensangecnsnn gsvans (sectesadssasenervegnes 28

SPURL Cr ROL ECON DIRS aaa EE NN APE Onn TAROT Ree ORE 28

32 1ã wala pe: GR i ccscccsassceccasnnres: seascape cna hs apa 28

CESS LOSS ST 1 | a ee er 283u Sắc kí cội sÌlica;gel pha thaaGin:sicssseossscssseissvsitiassasossotaccassesewspiisevennsesacesmecnset 28

CHƯƠNG 3: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN ào crsereerreccccecersrcee 32

Khóa luận tốt nghiệp

———>—————~—=————>———

1 QUA 6 0TR CRG veskeaiiiiescebeesaaicotbcoeebeeopseaeseesoaoi 32

3 Kết quả lắc phản đoạn 52-22252119 E 11 2212102211111112 11111137 121152211 32

3:.Kết quả sắc kỉ cội điainm HP Ô i::v.<cc6c cóc 20000022 06cu 60 D26 0002466256 6616 32

4 Kết quả cõ lập các (aXoid - - 26-22 152 2 212 2322152314 7110221E 242-3322 pcvee 34

5, Biện giải cấu trúc các taxoid thu đưỢc . - 2-55 2 1111312110211 c12 1x12 36

SU Sa Bi CRE TH co k.bieuoseesndseeernionpeieisketsgiiigensasessae 36

TAI METERS THAM RA seccccikibcc2á6000000x0G2220/AA010 44G124G3G0uAE 49

VCR L1 0l, 504) a 49 FAT LIEU: TIENG ‘(ANH igs ss nares ee sono (004602000206 aes 50

Khóa luận tot nghiệp

q: Quartet, mũi bon

m: Multiplet, mũi đa

J: Hang số ghép spin

NMR: Nuclear Magnetic Resonance, cộng hướng tử hat nhân

DEPT; Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

HSQC: Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HMBC: Heteronuclear Multiple Bonds Correlation

COSY; Correlation Spectroscopy

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU

Theo thông kê của tô chức y tế thé giới WHO trong năm 2004, thé giới cd

khoảng 7.4 triệu người chết vi căn bệnh ung thư (chiếm 13% tổng số người tử vong)

va con số nảy có thé tăng lên 12 triệu trong năm 2030 [21] Trong khi đó các nhà khoa

học đã phát hiện tác dụng chữa bệnh của một số hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên, một trong số đó là hợp chất Paclitacxel (có tên thương mại là taxol), được phân lập lần

dau tiên từ vỏ của loài Taxus brevifolia Nutt (Thông đỏ Thái Binh Dương) vào năm

1971 bởi Wani va Wall cùng cộng sự [23] Hiện nay, hai được phẩm được sử dung nhiều và hiệu quả nhất trong điều trị ung thư buông trứng, ung thư vú, ung thư phổi là:

Paclitaxel (Taxol công ty Bristol Myers Squibb-Mỹ) va Docetaxel (Taxotere`, công

ty Sanofi-Aventis-Phap) Do co gia trj kinh té cao, Thông đỏ bị lạm dụng khai thác,

đặc biệt là ở vùng Himalaya và Trung Quốc, nguồn dược liệu thiên nhiên này trở nên

khan hiếm, bị de doa tuyệt chủng [23] Mỹ va một số nước Châu Âu đã thành công

trong việc sản xuất taxol nhưng lại chiết từ vỏ cây Công nghệ nay sẽ lam cây nhanh lão hóa và gây cạn kiệt nguồn cung cấp Theo thông kê, cứ 10.000 kg vỏ cây Thông đỏ

Taxus brevifolia thì sẽ phân lập được | kg taxol, tức là phải đến hơn sáu cây Thông đỏ

mới cung cấp đủ nhu cẳu cho một bệnh nhân [24] Từ nhu cẩu thực tế ngảy cảng ting

ma nguồn nguyên liệu ngày cảng cạn kiệt, các nha nghiên cứu phải tìm những nguồn nguyên liệu thay thể, hoặc nuôi cấy mô, hoặc bán tổng hợp taxol từ những tiễn chất có

nhiều trong các loài cây Taxus Và theo hưởng ban tổng hợp, người ta đã tìm ra một số

phương pháp ban tổng hợp taxol tir những tién chất taxoid được tìm thấy trong cảnh và

lá Thông đó như hợp chat 10-Deacety! baccatin III (10-DAB) [24] và baccatin III [25]

Chinh vi vậy, taxoid được xem lả thành phân quan trọng trong các loài Thông đỏ mà ở

đó cảnh, lá tạo thành nguồn nguyên liệu chủ động và kinh tế trong việc sản xuất được

liệu chữa trị ung thư.

© Việt Nam tôn tại 2 loài Thông do là Thông do lả ngăn Taxus chinensis (Pilg.)

Rebd ở miễn Bắc và Thông đỏ lá dai Taxus wallichiana Zuce ở Lâm Đồng [26] Các

nghiên cứu ban dau cho thấy loi Thông đỏ mọc ở Lâm Đồng có giá tri cao hơn nhiều

Khóa luận tốt nghiệp

loai Thông đỏ lá ngân khi xem xét về hàm lượng các hợp chất chính trong lá

(10-Deacetyl baccatin IlI-tiền chất cho bán tổng hợp taxol) [34] Vì vậy, loài Taxus

wallichana cần được nghiên cứu sâu nhằm nâng cao tiểm nang cung cấp nguồn

nguyên liệu để sản xuất thuốc trị bệnh ung thư ớ Việt Nam Trong giới hạn của khỏa

luận, chủng tôi “Chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc một số taxoid chính từ

cành, lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zuec.) được trồng tai Lâm Đồng" dé gópphan vào việc nghiên cứu về loài cây Taxus wallichiana

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HINH ANH

Htit1.14 về q0 OS đÃácgav066 i86 saesrafoatnarnssssesenc 10

Hình 3.1: SKLM các phân đoạn sau khi qua cột điaion s-s~- 33

Hinh 3.2: SKLM các hợp chất đã được cô lập so với cao CH;C]; - 35

Hinh 3:4: Phd IR hợp chất TMM ) : ¿ s-. -—-s . 202222622222 0220 ae 26606, 37

Kiifb,3;/5: TA [MS Sueectitt (iu s2xesaitioxadpla4444611060020/060086.6646 38

Sn: |) || a uGSẰ=Ằ= 38Hinh 3.7: Tương tác HMBC của hợp chat T(Ll) cccscsccscesssessssessesessesesnenssssesecnes 42

Hinh 3.8: Tương tác HMBC của hợp chất T;([Ïl;.;) 5 555-555<55<scscsee 46

Khỏa luận tốt nghiệp

DANH MỤC SO ĐỎ, BANG BIEU

Sơ đồ

Sơ đô 3.1: Sơ đô điều chế cao MEOH sccsseessoeccsseencesssesssneecsussnseceyecsssecnonecsneecavecsenseect 32

Sơ dd 3.2: Sơ đồ điều chế các phân đoạn - -55-22s 220101132050 server 33

Sơ dé 3.3 : Quá trình cô lập các hợp chất TCH), T;(IH12.;) T;(IH1;.;) và TIM) 34

Bảng biểu

Bang 1.1 : Các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana - 20Bang 2.1: Kết quả kiểm tra các phân đoạn COT L 5555555662 29Bảng 2.2:Kết quả kiểm tra các phân đoạn của COT 2 ¿52525°5552c25<vcvsszec 30

Bang 2.3: Kết qua kiểm tra các phân đoạn của COT 3 s 555 552566 31

Bang 3.1: PhO UV của hợp chất TCLs) c.ccsscesssessssssessesenesnnnsnnsenensnessoesneasnensnneesnnes 36

Bang 3.3: Dữ liệu phd NMR của hợp chất T(111;) 655 525525scccssscre 38 Bang 3.3: Dữ liệu phỏ NMR của hợp chất T;(I1; ;) - 222 ©555<52sszsceeres 43

CHUONG I

TONG QUAN

Khoa luận tốt nghié Chương |) Tong quanP L4 7

CHUONG 1: TONG QUAN

1 Phân loại [1], [2], [H1], [12], [14]

lên khoa học; ?axus wallichiana Z.ucc.

[hông do lá dai (Taxus wallichiana Zucc.), họ Thanh Tùng (Taxaceae)

Vị trí cây Thông đỏ trong hệ thông phân loại thực vật:

Giới (kingdom): Plantae.

hunnewelli, Taxus jortunei, Taxus sumatrana (Thông đỏ Sumatra), Taxus wallichiana

Zuce, (Thông đỏ Himalaya).

2 Đặc điểm sinh hoe{1], [3], [4], [13], [15]

Thông đỏ lá dài là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kich thước trung binh

hoặc nho, chậm lớn (cây sinh trưởng cả tram năm chỉ có đường kính không quá 35

cm).

Chiều cao: 20-30 m; đường kinh ngang ngực: 1-1.5 m

Cây mọc đứng.

Khóa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan

Cành: Xòe rộng, cành non màu lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc phân tán tùy theo điều kiện môi trường.

Vỏ cây: Phía ngoài màu nâu đỏ nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mảng hay

từng tắm nhỏ, thịt màu nâu đỏ

Lá: Dài 1,5-2,7 cm và rộng 2 mm, dạng dải mác, thing, đôi khi hình lưỡi liém,

mém, xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuôn thành đính nhọn, gốc lá mọc

xuống, mép lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí xanhnhạt hơn ở hai bên gân giữa Lá của các chổi chính có thé mọc dựng lên hơn là xếp

Khóa luận tắt nghiệp Chương 1: Tông quan

bac Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Philippin, Việt Nam

O Việt Nam, loài này được tim thấy ở một số vùng nui cao thuộc các tỉnh Lao Cai

(Hoang Liên Son), Khánh Hoa, Lâm Đồng (Đà Lat, Don Dương Đức Trọng Lac

Duong ) Hà Giang (Thái An-Quán Ba), độ cao phân bố 1400-1600 m hoặc hơn

Sự phân bổ của Thông đỏ kha da dạng trong khu vực Lâm Đông, nhưng số

lượng cá thẻ ở mỗi nơi lại it, Số lượng ca thể nhiều nhất tại khu vực Nui Voi (100

cây ), tại đây cây không bị che phủ vả phát triển tương đổi tốt Ở những nơi bị che phủ

như I.án Tranh thi số lượng cả thé ít (1 cây) Có nơi cây lại gia cdi, chăng hạn như khu

vực Công Trời số lượng cá thé là 20 cây nhưng lại giả cdi, gan như không phát triển

nữu.,

4 Sinh thái

Pham vi độ cao: 2000-3500 m so với mặt biến.

Dạng rừng: Rừng nhiệt đới thưởng xanh.

Cây cảng lớn đòi hỏi ánh sáng cảng cao Trong tẳng ưu thé sinh thai, nơi nào có

khoảng trống, lượng ánh sáng nhiều thi cây phát triển mạnh và ngược lại.

Khí hậu: Nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung binh năm 20-25°C, độ ẩm đất

30-40%, độ im không khí 85-90% Thông đỏ phân bố ở vùng khí hậu nhiệt đới núi thấp

vả trung bình có 2 mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10, lượng mưa trung binh 1600-1800 mm (Tai liệu của Dai khí tượng-thủy văn Lâm Đồng,

Khỏa luân tốt nghiệp Chương |: Tổng quan

các loài Dinh tùng (Cephalotaxus mannii), Kim giao nam (Nageia wallichiana),

[hông tre lá dai (Podocarpus neriifolius), Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), Du

sam (Keteleeria evelyniana) va một số loài thuộc Fagaceae, Ericaceae,

Euphorbiaceae

Hat phat tan không xa (với ban kinh 6-8 m so với tir tâm cây); nảy mam va pháttriển nơi có độ âm cao, cường độ ánh sáng trung bình Ty lệ nay mam trong ty nhiên

rit tháp so với số lượng hạt cây mang hang nam

Lái sinh tự nhiên: Ít gặp, cây mâm vả cây non chịu bóng tốt

5 Các công trình nghiên cứu về loài Taxus wallichiana

Khoa luân tot nghiệp Chương |: Tông quan

Khỏa luân tốt nghiệp Chương |: Tong quan

(10)

(11) (12)

(II) R, = Rạ = Ry = R¿ = Rs = R; = OAc, Rg = H (12) Ry = Rg = OH, Ry = Ry = Ry = Rg = Ry = OAC

(13)- (15)

(13) Ryp = Rug = Rs = OH, Ry = H, Ry = OAc

(14) Rịa = Ry = Rag =R‹ = OH, R, = OAc

(15) Rig = Ry = Rag = Rs = OH, R; =H

Khỏa luận tốt nghiệp Chương |; Tổng quan

Khéa luận tốt nghiệp Chương |: Tong quan

eo '

ACOI i

(26) - (30)

(26) R, = R„ = OH, Ry = Ry = OAc, Ry = OBz, Ry = H

(27) R, = OH, Ry = Ry = Rs = OAc, Ry = OBz, Ry =H

Khóa luận tắt nghiệp Chương |; Tổng quan

Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: Tong quan

Khỏa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan

($1) Ry = Ry = R¿ = CH¡, R;y = H

(52) Ry = Rp = Ry = Rạ =OH

(33) (54)

Khỏa luận tốt nghiệp Chương |; Tong quan

H;ạC COOCH;,

ch,

($7)

Tên và nguồn tài liệu của các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana.

Bang 1.1 : Các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana

_ Hợp chất Tên hợp chất Tài liệu tham khảo

al (1995c) và

Chattopadhyay, Saha,

Kulshrestha, Sharma,

Kumar (19966)

3 1-Hydroxy-2-deacetyltaxinine J Zhang et al, (1995c)

_ 6 2°-Desacetoxyaustrospicatin Barboni et al (1994a)

Barboni et al (1994a) va

Khoa luận tot nghiệp Chương |: Tông quan

Paclitaxel (Taxol) (1994), Zhang et al.

(1995c), Singh et al.(1997) va Wang (1997)

Khỏa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan

(1997) và Wang (1997)

22 10-Deacetylcephalomanninc ˆ McLaughlin et al (1981)

Appendino et al (1992a),

23 14ƒ-Hydroxy- !0-deacetylbaccatin Il Bombardelli và Gabetta

| 32 Taxchinin H Barboni et al (1995b)

[3 | —— Taxayunin - “Zhang et al (1995c)

Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan

Hydroxymatairesinol Miller ct al (1982)

Isoliovil Miller et al (1982)

Parveen, Taufeeq, Khan

48 Ginkgetin (1985) va Qiu, Lian, Ma,

Qiu et al (1989) va Das

56 Vomifoliol Appendino ct al.(1993b)

§7 | JOrcinolcarboxylate Shrestha et al.(1997)

Khoa luận tốt nghiệp Chương 1: Tông quan

5.2 Trong nước

Năm 2005, Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất

tasoid chính từ lá vả vỏ thân của cây Thông đỏ lá dai thu hải tại Lam Déng bao gém :

10- dcacctylbaccaun II (10-DAB) (15), 19-hydroxybaccatin III (14), paclitaxel

(Taxol) (17) với hiệu suất lân lượt là 0,05-0,1% 0,02-0,04% và 0,005-0.01% trong lá

va 0,006% trong vo thin, 7-xyloside-10-deacety! taxol C (20) với hiệu suất là

0.1-0 5% trong vo thân [28] |20].

Trong năm 2008, từ la Thông đỏ được thu hai tại tỉnh Lam Đông nhóm tác gia

trên dd đã khảo sát các quá trình chiết tinh dầu dưới tác dụng của sóng siêu âm va vi

sóng Thanh phân tỉnh dầu được xác định bằng sắc kỷ khi va sắc kỷ khí kết hợp khốipho Trong đó các cấu tử bay hơi đặc trưng cho tinh dau của các loài Thông đỏ như(Z)-3-hexen-I-ol va I-octen-3-ol có hiệu suất cao nhất (35,98%; 5,60%) khi sử dụngphương pháp chiết bằng vi sóng trong điều kiện không có nước [5]

Cũng trong năm này, Nguyễn Hữu Toàn Phan va cộng sự đã phân lập được

taxol (17) và cephalomannin (21) Cả hai hợp chất trên có hoạt tính gây độc tế bảo trên

các dòng ung thư gan Hep-G2 rất mạnh với giá trị IC50 (ug/ml) lần lượt là 0,072 và

0,065 [6|].

Năm 2008, tại trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM, Tiến sĩ Trần Công Luận

cùng cộng sự đã xác định được các đặc điểm vi học của lá và cảnh Thông đỏ, các thánh phần hóa học chính như: Alkaloid, saponin, taxoid và xác định cấu trúc của 10-

DAB, tiên chất của taxol bằng cách áp dụng các phương pháp phân tích vi học, thành phân húa thực vật bằng các phản ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng chiết tách

bảng kỹ thuật lóng-lỏng long-rin và xác định cau trúc của 10-DAB bằng các kỳ thuậtphỏ.|27|

Cũng tại diy, Nguyễn Ngọc Song Trâm củng cộng sự đã xây dựng thành congquy trình định lượng 10-DAB va taxol trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)bảng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao Với quy trình định lượng dé xuất, có thé áp

tJ wv

Khoa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan

ee SSS ee

dụng định lượng 10-DAB va taxol trong mau, từ đó có thê so sánh, đánh giá sự khácbiệt vẻ ham lượng 2 taxoid chính yêu nảy trong các nguôn nguyên liệu khác nhau [9|

Năm 2008, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết cùng cộng sự đã khảo sát môi quan hệ di

truyền va ham lượng 10-DAB của một số cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) tại

Lâm Đồng Với đối tượng nghiên cửu là 7 mẫu Thông đỏ Lam Đồng (Taxuswallichiana Zucc.) và 1 mẫu Thông dé lấy ở Hòa Binh (Taxus chinensis (Pilg.) Rebd.).Định lượng 10-DAB bang phương pháp sắc ký lớp mỏng ghép quang phó Phân tích

dau hiệu di truyền 8 mẫu bằng kỹ thuật RAPD vả thiết lập mỗi quan hệ di truyền bing

NTSYS Nhóm nghiên cửu đã đưa ra kết quả là tí lệ phần tram ham lượng 10-DAB

trong các mẫu biến đổi, cao nhất là mẫu NV4 (0,205 %), thắp nhất là mẫu NV3 (0,029

%) Sự tương đồng giữa các mẫu thông được khảo sát nằm trong khoảng tir 0.41 đến0,73 Với 10 môi được sử dụng, thi hai môi OPF-14 vả OPP-8 cho kết qua với băng

điện di rd và đa hình cao | 10].

26

CHƯƠNG 2

THỰC NGHIỆM

Khóa tuân tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

1 Nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu là lá và cảnh của cây Thông đỏ (Taxus

wallichiana Zuec.) được trồng ở Lâm Đông đo trung tâm trông và chế biển cây thuốc

Da Lạt cung cấp Sau khi thu hai, mẫu được phơi khô vả xay thành bột

2 Điều kiện thực nghiệm

2.1 Hóa chất

: Methanol (Merck, Trung Quéc)

Dichloromethane (Trung Quéc)

Petroleum ether (Trung Quéc)

Acetone (Trung Quốc )

Chloroform (‘Trung Quéc)

l Sulfuric acid (Trung Quốc)

ˆ Nước cắt hai lần

ˆ Ethanol

- Silica gel G 0,06-0,02mm (Merck).

- Nhựa Diaion HP-20 (Missubishi).

2.2 Trang thiết bị

= Tủ say KC-65, tủ say chân không VWRS/P

Cân phân tích Meltler Toledo AB- 204.

Dén soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE, Máy cô quay BUCHI R-114.

Máy anh kĩ thuật sé

May siéu ấm [:Ìma LC 60H (Đức).

liếp cách thủy Memment (Đức),

- Cot sắc ki kich thước : 6 cm x 60 cm, 3 cm x 60 cm, 2 cm x 40 cm

27

Khóa luận tot nghiệp Chương 2; Thực nghiệm

— ———>ề>>>—_—_—_—~—_——memm===mi

Bình phun thuộc thử.

Binh triển khai sắc ki

'ù sấy

z Máy sắc kí điều chế C-18 Star-chrom (Mỹ).

Ban nhôm tráng sẵn, loại silicagel 60 Fz, (Merck)

May do diém chay: STUART SMP3

May do IR: Shimadzu FTIR-8201 PC.

- Máy do UV: He2ios y Thermo Spectronic (UNICAM-UK).

- Máy ghi phổ cộng hướng tử hat nhân: AVANCE 500 BRUKER [500 MHz ('H)

va 125 MHz ("'C)}, do trong CDCI3 & MeOD với tetramethyl! silan (TMS) lam chấtchuẩn nội

3 Phương pháp nghiên cứu

Dùng | kg cao MeOH thô hòa với 1 | nước rồi lắc với đichloromethane (khoảng

12 1), sau khi cô giảm áp dịch dichloromethane ta thu được 200 g cao CH;C]; (độ im

7,2%).

3.3 Sắc kí cột diaion HP-20

Nạp 12 g cao CH;C]; vào cột diaion, rửa giải lần lượt với các dung môi ; Nước

(1 1), MeOH 20% (2,5 1), MeOH 60% (8 1), MeOH 80% (3 1), MeOH! 100% (3 1).

3.4 Sắc kí cột silica gel pha thuận

Phân đoạn McOH 60% (phân đoạn 11) được chọn đê tiếp tục nap cột silica gel

Khóa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm

CO giảm áp dịch ở phân đoạn McOH 60% thu được 2,5 g cao.

a) SKC silica gel phan doan 60% (2.5 g) với hệ dung mỏi giải li PE-:acetone

có độ phân cực tang dan (100% PE -+ 9:1 -+ 8:2 — 7:3 — 5:5 —+ 100% acetone), dựatrên SKLM hiện mau băng dung dịch HạSO; 10%/FtOH thu được 3 phan đoạn (III, 3) vả một chất kết tinh T(111) (ghi khôi lượng lun nha)

Sứ dụng cột sắc kí với các thông số sau (COT 1): Chất hap phy: Silica gel 60Fas, (100 g).

Dé kiểm tra thành phân tách của các phân đoạn hứng trong quá trình chiết tách,

chúng tôi ding SKLM, khai triển với hệ dung mỗi: CHCI;:MeOH (9:1) Thuốc thửphát hiện là H;SO, 10% /EtOH, phun sấy 110°C trong 5 phút

Khéa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm

Sau khi qua cột silica gel phân đoạn MeOH 60% của cây Thông đỏ tách được

một chất sạch T(II1), và tách thành những phan đoạn tập hợp qua đó cũng loại được một lượng lớn tạp màu Dé phân lập được đơn chat, phải tiếp tục tách va tỉnh chẻ các

phân đoạn tiếp theo

b) Tiếp tục tiền hanh SKC silica gel phân doan II; (0.5 g) với hệ dung môi CHCÌy:MeOH có độ phân cực ting din (100% CHCl, —= CHCI;:MeOH 100:5), các

đoạn giếng nhau trên SKLM được gom chung thu được ba phân đoạn lI;.; HI;;, Hạ.

3-Sử dụng cột sắc kí với các thông số sau:

- Chat hap phụ: Silica gel 60 Fy, (60 g)

Phân đoạn III;.; có hai vét chính tiếp tục tiến hành SKC silica gel pha dao với

hệ dung môi MeOl I;] |;O (40:60).

Sử dung cót sắc kí pha dao trên máy MPLC điều chế Thông sô cột sắc kí:

- Tốc độ dòng: 5ml/phủt.

30

Khỏa luận tỏt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm

- Lhẻ tích mỗi phân đoạn: 30 ml.

: Tông số phân đoạn: 12

- Hệ dung mỗi: MeOH: HO (ti lệ 40:60).

- Đầu do: UV 250 am.

Sau khi qua cột sắc kí pha đảo trên máy MPLC điều chế, chủng tôi cô lập được hai chất tỉnh sạch kí hiệu là T;(IH1;.;) (3 mẹ), T;(111.;) (10 mg).

c) SKC silica gel phân doan III, (0,8 g) với hệ dung môi CHCI,;:MeOH có

độ phân cực tang dẫn ( 100% CHC];—+ CHC];:MeOH 95:5), thu được kết tinh tring, kí

hiệu T(111;) (180 mg),

Sử dụng cột sắc ki với các thông sé sau:

Chat hap phy: Silica gel 60 Fs, (60 g)

CHƯƠNG 3

KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN