Chiết tách phân lập và xác Định cấu trúc một số taxoid chính từ cành lá thông Đỏ taxus wallichiana zucc Được trồng tại lâm Đồng

Trong khi đó các nhà khoa học đã phát hiện tác dụng chữa bệnh của một số hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên, cđầu tiên từ võ của loài Taxus brevifolia Nut.. phương pháp bản tổng hợp ta

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

"TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHÓ HỎ CHÍ MINH

LAM DONG

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Công Luận

Người thực hiện: Châu Thị Nhã Trúc

Thành phố Hồ Chí Minh 2010

Khóa luận ổt nghiệp

kiển thức chuyên môn mà còn cả những trải nghiệm cuộc sống

Em cũng xin gửi loi cám ơn sâu sắc đến các thầy cô khoa hóa của trường Dại

học Sư phạm thành phổ Hỗ Chí Minh đã vun đắp kiển thức, kinh nghiệm quý báu cho

em trong suốt bổn năm đại học

Cảm ơn anh Bủi Thế Vinh đã nhiệt tỉnh hỗ trợ, chỉ bảo cho em những kinh nghiệm, giúp em tìm những tải liệu liên quan để em có thể hoản thành tốt bải khóa

luận nay Cảm ơn chị Lâm Bích Thảo, anh Lê Minh Triết đã tao điều kiện thuận lợi động viên em trong suốt thời gian thực hiện khỏa luận này

Cảm ơn H2 cũng các bạn sinh viên lớp hóa 4C đã luôn ở bên an ủi và giúp đỡ

tôi vượt qua những khó khăn trong bốn năm đại học và trong khoảng thời gian thực hiện để tai nay

im tựa cho con vững bước trên con đường mã con đã chọn

“Xin chân thành cảm ơn! Tác giả

“Châu Thị Nhã Trúc

MỤC LỤC

LOLCAM ON, “ cia _.-

DANI MUC CAC TU VIET TAT

3.4, Sie ki cOt silica gel pha thuận cceceeeeerririrrrree 28

5.2 Hợp chất T;(III;)

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 49 TÀI LIỆU TIÊNG ANH |

DANH MUC CAC TU VIET TA’

COSY: Correlation Spectroscopy

LỜI MỞ ĐẦU

Theo thống kê của tổ chức y tế thể giới WHO trong năm 2004, thể giới có

vi căn bệnh ung thư (chiếm 13% tổng số người tử vong)

nảy có thể tăng lên 12 triệu trong năm 2030 [21] Trong khi đó các nhà khoa

học đã phát hiện tác dụng chữa bệnh của một số hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên,

cđầu tiên từ võ của loài Taxus brevifolia Nut (Thing đỏ Thái Bình Dương) vào năm

1971 bởi Wani và Wall cùng cộng sự [23] Hiện nay, hai được phẩm được sử dụng

nhiễu và hiệu quả nhất trong điều trị ung thư buồng trửng ung thư vú, ung thư phối là:

Paclitaxel (Taxol®, céng ty Bristol Myers Squibb-Mỹ) và Doeetaxel (Taxolere", công

ty Sanofi-Aventis-Pháp) Do có giá trị kinh tế cao, Thông đỏ bị lạm dụng khai thác, khan hiếm, bị đe dọa tuyệt chủng [23] Mỹ và một số nước Châu Âu đã thành công trong việc sản xuất taxol nhưng lại chiết từ vỏ cây Công nghệ này sẽ lâm cây nhanh

lão hóa và gây cạn kiệt nguồn cung cấp Theo thống kê, cứ 10.000 kg vỏ cây Thông đỏ

Taxus brevifolia thì sẽ phân lập được 1 kg taxol, tức là phái đến hơn sáu cây Thông đỏ mới cung cấp đủ nhu cẳu cho một bệnh nhân [24] Từ nhu cầu thực tế ngày cảng tăng ngây cảng cạn kiệt, các nhả nghiên cứu phải tìm những nguồn nguyên liệu thay thẻ, hoặc nuối cấy mô, hoặc bán tổng hợp taxol từ những tiễn chất có phương pháp bản tổng hợp taxol tir những tiễn chất taxoid được tìm thấy trong cảnh và

14 Thông đồ như hợp chất 10-Deacetyl baccatin II (10-DAB) [24] va baccatin 111 [25] Chính vì vậy, taxoid được xem l thành phin quan trọng trong các loài Thông đỏ mà ở

mà nguồn nguyên

đỏ cảnh, lá tạo thành nguồn nguyên liệu chủ động và kinh tế trong việc sản xuất dược

liệu chữa trị tung thư

© Việt Nam tôn tại 2 loài Thông đỏ là Thông dé 1a ngin Taxus chinensis (Pilg.) RRebd, ở miền Bắc và Thông đỗ lá dài 7øxue walichiana Zuec ở Lâm Đồng [26] Các

nghiên cứu ban dau cho thấy loài Thông đỏ mọc ở Lâm Đồng có giá trị cao hơn nhiều

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1,]:1.á và quả thông đỏ

Hình 3.1: SKIM các phân đoạn sau khi qua cột diaion

Hinh 3.2: SKILM cúc hợp chất đã được cô lập so với cao CHỊ;Cl,

Khóa luộn tốt nghiệp

DANH MỤC SƠ ĐÒ, BẢNG BIÊU

Sơ đỗ

Sơ dỗ 3.2: Sơ đỗ điều chế các phân đoạn eeseeeieeorreoee 3

Sơ đỗ 3.3 : Quá trình cô lập các hợp chất TỊIHI), T,(IH22) TẠ(IIl;;) và TỊNH) 34

Băng biểu

Bảng 1.1 : Các hợp chất được cõ lập tử loài Taxus wallichiand 20 Bảng 2.1: Kết quả kiểm tra các phân đoạn CỘT l Hư = Bảng 2.2:Kết quả kiểm tra các phân đoạn của CỘT 2 30

Bang 2.3: Két quả kiểm tra các phân đoạn của CỘT 3 — „31

Bảng 3.1: Phổ UV của hợp chất TỰHI]) 36 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TỰIII,) 38

Bảng 3.3: Dữ liệu phỏ NMR cúa hợp chất T;(1II;) — 43

CHUONG 1

TONG QUAN

CHUONG 1: TONG QUAN

1 Phan loai [1], [2], [11], [12], [14]

Tn khoa hoe; Taxus wallichiana Zuce

Thông đỏ lá đãi (Taxus wallichiana Zuec.), họ Thanh Ting (Taxaceae) 'Vị trí cây Thông đó trong hệ thông phân loại thực vật

Giới (kingdom): Plantae,

Nganh (division): Pinophyta

celebrica, Taxus chinensis (Thing 46 Trung Quéc), Taxus cuspidata Zucc (Thông đò

‘hunnewelli, Taxus jortunei, Taxus sumatrana (Thong dé Sumatra), Taxus wallichiana

Zuce, (Thong 49 Himalaya)

Chiễu cao: 20-30 m: đường kinh ngang ngực: 1-1,5 m Cây mọc đứng

Cành: Xòe rộng, cảnh non màu lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc

phân tán tùy theo điều kiện môi trường

'Võ cây: Phía ngoài màu nâu đỏ nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mắng hay

từng tắm nhỏ, thịt màu nâu đỏ

Lá: Dài 1,5-2,7 cm và rộng 2 mm, dạng dải mác, thẳng, đôi khi hình lưỡi liễm,,

mềm, xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuôn thành đính nhọn, gốc lá mọc xuống, mép lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí xanh nhạt hơn ở hai bên gân giữa Lá của các chồi chính có thể mọc dựng lên hơn là xếp

đây

Nón: Phân tính khác gốc Nón cái đơn độc, có một hạt và được bao quanh

nhưng không bao kín bằng lớp áo hạt màu đỏ, chín trong I năm Nón đực tạo thành hàng ở nách lá, nhỏ, hình trứng, dài 6 mm và rộng 3 mm, nhưng không có cuống hoặc

‘bie Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Phil

© Vigt Nam, loai này được tìm thấy ở một số vùng nủi cao thuộc các tỉnh Lio Cai

(ioàng Liên Sơn), Khánh Hỏa, Lâm Đông (Đà Lạt Đơn Dương Đức Trọng Lạc Đươn ) Hã Giang (Thái An-Quán Ba), độ cao phân bổ 1400-1600 m hoặc hơn

Pham vi d cao: 2000-3500 m so với mặt biển

Dạng rừng: Rứng nhiệt đới thường xanh

iy cảng lớn đôi hỏi ánh sáng cảng cao Trong tẳng tu thể sinh thái nơi nào có

khoảng trắng, lượng ánh sáng nhiễu thì cầy phát triển mạnh và ngược lại

'Khí hậu: Nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 20-25°C, độ ẩm đất 30-

40%, độ ẩm không khí 85-90% Thông đỏ phân bố ở vùng khí hậu nhiệt đới núi thắp

và trung bình có 2 mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa kéo dải từ tháng 4 đến tháng 10, 1980)

Thổ nhưỡng: Thích hợp với đất có thành phẫn cơ giới nhẹ, thoát nước, phát

n thạch hay đất nấu đó trên đất bazan, d6 plt đất dao động

là kim, Trong kiểu thảm này chúng phân bổ ở tằng uw thé sinh thd hop với

Khỏa luận tỗi nghiệp Churomg 1: Tang quan

ie loai Dinh ting (Cephalotaxus mannii), Kim giao nam (Nageia wallichiana),

sam (Keteleeria evelymiana) vi mgt sb loài thude Fagoceae, Ericaceae, Euphorbiaceae,

Hot phat tan không xa (với bán kính 6-8 m so với từ tâm cây); nảy mắm và phát triển nơi có độ âm cao, cường độ ảnh sáng trung bình Tỷ lệ nãy mam trong ty nhiên tất thắp so với số lượng hại cây mang hàng năm

Tái sinh tự nhiên: Ít gặp, cây mẫm vả cây non chịu bóng tốt

5 Cúc công trình nghiên cứu về loài Taxus wallichiana

“hỏa luận tố nghiệp Chương Ì: Tẳng quan

(OR, R= y= Ry" ORG Ry Ry“

(DR, = Ry Re=H, Re =Ry= Ry = OAC

Me

be

(16) Rip Rs OH, Ry = OBE (17) Rip ~ OH Ry“ OAc Ry - Be

(18) Rip» O-xylosy, Ry ~ OH, Ry = OB

(19) Rip - Oaylosyl Ry ~ OAC, Ry ~ OB

rn

0) ike

Khỏa luận tắt nghiệp

Khỏa luận tẳt nghiệp Chương 1: Tẳng quan

5 T-Hiydroxy-2-deacetyltaxinine J hang eial (19959)

6 | _ 2 -Desacetoxyaustrospicatin Barboni et al (1994a)

Barboni etal (1994a) vi

7 7.2'-Didesacetoxyaustrospicatin Zhang, Fang, Liang, vi

— Miller, Powell, Smith, (r), Amold, và Clardy 19-Debenzoyl-19-acetyltaxinine M

(1994), Zhang et al (1995) Singh et al (1997)

và Wang (1997) 10-Deacetylbaccatin 111

10-Deaeetyltaxol và Wang (1997)

Miller et al (1981),

‘Vander Velde et al

Paclitaxel (Taxol) (1994), Zhang et af

7-Xylosyltaxol Thang et al (1995e)

| Zhang et al, (1995e) vi

Chattopadhyay et al (1996a, 1997)

7-Xylosyl-10-deacety taxol C

(1994), Zhang et al (1995¢), Rao et al (1996), Singh et a 'Cephalomannine

10-Deacetylcephalomannine MeLaughlin (1997) va Wang (1997) et al (1981)

14-Hydroxy-]0-deacetylbaccatin III ‘Appendino et al (1992a), Bombardelli va Gabetta

28 10-Debenzoyl-2-a-acetoxybrevifoliol Barboni et al, (1995b)

: ‘Appendino et al (1993a)

| 29 7-Deacetoxy-10-debenzoylbrevifolio! ‘vA Barboni etal, (1993)

‘Appendino etal (19934)

30 10-Debenzoylbrevifoliol ‘vi Barboni etal (1993)

etal (1996b)

32 [axchinin H Barboni et al (1995b)

37 7.9,13-Deacetyl abeobaceatin IV Kulshrestha, Sharma, và ‘Chattopadhyay Saha,

Roy (1997) 10,15-Epoxy-11(15—+1jabeo-10-

38 msenviredirfT ‘Appendino etal (1993e)

Parveen, Taufeeg, Khan

48 Ginkgetin (1985) và Qiu, Lian, Ma,

[E1 Deglycosylicariside By Appendino et al.(1993b)

55 | - Dehydrovomifoliol | Appendino etal(19930)

57 J-Orcinolearboxylate ‘Shrestha et al (1997)

(6008, OIL.R; R, < Ry = He Ry = Ra = Ry" ONE

(61) Ry Ry Ree Ry “ONE Ry = Ry = Ryo HE

(59) 24.9a,15-Triacetoxy-1 (15—+1 jabeotaxa-4(20).1 I-diene-5a,7B, 108, 13a- tetrao! [17

(60) 9a,10).134-Triacetoxy-1 1(15—+1 jabeotaxa-4(20).| |-diene-Sa,15-diol

(171

(61) $4.94, 10,1 34-Tetracetoxy-1 (15—+1 abeotaxa-4(20).1 1-diene-15-ol [18]

24

Trong năm 2008, từ lá Thông đỏ được thủ hải tạ tỉnh Lâm Đẳng, nhóm tác giả trên đã đã khảo sát các quá trình chiết tinh đầu dưới tác dụng của sóng siêu ẩm và vỉ phổ Trong đó các cầu tử bay hơi đặc trưng cho tỉnh dẫu của các loài Thông đỏ như (Z/-3-hexen ol và I-octen-3-ol có hiệu suất cao nhất (33,98%; 5,60%) khi sử dụng phương pháp chiết bằng vỉ sóng trong điều kiện không có nước [5]

Nam 2008, tại trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM Tiển sĩ Trần Công Luận

cùng công sự đã xác định được các đặc điểm vi học của lá và cảnh Thông đỏ, các

DAB, tién chất của taxol bằng cách áp dụng các phương pháp phản tích vi học, thành

bảng kỹ thuit long-long, long-rin và xác định cấu trúc của 10-DAB bằng các kỹ thuật phê|27|

“Cũng tại đây, Nguyễn Ngọc Song Tram cũng cộng sự đã xây dựng thành công quy trình định lượng 10-DAB va taxol trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zuce,)

bảng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu nâng cao Với quy trình định lượng để xuất, có thể áp

dung định lượng 10-DAB

biệt về hàm lượng 2 taxoid chính yêu này trong các nguồn nguyên liệu khác nhau [9] taxol trong mẫu, từ đồ có thê so sánh, đánh giá sự khác

Năm 2008, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết cùng cộng sự đã khảo sát mỗi quan hệ di

truyền và him lượng 10-DAB của một số edy Thing d6 (Taxus wallichiana Zuce.) tai

Lâm Đồng Với đối tượng nghiên cứu là 7 mẫu Thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zuee.) và 1 mẫu Thông đỏ lấy ở Hỏa Binh (Taxws chinensix (Pils.) Rebd,)

Dinh lượng 10-DAI bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ghép quang phổ Phân tích dẫu hiệu di truyền 8 trẫu bằng kỹ thuậi RAPD và thiết lập mỗi quan hệ dĩ truyễn bằng

trong các mẫu biến đổi, cao nhất là mẫu NV4 (0,205 %), thấp nhất là mẫu NV3 (0,029

4%), Si lương đồng giữa các mẫu thông được khảo sát nằm trong khoảng từ 0,41 đến điện di rõ và đa hình cao [10]

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

1 Nguyên

Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu là lá và cảnh của cây Thông đỏ (Tavus

wallichiana Zuce,) được tring ở Lâm Đẳng do trung tâm trồng và chế biển cây thuốc

Đã Lại cung cấp Sau khi thụ hái, mẫu được phơi khô và xay thành bột

3 Điều kiện thực nghiệm

2.1 Hóa chất

= Methanol (Merck, Trung Quéc)

Dichloromethane (Trung Quéc)

Petroleum ether (Trung Quốc)

Acetone (Trung Quốc )

= Chloroform (Trung Quéc)

Sulfuric acid (Trung Quốc)

= Nuée edt hai tin

- Ethanol

+ Silica ge! G 0,06-0,02mm (Merck)

~_ Nhựa Diaion HP-20 (Missubishi)

3.3 Trang thiết bị

- Tủ sây KC-65, ti say chân không VWRSIP

Can phan tich Meltler Toledo AB- 204

Dén soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE

2

‘Binh phun thuốc thử

Bình triển khai sắc kỉ

- — Ty

= May sắc kí điểu chế C-18 Star-chrom (Mỹ)

+ Ban nhôm trang sin, logisilicagel 60 Foss (Merck)

May đo điểm hay: STUART SMP3,

May do IR: Shimadzu FTIR-8201 PC

= Miy do UV: Hehios y Thermo Spectronic (UNICAM-UK)

= May ghi phổ cộng hưởng tir hat nhiin: AVANCE 500 BRUKER [500 MHz.('H)

va 125 MHz ("°C)}, do trong CDCI3 & MeOD với tetramethyl silan (TMS) lim chất

Dũng 1 kg cao MeOH thô hỏa với 1 I nước rồi lắc với đichloromethane (khoảng

12 1), sau khi cỗ giảm áp địch dichloromethane ta thu được 200 g cao CH;Cl; (độ ẩm 7.2%)

‘CO gam áp địch ở phân doan MeOH 60% thu được 2,5 g cao a) _ SKC siliea gel phân đoạn 60% (2.5 g) với hệ dung mỗi giải lỉ

cỏ độ phân cực tăng đẫn (100% PI: ~+ 9:1 -+ 8:2 + 7:3 + 5:5 —+ 100% äcetone) dựa

3) vả một chất kết tỉnh TIII) (ghi khỏi lượng lun nha),

- Thể tích mỗi phân đoạn: 40 ml

= Ting sd phân đoạn:92

gel: 40 em,

ĐỀ kiểm tra thinh phn tich ciia cdc phân đoạn hứng trong quả trình chiết tách,

chúng tôi dùng SKLM, khai triển với hệ dung mỗi: CHCI;;MeOH (9:1) Thuốc thử

phát hiện là H;SO, 10% /EtOH, phun sly 110°C trong 5 phút

‘Bang 2.1: Kết quả kiểm tra các phân đoạn COT 1

dung méi |Phẩnđoạn| Phân

eae PE:acetone tậphợp | đoạn mạ¿ | Thành phần tách | Ghi chú

‘Sau Khi qua cột silica gel phân đoạn MeOH 60% của cây Thông đỏ tách được một chất sạch T(II), và tách thành những phần đoạn tập hợp qua đó cũng loại được

phân đoạn tiếp theo

b) _ Tiếp tục tiễn hành SKC silica gel phan đoạn III; (0.5 g) với hệ dung môi CHCI:MeOH cỏ độ phản cực tăng dẫn (100% CHCI, — CHCI;MeOH 1005), các

Sử dụng cột sắc kí với các thông số sau

[tos Tihs | 40-67 | 025— | 20a tap

Phin dogn Ills có hai vết chính tiếp tục tiển hành SKC silica gel pha đáo với

hệ dung môi MeOlI:,O (40:60)

Sử đụng cit sic ki pha dio trên máy MPILC diễu chế Thông số cật sắc kí

* Tốc độ dòng: 5ml/phút

= TRE tich moi phan đoạn: 30 mi

s Tông sổ phân đoạn: 12

+ Hg dung môi: MeOHLII,O (lệ 40:60)

= Diu dé: UV 250 am

Sau khi qua cột sắc kí pha đảo trên máy MPI.C điều chế, chủng tôi cô lập được

ai chất tỉnh sạch kí hiệu là T.(111;2) (3 mạ), T;(111;2) (10 mg)

©) SKC silica gel phân đoạn IIl; (0,8 g) với hệ dung môi CHCI:MEOH có

độ phân cực tăng dẫn (100% CHCH,~+ CHCI;:MeOH 95:5) thu được kết tính trắng, kí hiệu T(III,) (180 mẹ),

Sử dụng cột sắc kí với các thông số sau:

= Chat hip phụ: Siiea gel 60 E;s (60 g),

oss TH) | 10-25 | 20mg

s 955 HH; | 4067 T 0258 L prin eve “Những vết khả

CHƯƠNG 3

KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN