Chiết tách, phân lập andrographolide từ xuyên tâm liên (andrographis paniculata) sản xuất chất kiểm định các loại thực phẩm có chứa andrographolide báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP ANDROGRAPHOLIDE TỪ XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata) SẢN XUẤT CHẤT KIỂM ĐỊNH CÁC LOẠI THỰC PHẨM CÓ CHỨA ANDROGRAPHOLIDE Mã số đề tài: 19.2TP01 Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN NGỌC TUẤN Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Chiết tách, phân lập andrographolide từ xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) sản xuất chất kiểm định loại thực phẩm có chứa andrographolide 1.2 Mã số: 19.2TP01 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Nguyễn Ngọc Tuấn Viện Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thị Ngần Viện Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm Thành viên đề tài 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 12 tháng từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 1.5.2 Gia hạn (nếu có): khơng có 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu: khơng có 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 45 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu sử dụng thuốc từ dược liệu chăm sóc sức khỏe ban đầu cộng đồng Cuộc sống ngày phát triển, người ta đặt nhu cầu cao cho chất lượng sống mình, đặc biệt vấn đề sức khỏe Vậy nên cách mạng phát triển ngành công nghệ thực phẩm, thực phẩm chức trở thành vấn đề thiết yếu quan tâm nhiều [1] Xuyên tâm liên loại thảo dược sử dụng phổ biến thuốc đông y (Trung Quốc), Ayurveda (Ấn Độ) khu vực khác châu Á, xuyên tâm liên xem vị thuốc ko thể thiếu việc điều trị bệnh có kèm theo sốt, bệnh gan, mắt, bệnh liên quan đến đường hô hấp Nhận thấy tầm quan trọng xuyên tâm liên cơng dụng chữa bệnh đa nó, nước ta có nhiều nơi phát triển vùng trồng xuyên tâm liên, tạo điều kiện khôi phục sử dụng loại thảo dược [2], [3], [4] Xuyên tâm liên với thành phần andrographolide có nhiều cơng dụng tốt cho sức khỏe chưa nghiên cứu định lượng phân tách để đưa vào ứng dụng thiết thực làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức dùng làm chất chuẩn kiểm nghiệm sản phẩm thị trường (hiện số lượng thực phẩm chức ngày phong phú đa dạng với nhiều nguồn gốc xuất xứ khác ngân hàng chất chuẩn đơn vị kiểm nghiệm lại khơng nhiều dẫn đến khó khăn công tác quản lý đánh giá chất lượng sản phẩm) [2], [3], [4] Hiện Việt Nam chưa có chất chuẩn andrographolide nên có nhu cầu phải đặt mua từ nước với giá đắt (khoảng 475 USD cho 50 mg andrographolide (reference standard), 108 USD cho mg andrographolide (analytical standard) – theo https://www.sigmaaldrich.com) Với mong muốn góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa nguồn ngun liệu, xây dựng quy trình kiểm nghiệm chế phẩm có chứa xuyên tâm liên, nghiên cứu nhằm phân lập Andrographolide từ xuyên tâm liên làm chất chuẩn, thẩm định quy trình định lượng phù hợp sử dụng quy trình xây dựng để định lượng số mẫu thực phẩm chức chứa Andrographolide lưu hành thị trường phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Mục tiêu Xây dựng phương pháp phân tích định lượng hợp chất Andrographolide sắc ký hiệu cao Thẩm định quy trình định lượng có xác phù hợp để đưa kết luận chuẩn phân tách đủ tiêu chuẩn sở thành chuẩn gốc (primary standard) Ứng dụng vào quy trình kiểm định mẫu thuốc có Andrographolide thành phần cao xuyên tâm liên để so sánh kết định lượng Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp chiết xuất Phương pháp chiết xuất dùng để nghiên cứu sơ chưa biết thành phần hóa học dược liệu Phương pháp cổ điển sử dụng dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn hợp chất khỏi dược liệu Có hai cách chiết chiết nhiệt độ thường chiết nóng Thường sử dụng cách chiết nóng máy chiết liên tục (Shoxlet) chiết hồi lưu Sau lần chiết với loại dung môi, làm khô dược liệu tiếp tục chiết với dung môi Mỗi phân đoạn chiết, ta cất loại dung môi để thu cao chiết tiến hành phân tích riêng Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không cho hiệu suất cao 3.2 Các phương pháp sắc kí : Các phương pháp sắc ký sử dụng bao gồm sắc ký cột, sắc ký mỏng, rây phân tử 3.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ kết hợp phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (EI-MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương hợp chất xác định phương pháp phổ NMR 3.4 Phương pháp tinh chế - Kết tinh dung mơi: hịa tan bão hịa tinh thể sau phân lập vào lượng nhỏ dung môi nhiệt độ nóng, làm lạnh bay dung dịch có tượng q bão hịa hợp chất kết tinh tạp chất chưa đạt nồng độ bão hòa nằm trong dung dịch, lọc lấy tinh thể Kết tinh lại nhiều lần thu hợp chất có độ tinh khiết theo yêu cầu [1], [36-37] - Lặp lại q trình sắc kí cột giống giai đoạn phân lập, lựa chọn phân đoạn tinh khiết thay đổi dung môi rửa giải hay tỉ lệ thành phần dung môi rửa giải - Tiến hành sắc kí cột giai đoạn phân lập, thay đổi kiểu sắc kí, ví dụ giai đoạn phân lập sử dụng sắc kí hấp phụ pha thuận silica gel, giai đoạn tinh chế sử dụng sắc kí phân bố pha đảo C18 sắc kí thấm qua gel - Sử dụng sắc ký lỏng điều chế để tinh hợp chất phân lập để đạt độ tinh khiết theo yêu cầu sử dụng làm chất chuẩn phân tích 3.5 Đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất Sắc kí lớp mỏng: TLC sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào có mặt vết vết vết đối tượng phân tích Chất tinh khiết khơng có vết phụ vết phụ nhỏ [38], [39] Sắc kí lỏng hiệu cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất tính gần tỉ lệ tạp chất dựa tỉ lệ phần trăm diện tích peak [40-42] 3.6 Xây dựng liệu nhận dạng chất [39] Các hợp chất đối tượng nghiên cứu đề tài chất biết cấu trúc Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Việc nhận dạng chất dựa vào: - So sánh phổ chất phân tích với phổ chất chuẩn điều kiện - So sánh thông tin phổ, liệu hóa lí, số vật lí chất với tài liệu khoa học thông tin công bố Tập hợp liệu chuẩn khẳng định hợp chất đối tượng nghiên cứu Các phương pháp sử dụng để xây dựng liệu gồm có: Đo điểm chảy; đo phổ tử ngoại khả kiến; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), đo phổ khối lượng (MS) 3.7 Phương pháp kiểm soát chất lượng phân tích [35], [44] - Tính thích hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, tự tạo hay mẫu thử (ít lần tiêm), ghi lại sắc ký đồ xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak trung bình thông số khác peak (độ phân giải, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết ) Yêu cầu: - Độ phân giải peak liền kề với peak chất cần phân tích phải ≥ 1,5 - Số đĩa lý thuyết ≥ 2000 - Giá trị RSD thời gian lưu ≤ 1,0% diện tích peak phải ≤ 2,0% (với phép thử định lượng) Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có giải thích phù hợp - Các thông số khác peak phải đáp ứng yêu cầu chung phương pháp HPLC quy định Dược điển quy định cụ thể quy trình phân tích thẩm định - Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (5 dung dịch), ghi lại sắc ký đồ xác định đáp ứng peak Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan nồng độ chất chuẩn có mẫu đáp ứng peak thu sắc ký đồ phương pháp bình phương tối thiểu Yêu cầu với phép thử định lượng hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) Trường hợp r < 0,997 phải có giải thích phù hợp - Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát phương pháp phân tích (LOD) xác định theo “quy tắc 3” - Tín hiệu đo ứng với LOD (yLOD) = tín hiệu mẫu trắng (yB) + 3*độ lệch chuẩn (S) yB; LOD, LOQ phương pháp phân tích xác định theo hướng dẫn CEEQ-Center of expertise in analysis environmental of Quebec NIFC - Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia: Tiến hành phân tích 10 mẫu thực tế có nồng độ chất phân tích đủ thấp (những nồng độ lớn lần nhỏ 10 lần LOD, giá trị ước lượng từ LOD thiết bị), từ tình độ lệch chuẩn S: S = [(xi − xTB)2/(n − 1)]1/2 Trong đó, i = – 10; xi: kết riêng lẻ; xTB: trung bình số học Từ đó, tính LOD: LOD = 3*S LOQ = 3xLOD, R = xtb/LOD Trong đó: −X nồng độ chất phân tích mẫu thêm chuẩn; −Nếu < R 10: thêm chuẩn nồng độ thấp hơn, thực nghiệm, tình tốn lại giá trị R - Độ lặp lại (repeatability) Độ lặp lại đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD,%): RSD = S*100/xTB Độ lặp lại phương pháp phân tích nội phịng nghiệm (RSDPTN) phụ thuộc vào nồng độ xem độ lặp lại tốt (hay thỏa mãn yêu cầu) RSDPTN ≤ ½ RSD tính theo hàm Horwitz [45] tn thủ quy định AOAC (Hiệp hội nhà khoa học phân tích Mỹ) [46] Bảng 2.1 Giới hạn chấp nhận độ xác phương pháp theo AOAC [47] Thành phần phân tích % Tỷ lệ phân tích Đơn vị RSD (%) 100 100% 1.3 -1 ≥ 10 10 10% 2.7 -2 ≥1 10 1% 2.8 ≥ 0.1 10-3 0.1% 3.7 -4 0.01 10 100ppm 5.3 0.001 10-5 10ppm 7.3 -6 0.0001 10 1ppm 11 -7 0.00001 10 100ppb 15 -8 0.000001 10 10ppb 21 -9 0.0000001 10 1ppb 30 Độ (trueness) Độ phương pháp phân tích đánh giá theo cách: Phân tích mẫu thêm chuẩn (spiked sample): Cách áp dụng để đánh giá độ phân tích hợp chất có thuốc dược liệu nghiên cứu Trong mẫu, chọn ngẫu nhiên mẫu, phân tích kết x1; thêm chuẩn vào mẫu (nồng độ thêm chuẩn xo; dung dịch chuẩn pha chế từ hóa chất tinh khiết phịng nghiệm), lại phân tích mẫu thêm chuẩn, kết x2; từ đó, tình độ thu hồi (Recorvery, viết tắt Rev) theo công thức: Rev(%) = (x2 – x1)*100/xo Trong đó, Rev(%) độ thu hồi tình theo phần trăm; x2 kết đo mẫu thêm chuẩn; x1 kết đo mẫu không thêm chuẩn; xo hàm lượng thêm chuẩn vào mẫu x1 để tạo mẫu x2 Phương pháp phân tích xem đạt độ tốt tuân thủ quy định AOAC Rev (Rev phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích mẫu) Bảng 2.2 Giới hạn chấp nhận độ phương pháp theo AOAC [47] Thành phần phân tích % 100 ≥ 10 Tỷ lệ phân tích 10-1 Đơn vị 100% 10% Giá trị chấp nhận (%) 98-102 98-102 ≥1 ≥ 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 0.000001 0.0000001 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 1% 0.1% 100ppm 10ppm 1ppm 100ppb 10ppb 1ppb 97-103 95-105 90-107 80-110 80-110 80-110 60-115 40-120 3.8 Thiết lập chất chuẩn xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 3.8.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng Xây dựng tiêu chất lượng: Căn vào tính chất lí – hóa ngun liệu thiết lập chuẩn tiêu chất lượng thông thường chất chuẩn đối chiếu sơ cấp để xây dựng tiêu chất lượng chất chuẩn đối chiếu cần thiết lập Xây dựng phương pháp đánh giá: ▪ Tham khảo Dược điển Việt Nam dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá tiêu chất lượng ▪ Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng xác định tạp chất Dựa công thức phân tử cấu trúc hóa học hợp chất chiết xuất từ dược liệu để tìm các điều kiện sắc kí phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dịng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu ▪ Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu: - Tính đặc hiệu (Specificity) - Độ tuyến tính khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range) - Độ xác (Precision) - Độ (Accuracy): Độ xác định phương pháp thêm chuẩn tính thơng qua tỷ lệ thu hồi: Rev(%) = (x2 – x1)*100/xo - Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ - Sự phù hợp hệ thống sắc kí (System suitability) 3.8.2 Qui trình thiết lập phân tích đánh giá chất chuẩn Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn hợp chất đặc trưng chiết tách từ dược liệu, có độ tinh khiết 95,0% Áp dụng phương pháp phân tích thẩm định để đánh giá nguyên liệu có đáp ứng u cầu chất lượng khơng - Định tính: Tiến hành phương pháp đo phổ NMR phối hợp thêm phương pháp HPLC - Xác định độ tinh khiết: Sử dụng đo điểm chảy phối hợp phương pháp HPLC, Cơng thức tính hàm lượng tạp chất gần theo tỉ lệ diện tích peak áp dụng phương pháp HPLC: đó: Ctap : tỉ lệ phần trăm tạp chất mẫu phân tích Speak : diện tích peak tạp chất ∑Speak: tổng diện tích peak - Xác định hàm lượng: Sử dụng phương pháp HPLC thẩm định, tiến hành song song với chất chuẩn liên kết Cơng thức tính hàm lượng hợp chất (theo ngun trạng): đó: C : hàm lượng hoạt chất tính theo phần trăm mchuan : khối lượng chất chuẩn liên kết mthu : khối lượng mẫu thử Schuan : diện tích peak mẫu chuẩn liên kết Sthu : diện tích peak mẫu thử Vchuan : thể tích pha mẫu chuẩn Vthu : thể tích pha mẫu thử 3.9 Phương pháp xử lí số liệu [35] Xử lí kết phân tích phịng thí nghiệm Tập hợp kết loại giá trị thô theo qui tắc test – Dixon - Tính giá trị trung bình: - Tính độ lệch chuẩn: - Tính độ lệch chuẩn tương đối: công thức (5), (6), (7): X : giá trị trung bình hàm lượng hợp chất xi : giá trị hàm lượng hợp chất mẫu thứ i n: số thử nghiệm sử dụng để tính giá trị trung bình hàm lượng hợp chất S : độ lệch chuẩn RSD : độ lệch chuẩn tương đối Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Mẫu AP1 sau phân lập cân xác mg cho vào vial đem bảo quản lạnh nhiệt độ 15oC trường Đại học Cơng nghiệp Hồ Chí Minh Sau đó, mẫu gửi qua trường Đại học Khoa học tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh để đo MS thiết bị đo MS để xác định khối lượng phân tử tỉ lệ m/z hấp thu cường độ Kết đo thể sắc đồ PL 2.1 Sau thu kết MS, đem đối chiếu tỉ lệ m/z bảng 4.1 Từ kết đo phổ 1H-NMR (DMSO,  ppm); Phổ 13C-NMR (DMSO,  ppm) kết hợp với phổ DEPT; HSQC; HMBC so sánh tài liệu công bố [48-49] hợp chất AP1 nhận danh andrographolide có cơng thức cấu tạo sau: Andrographolide Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR hợp chất AP1 tài liệu tham khảo 13 TT C-NMR AP1 36.5 27.9 78.4 42.3 54.4 [48] 36.5 27.8 78.4 42.2 54.3 24.0 37.5 23.9 37.5 10 11 12 147.6 55.5 38.6 24.0 146.3 147.6 55.4 38.5 23.9 146.2 13 14 15 128.9 64.5 74.3 128.8 64.5 74.3 16 17 169.9 108.1 169.9 108.2 18 23.0 23.0 19 62.6 62.6 20 14xx.7 14.7 OH3 OH14 OH19 H-NMR AP1 1.21; 1.73 1.65 3.26 [48] 1.21; 1.72 1.65 3.25 1.21 1.21 1.35; 1.75 1.36; 1.75 1.94 (td; 13 1.95 (td; 13 4.5); 2.33 4.5); 2.32 (m) (m) HMBC H→13C C20, C10, C9 C10, C4, C3 C10, C4, C19 C20, C18, C10, C4, C19 C5 1.85 (d; 8) 1.85 (d; 8) C20, C10 1.70; 2.46 6.63 (td; 1.5) 1.70; 2.46 6.62 (td; 1.5) C13, C12; C9 C11, C9; C14; C16 4.91 (t, 6) 4.05 (dd; 10 2; H-15a) 4.39 (dd; 10 7; H-15b) 4.91 (t,6) C13, C12, C16 4.04 (dd; 10 C13; C16 2; H-15a) 4.39 (dd; 10 7; H-15b) 4.63 (s); 4.82 (s) 1.09 4.62 (s); 4.81 (s) 1.08 3.25 (br; H19a); 3.86 (dd; 11 2.5; H-19b) 0.66s 3.25 (br; H19a); 3.85 (dd; 11 2.5; H-19b) 0.66s 5.03 5.70 4.13 5.03 5.69 4.12 C7; C9 C4; C5; C19; C3 C18; C4; C3 C1; C10; C5; C9 C4; C3 C14; C15; C13 C4; C19 Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số xx, 20xx CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata Burm F.) Ở VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGẦN, NGUYỄN NGỌC TUẤN, NGUYỄN THỊ NỮ TRINH NGUYỄN NGỌC THUẦN, ĐÀM SAO MAI Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chi Minh nguyenngoctuan@iuh.edu.vn Tóm tắt Nghiên cứu phân lập ba hợp chất flavonoid hợp chất stillbene từ dịch chiết butanol xuyên tâm liên, với kết hợp nhiều kỹ thuật sắc ký khác gồm sắc ký cột silica gel, sắc ký cột pha đảo RP-18 Sephadex LH-20 Dựa vào số liệu phổ, hơp chất phân lập apigetrin (1); luteoloside (2); rutin (3); polydatin (4) Cấu trúc chúng xác định phương pháp phổ 1D, 2D NMR MS Các hợp chất lần cơng bố thành phần hóa học lồi xun tâm liên Việt Nam Từ khóa Andrographis paniculata B., apigetrin, polyphenol, flavonoids glycoside FLAVONOID GLYCOSIDES FROM THE LEAVES OF Andrographis paniculata Burm F IN VIET NAM Abstract In the present work, three flavonoids and a stillbene were isolated from the methanol extract of the leaves of Andrographis paniculata B with a combination of various chromatographic techniques, including silica gel, Sephadex LH-20 and RP-18 On the basis of spectroscopic data analysis, they were elucidated apigetrine (1); luteoloside (2); rutine (3); polydatine (4) Their structures were charaterized by 1D, 2D NMR and MS spectroscopies The compounds are the first report on the chemical constituents of Vietnamese Andrographis paniculata B Keywords Andrographis paniculata B., apigetrin, polyphenol, flavonoids glycoside GIỚI THIỆU Xuyên tâm liên loài thực vật mọc thẳng đứng, nhiều cành, chiều cao 0,3 – 0,8 m Cây nguyên, mềm, mọc đối xứng có cuống ngắn Phiến hình trứng, thn dài có hình mác với hai đầu nhọn Lá có chiều dài – 12 cm rộng 3,5 cm Hoa mọc thành chùm hình chùy đầu cành nách Hoa có màu trắng, điểm hồng Quả dài, nhẵn có chiều dài 15 mm rộng 3,5 mm Hạt xuyên tâm liên hình trụ Xun tâm liên có nguồn gốc từ Ấn Độ Sri Lanka Sau du nhập trồng phổ biến nước khu vực Đông Nam Á Nam Á Hiện nay, xuyên tâm liên trồng chủ yếu nước Châu Phi, Caribe, Australia Trung Mỹ Theo Y học cổ truyền, xun tâm liên có vị đắng, tính hàn, có tác dụng nhiệt giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng thống Thường dùng trị cảm sốt, cúm, trị ho, viêm họng, viêm phổi, sưng amidan, viêm đường tiết niệu, viêm âm đạo, khí hư, đau bụng kinh, viêm nhiễm đường ruột, tăng huyết áp, đau nhức thể, tê thấp, mụn nhọt Ngồi ra, xun tâm liên có khả điều trị rối loạn tâm thần, tác dụng chống ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng đường hô hấp, có đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn kháng virus [1-8] Thành phần hợp chất ứng dụng rộng rãi thực phẩm bổ trợ, thực phẩm chức dược phẩm [5-8] Trong nghiên cứu này, nghiên cứu dịch chiết phân lập hợp chất từ xuyên tâm liên (Andrographis paniculata B.) mua nhà thuốc khu Hải Thượng Lãng Ơng, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Từ cao chiết butanol xuyên tâm liên phân lập xác định cấu trúc hợp chất bao gồm apigetrin (1); luteoloside (2); rutin (3); polydatin (4) Cấu trúc hợp chất © 20xx Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh làm sáng tỏ dựa việc phân tích, kết hợp so sánh với tài liệu số vật lý phổ UV, IR, 1D 2D NMR (1H-, 13C-NMR, COSY, HSQC HMBC) MS 2.1 THỰC NGHIỆM Thiết bị Sắc ký lớp mỏng sử dụng loại tráng sẵn silica gel 60F245 (Merck), hình đèn UV iod Chất hấp phụ silica gel 230-400 mesh (Merck) sử dụng sắc ký cột Nhiệt độ nóng chảy đo máy Yanaco MP-S3 Phổ tử ngoại UV ghi máy Agilent UV-VIS Phổ hồng ngoại IR ghi máy Bruker 270-30, dạng viên nén KBr Phổ khối lượng phun mù điện ESI-MS đo máy MSEngine-5989-HP Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR đo máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC COSY đo máy Bruker 125 MHz (Phịng Phân tích cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam) 2.2 Nguyên liệu thực vật Mẫu xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) mua nhà thuốc khu Hải Thượng Lãng Ơng, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam định danh TS Văn Hồng Thiện thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm, trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Mẫu lưu phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm 2.3 Phân lập hợp chất Lá xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) khô (9,0 kg) tiến hành ngâm chiết siêu âm với metanol (3x20L), sau tiến hành quay chân khơng thu 950 g cao chiết Cao chiết phân bố nước, sau chiết với dung môi hexan, ethyl acetate, butanol thu cao tương ứng hexane (APH, 20,0 g), ethyl acetate (APE, 345,0 g), butanol (APB, 95,0 g) cao nước Cao APB (95,0 g) tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol (gradient nồng độ từ 100/1 – 0/1, v/v) thu bảy phân đoạn (APB1-APB7) Phân đoạn APB1 (3,7 g) tiếp tục triển khai sắc ký cột với hệ dung môi chloroform/methanol (25/1, v/v) thu hai phân đoạn nhỏ (APB1.1, APB1.2) Hợp chất (28,0 mg) thu từ phân đoạn APB1.1 (0,8 g) sắc ký cột RP-18 hệ dung môi methanol/nước (9/1, v/v) Phân đoạn APB1.2 (0,5 g) tiến hành sắc ký Sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v) thu hợp chất (11,0 mg) Phân đoạn APB4 (1,7 g) tiếp tục tiến hành sức ký cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (3/1, v/v) thu hợp chất (15,0 mg) hợp chất (75,0 mg) Hợp chất 1: Chất rắn màu vàng; đ.n.c 345-346 °C; ESI-MS m/z: 431,0968 [M-H]-; 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6 & CD3OD) (, ppm): 7,91 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2’), 7,91 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6’), 6,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-3’), 6,89 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,65 (1H, s, H-3), 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,98 (1H, m, H-5”), 3,78 (1H, m, H-2”), 3,60 (1H, m, H-4”), 3,53 (2H, m, H-6”), 3,47 (1H, m, H-3”); 13C-NMR (125 MHz,DMSO & MeOD) ( ppm): 179,8 (C-4), 164,5 (C-7), 163,9 (C-2), 162,4 (C-5), 160,5(C-4’), 160,1 (C-9), 129,3 (C-2’), 129,3 (C6’), 123,1 (C-1’), 117,1 (C-3’), 117,1 (C-5’), 109,8 (C-10), 106,8 (C-3), 105,3 (C-1”), 99,4 (C-6), 94,3 (C8), 78,7 (C-5”), 77,3 (C-3”), 71,2 (C-4”), 74,8 (C-2”), 62,5 (C-6”) Hợp chất 2: Chất rắn màu vàng nhạt; đ.n.c 301-3020C; ESI-MS m/z: 449,1074 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) (δ, ppm): 7,38 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz, H-6’), 7,37 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 6,92 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5’), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,72 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 6,54 (1H, s, H-3), 4,87 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,78 (1H, dd, J = 5,5 Hz, H-2”), 3,97 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz, H-6”), 3,60 (1H, m, H-4”), 3,53 (2H, m, H-5”), 3,47 (1H, m, H-3”); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (δ ppm): 180,1 (C-4), 164,7 (C-2), 164,1 (C-7), 160,5(C-5), 160,1 (C-9), 150,7 (C-4’), 147,0 (C-3’), 123,5 (C-1’), 120,1 (C-6’), 116,9 (C-5’), 114,1 (C-2’), 109,4 (C-10), 106,7 (C-3), 105,2 (C-1”), 99,3 (C-6), 94,6 (C-8), 78,6 (C-5”), 77,3 (C-3”), 74,8 (C-2”), 71,2 (C-4”), 62,5 (C-6”) Hợp chất 3: Chất rắn màu vàng nhạt, đ.n.c 192-1940C; 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) (δ, ppm): 7,54 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6’), 7,53 (1H, d, J = 2,0, H-2’), 6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,19 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,34 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”); 4,38 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1’”), 3,70 (1H, m, H-2’”), 3,21-3,39 (6H, m, H-2”,3”,4”,5”,6”), 3,21-3,39 (3H, m, H-3’”,4’”,5’”), 0,99 © 20xx Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6’”); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) ( ppm): 177,5 (C-4), 164,2(C-7), 161,3(C-5), 156,7(C-9), 156,5 (C-2), 148,5(C-4’), 144,8(C-3’), 133,4 (C-3), 121,7(C-6’), 121,3(C-1’), 116,4(C-5’), 115,3(C-2’), 104,1(C-10), 98,8(C-6), 93,7(C-8), Glu: 101,3 (C-1”), 74,2 (C-2”), 76,5 (C-3”), 70,1 (C-4”), 76,0 (C-5”), 67,1 (C-6”), Rham: 100,8 (C-1”’), 70,5 (C-2”’), 70,7 (C-3”’), 71,9 (C-4”’), 68,3 (C-5”’), 17,8 (C-6”’) Hợp chất 4: Tinh thể hình kim khơng màu, đ.n.c 223-2260C; 1H-NMR (500MHz, CD3OD) (δ, ppm): 7,37 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-2',6'), 7,03 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,87 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,81 (1H, s, H-2), 6,77 (2H, d, J = 6,5 Hz, H-3',5'), 6,64 (1H, s, H-6), 6,45 (1H, s, H-4), 4,91 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1"), 3,49 (1H, m, H-5"), 3,68 (1H, m, H-3"), 3,41 (1H, m, H-2"), 3,47 (1H, m, H-4"), 3,96 (1H, m, H-6"), 3,74 (1H, m, H-6"); 13C-NMR (125MHz, CD3OD) ( ppm): 160,4 (C-5), 159,6 (C-3), 158,4 (C-4'), 141,4 (C-1), 130,3 (C-), 129,9 (C-), 128,9 (C-2',6'), 126,7 (C-1'), 116,5 (C-3',5'), 108,4 (C-2), 107,1 (C-4), 104,1 (C-6), 102,4 (C-1"), 78,2 (C-5"), 78,1 (C-3"), 74,9 (C-2"), 71,5 (C-4"), 62,6 (C-6") KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dịch chiết metanol xuyên tâm liên sau cất thu hồi dung môi, phân bố dung môi hexane, ethyl acetate, butanol Cất loại dung môi thu cặn dịch chiết tương ứng Từ cao butanol phương pháp sắc ký cột silicagel Sephadex LH-20 phân lập ba hợp chất flavonoid (1, 2, 3) stillbene (4) Hợp chất có phổ khối lượng ESI-MS m/z: 431,0968 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C21H19O10 Phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu đặc trưng lớp chất flavonoid thuộc khung apigenin, điển hình xuất tín hiệu singlet proton H-3 H 6,65 (1H, s, H-3), hai tín hiệu proton doublet H-6 H-8 H 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,89 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) đặc trưng cho proton vòng A C Ngồi ra, tín hiệu đặc trưng vịng B (vòng phenyl 1,4 phần cấu trúc apigenin) proton thơm H 7,91 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’,6’) 6,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-3’,5’) Phổ 1H-NMR hợp chất cịn cho thấy tín hiệu proton gốc đường glucose H 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,78 (1H, m, H-2”), 3,47 (1H, m, H-3”), 3,60 (1H, m, H-4”), 3,98 (1H, m, H-5”), 3,53 (2H, m, H-6”) Kết hợp với việc so sánh với tài liệu [12] cho thấy vị trí gốc đường glucose liên kết với phần aglycon apigenin vị trí C-7 Ngoài ra, phổ HMBC hợp chất cho thầy tín hiệu tương quan giũa H-1”/C-7 sở cố khẳng định vị trí gốc đường liên kết C-7 Phổ 13C-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu 21 cacbon, tín hiệu đặc trưng tín hiệu cacbon thơm vịng B C 123,1 (C-1’), 129,3 (C-2’,6’), 117,1 (C-3’,5’), 160,5 (C-4’) Ngồi phổ 13C-NMR hợp chất cịn xuất tín hiệu đặc trưng cho vịng A apigenin C 162,4 (C-5), 99,4 (C-6), 164,5 (C-7), 94,3 (C-8), 160,1 (C-9), 109,6 (C-10) Hai tín hiệu cacbon α  vòng C xác định C 163,9 (C-2), 106,8 (C-3) carbon carbonyl C 179,8 (C-4) Các tín hiệu carbon gốc đường glucose xác định C 105,2 (C-1”), 74,8 (C2”), 77,3 (C-3”), 71,2 (C-4”), 78,7 (C-5”), 62,5 (C-6”) Từ số liệu phổ 1D 2D-NMR hợp chất 1, kết hợp với việc so sánh với tài liệu [12] kết luận hợp chất hợp chất apigetrin Hợp chất lần phân lập từ lồi Teucrium gnaphalodes [9] Hợp chất có phổ khối lượng ESI-MS m/z: 449,1074 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C21H21O11 Từ đây, xác định công thức phân tử hợp chất C21H20O11 Phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu đặc trưng lớp chất flavonoid thuộc khung luteolin, tín hiệu điển hình bao gồm: H-3 H 6,54 (1H, s, H-3), hai tín hiệu proton doublet H-6 H-8 H 6,72 (1H, d, J = 2,5 Hz, H6), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) đặc trưng cho proton vòng A C; proton thơm H 7,37 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’) 7,38 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz, H-6’), 6,92 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5’) đặc trưng vòng B (vòng phenyl 1,3,4 phần cấu trúc luteolin) Ngoài ra, phổ 1H-NMR hợp chất cịn cho thấy tín hiệu proton gốc đường glucose H 4,87 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,78 (1H, dd, J = 5,5 Hz, H-2”), 3,47 (1H, m, H-3”), 3,60 (1H, m, H-4”), 3,97 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz, H6”), 3.53 (2H, m, H-5”) Kết hợp với việc so sánh với tài liệu [14] cho thấy vị trí gốc đường glucose liên kết với phần aglycon luteolin vị trí C-7 Việc phân tích phổ HMBC hợp chất cho thầy tín hiệu tương quan giũa H-1”/C-8 sở cố khẳng định vị trí gốc đường liên kết C-7 Phổ 13C-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu 21 © 20xx Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh cacbon, tín hiệu đặc trưng tín hiệu cacbon vòng B C 123,5 (C-1’), 114,1 (C-2’), 147,0 (C-3’), 150,7 (C-4’), 116,9 (C-5’), 120,1 (C-6’); tín hiệu đặc trưng cho vịng A luteolin C 160,5 (C-5), 99,3 (C-6), 164,1 (C-7), 94,6 (C-8), 160,1 (C-9), 109,4 (C-10); hai tín hiệu cacbon α  vòng C C 164,7 (C-2), 106,7 (C-3) carbon carbonyl C 180,1 (C-4); tín hiệu cacbon gốc đường glucose C 105,2 (C-1”), 74,8 (C-2”), 77,3 (C-3”), 71,2 (C-4”), 78,7 (C-5”), 62,5 (C-6”) Từ số liệu phổ 1D 2D-NMR hợp chất 2, kết hợp với việc so sánh với tài liệu [10] kết luận hợp chất luteoloside Hợp chất chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 192-1940C Phổ 1H-NMR cho tín hiệu singlet δH 12,59 ppm nhóm OH C-5 liên hợp với nhóm carbonyl Có năm tín hiệu proton thơm, hai proton ghép cặp kiểu ortho H-5’ δH 6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz) với H-6’ δH 7,54 (1H,dd, J = 8,0, 2,0 Hz), hai proton ghép cặp kiểu meta H-6 δH 6,19 (1H, d, J = 2,0 Hz) với H-8 δH 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz), tín hiệu proton thơm singlet H-2’ δH 7,53 (1H, s) Tín hiệu proton anomeric gốc rhamnose δH 4,38 (1H, d, J = 1,0 Hz), tín hiệu proton anomeric gốc glucose δH 5,34 (1H, d, J = 7,5 Hz) Các proton lại nằm vùng δH 3,81 đến δH 3,32 ppm Tín hiệu nhóm methyl gốc rhamnose δH 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz) Phổ 13C-NMR DEPT cho thấy 15 tín hiệu nguyên tử carbon thuộc khung flavonoid, tín hiệu carbon thuộc gốc đường glucose, tín hiệu carbon thuộc gốc đường rhamnose Liên kết gốc đường glucose với khung flavonoid xác định qua tương quan HMBC H-1’’ δH 5,34 (1H, d, J = 7,5 Hz) với C-3 (133,4 ppm), liên kết gốc rhamnose với gốc glucose xác định qua tương quan HMBC H-1’’’ δH 4,38 (1H, d, J = 1,0 Hz) C-6’’ (67,1 ppm) Qua phân tích liệu phổ 1H-NMR, MS, 13C-NMR, HSQC, HMBC kết hợp với tài liệu [11] kết luận rutin Rutin flavonoid phổ biến rộng rải giới thực vật, với nhiều hoạt tính sinh học đáng ý Nó cơng bố từ nhiều loài S tuberosum, S lyratum, S lycopersicum.[12] Hợp chất cho thấy tín hiệu đặc trưng nhóm β-D-glucopyranosyl với độ dịch chuyển hóa học khoảng H 3,0-5,0 ppm phổ 1H-NMR C 60-102 ppm phổ 13C-NMR Vùng trường thấp phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu singlet hai aromatic proton H 6,64 ppm (1H, s, H-6), 6,81 ppm (1H, s, H-2) Phổ 13 C-NMR hợp chất cho thấy đặc trưng khung cacbon trans- resveratrol [13] Kết phổ HMBC hợp chất cho thấy mối tương quan H-1” với C-3 Đồng thời, tín hiệu cịn thể rõ mối tương quan H-α H- với C-1’ So sánh liệu phổ với tài liệu [14] xác định hợp chất 5,4'-dihydroxy stilbene-3-Oβ-D-glucopyranoside (polydatin) (1) Apigetrin (3) Rutin © 20xx Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh (2) Luteoloside (4) Polydatin KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, nghiên cứu dịch chiết phân lập hợp chất từ xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) mua nhà thuốc khu Hải Thượng Lãng Ơng, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Từ cao chiết butanol phương pháp sắc ký kết hợp với phương pháp phổ đại (UV, IR, 1D 2D NMR (1H-, 13C-NMR, COSY, HSQC HMBC MS) phân lập nhận dạng hợp chất polyphenol glycoside bao gồm apigetrin (1); luteoloside (2); rutin (3); polydatin (4) từ xuyên tâm liên Việt Nam Thành phần hợp chất ứng dụng rộng rãi thực phẩm bổ trợ, thực phẩm chức dược phẩm Đây lần hợp chất phân lập từ xuyên tâm liên Lời cảm ơn: Chúng xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh tài trợ kinh phí thực đề tài Mã số 19.2TP01 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] G S K Sai, T Nitesh, R G Nageswara, N Srinivas, Andrographolide: A natural product template for the generation of structurally and biologically diverse diterpenes, Eur J Med Chem., 176, pp 513-533, 2019 [2] J Lu, Y Ma, J Wu, H Huang, X Wang, Zh Chen, J Chen, H He, Ch Huang, A review for the Neuroprotective effects of andrographolide in the central nervous system, Biomedicine Pharmacotherapy, vol 117, pp 109078, 2019 [3] T I Muhammad, Andrographolide, a new hope in the prevention and treatment of metaboli syndrome, Frontiers in pharmacology, vol 8, pp 571, 2017 [4] WS D Tan, W Liao, Sh Zhou, WS F Wong, Is there a future for andrographolide to be an anti-inflammatory drug? Deciphering its major mechanisms of action, Biochemical pharmacology, vol 139, pp 71-81, 2017 [5] S Gupta, KP Mishra, L Ganju, Broad-spectrum antiviral properties of andrographolide, Archives of virology, vol.162, no 3, pp 611-623, 2017 [6] S Ovais, Ah Sayeed, U Shahid, Andrographis paniculata: a critical appraisal of extraction, isolation and quantification of andrographolide and other active constituents, Natural product research, vol 28, no 23, pp 20812101, 2014 [7] B Zhou, D Zhang, X Wu, Biological activities and corresponding SARs of andrographolide and its derivatives, Mini reviews in medicinal chemistry, vol 13, no 2, pp 298-309, 2013 [8] J Ch W Lim, T K Chan, David SW Ng, R S Sreenivasa, S Johnson, WS F Wong, Andrographolide and its analogues: versatile bioactive molecules for combating inflammation and cancer, Clinical Experimental Pharmacology Physiology, vol 39, no 3, pp 300-310, 2012 [9] F A T Barberán, M I Gil, F Tomás, F Ferreres, A Arques, Flavonoid Aglycones and Glycosides from Teucrium gnaphalodes, Journal of Natural Products, vol 48, no 5, pp 859, 1985 [10] J Wang, Sh Geng, B Wang, Q Shao, Y Fang, Y Wei, Magnetic nanoparticles and high-speed countercurrent chromatography coupled in-line and using the same solvent system for separation of quercetin-3-O-rutinoside, luteoloside and astragalin from a Mikania micrantha extract, Journal of Chromatography A, vol 1508, pp 42–52, 2017 [11] B Sintayehu, K Asres, Y Raghavendra, Radical scavenging activities of the leaf extracts and a flavonoid glycoside isolated from Cineraria abyssinica Sch Bipp Exa Rich, J Appl Pharm Sci, vol 2, no 4, pp 44-49, 2002 © 20xx Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh [12] A C Pereira, D F Oliveira, G H Silva, H C Figueiredo, A J Cavalheiro, D A Carvalho, S M Chalfoun, Identification of the antimicrobial substances produced by Solanum palinacanthum (Solanaceae), An Acad Bras Cienc, vol 80, no 3, pp 427-432, 2008 [13] H,-D Hung, D.–D Tien, Ng.–Th Ngoan, B.–Th Duong, D.–Q Viet, Ph.–G Dien, B.–K Anh, Study on chemical constituents and bioactivities of the fruits of Dipterocarpus retusus of Viet Nam, Vietnam Journal of Science and Technology, vol 57, no 3, pp 294-299, 2019 [14] M T Ngoc, P T Minh, T M Hung, P T Thuong, I Lee, B S Min, K Bae, Lipoxygenase Inhibitory constituents from Rhubarb, Arch Pharm Res, vol 31, no 5, pp 598-605, 2008 Received on Revised on © 20xx Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số xx, 20xx XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẤT KIỂM ĐỊNH ANDROGRAPHOLIDE TỪ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN Ở VIỆT NAM ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH CÁC CHẾ PHẨM TỪ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN (Andrographis paniculata B.) NGUYỄN NGỌC TUẤN1, LÊ TẤN PHÁT1, LÂM HOÀNG VY2, NGUYỄN THỊ NỮ TRINH1,3, NGUYỄN THỊ NGẦN1, ĐỒN MẠNH DŨNG4 Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Quản lý an tồn thực phẩm TP Hồ Chí Minh Viện Cơng nghê sinh học môi trường, Trường Đại học Tây Nguyên Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế nguyenngoctuan@iuh.edu.vn Tóm tắt Bằng phương pháp sắc ký, hợp chất andrographolide (1,5 g) phân lập từ Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata B.) làm chất kiểm định Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-, 2D-NMR) MS Hợp chất có độ tinh khiết > 95,0% nhằm mục đích sử dụng làm chất chuẩn phân tích phịng thí nghiệm Việc kiểm định chất chuẩn thực hệ thống HPLC sau: cột Shimadzu Shim-pack GIST (C18, 250 mmL x 4.6 mmI.D., μm); pha động: methanol/nước (65/35); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; detector: PDA, bước sóng 223 nm; thể tích tiêm mẫu: 20 µl, thời gian chạy mẫu 15 phút Chất chuẩn kiểm định ứng dụng phân tích 04 mẫu chế phẩm từ xuyên tâm liên thu thập Việt Nam (M1M4) Từ khóa Andrographolide, Andrographis paniculata, xuyên tâm liên, HPLC, phân tích, phân lập THE PROCESS FOR ISOLATION ANDROGRAPHOLIDE FROM Andrographis paniculata B IN VIETNAM - APPLICATION OF Andrographis paniculata B PRODUCTS ANALYSIS Abstract By the chromatographic methods, andrographolide (1.5g), which used to maker, was isolated from Andrographis paniculata The structure of this compound was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy (1D-, 2D-NMR) and mass spectroscopy (MS) The compound (purity> 95.0%) was intended to be used as laboratory analytical standards Calibration of the standard is performed on the HPLC system as follows: Shimadzu Shim-pack GIST column (C18, 250 mmL X 4.6 mmI.D., μm); mobile phase: methanol / water (65/35); flow: 0.7 ml / min; detector: PDA, at a wavelength of 223 nm; sample injection volume: 20 µl, sample running time 15 minutes The control compound standard was applied to analyze 04 samples in Vietnam (M1-M4) Keywords Andrographolide, Andrographis paniculata, HPLC, analysis, isolation GIỚI THIỆU Andrographolide hợp chất xuyên tâm liên, có khả điều trị rối loạn tâm thần, tác dụng chống ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng đường hô hấp, có đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn kháng virus mạnh mẽ [1-8] Hợp chất ứng dụng rộng rãi thực phẩm bổ trợ, thực phẩm chức dược phẩm [5-8] Để đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu chất lượng sản phẩm có nguồn gốc từ xuyên tâm liên, nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng quy trình nhằm phân lập tinh andrographolide từ xuyên tâm liên làm chất chuẩn đối chiếu, góp phần tạo nguồn chất chuẩn định lượng phịng thí nghiệm Đồng thời ứng dụng chất chuẩn kiểm định số mẫu chế phẩm từ xuyên tâm liên thu thập Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số xx, 20xx 2.1 THỰC NGHIỆM Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC sau: Cột Shimadzu Shim-pack GIST (C18, 250 mmL x 4.6 mmI.D., μm); Detector: PDA (Photometric Diode Array) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo Phịng Cộng hưởng từ - Viện Hóa học, Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam; cột sắc ký loại, cân phân tích OHAUS PA214 độ xác 0,0001g, bể siêu âm, máy ly tâm Vortex, màng lọc 13 mm, 0,45 μm (PTFE) Máy cô quay chân không hiệu EYELA N – 1200A kèm bếp cách thủy EYELA OSB – 2100 máy làm lạnh EYELA CCA – 1111, Đèn UV bước sóng 365 - 254 nm 2.2 Hóa chất Dung mơi sử dụng sắc ký lớp mỏng sắc ký cột bao gồm hexane, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), acetone, methanol (MeOH) Tất dung mơi sử dụng hóa chất hãng Chemsol - Việt Nam đạt tiêu chuẩn công nghiệp chưng cất lại trước dùng nước cất lần cung cấp từ cơng ty hóa chất Bách Khoa Dung mơi dùng cho phân tích methanol (Merck, Đức), acetonitrile (Merck, Đức), nước cất, acid formic (Merck) Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh 20-400 mesh, Merck), silica gel 60 RP‐18 F254S (Merck, Darmstadt, Germany), Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254(1.05554, Merck) Phát vết hữu sắc ký lớp mỏng, nhúng vào dung dịch acid sulfuric – 10% ethanol đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 365 nm dùng thuốc thử I2 2.3 Nguyên liệu thực vật Mẫu xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) mua nhà thuốc khu Hải Thượng Lãng Ông, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam định danh TS Văn Hồng Thiện thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm, trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Mẫu lưu phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm 2.4 Mẫu chế phẩm từ xuyên tâm Mẫu chế phẩm từ xuyên tâm liên ứng dụng phân tích hàm lượng andrographolide xác định bảng Bảng Thông tin mẫu thuốc, thực phẩm chức ứng dụng phân tích Tên chế phẩm Mẫu thuốc đông y Thực phẩm chức viên hộ gan Kingphar Thực phẩm chức viên uống Esunvy Dược phẩm Hoa Linh ACNEBYE 2.5 Kí hiệu Số lô M1 - Hàm lượng cao xuyên tâm liên ghi nhãn - M2 011018 50mg/viên M3 004/18 100mg/viên M4 0118 390mg/viên Khảo sát điều kiện tách chiết Tiến hành khảo sát điều kiện tách chiết dựa phương pháp chiết ngâm dầm nhiệt độ phòng, chiết siêu âm, chiết siêu âm gia nhiệt Khảo sát dung môi chiết hexane, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), acetone, methanol (MeOH) Khảo sát điều kiện chạy cột sắc ký… 2.6 Chuẩn bị mẫu phân tích Chuẩn bị mẫu thử: cân lượng mẫu chế phẩm tương đương 10 mg mẫu nghiền thành bột, hồ với 50ml MeOH bình định mức 50 ml, siêu âm 30 phút nhiệt độ 50oC, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm (bỏ ml dịch đầu) thu dịch tiêm sắc ký Chuẩn bị mẫu trắng: chuẩn bị mẫu có Methanol dành cho HPLC 2.7 Điều kiện, thơng số tối ưu cho phân tích Khảo sát điều kiện chạy sắc ký: sau khảo sát nghiên cứu nhiều tài liệu tham khảo chúng tơi Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số xx, 20xx lựa chọn điều kiện sắc ký sau [10], [11]: cột: Shimadzu Shim-pack GIST (C18, 250 mmL x 4.6 mmI.D., μm); pha động: methanol/nước (65/35); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; detector: PDA (Photometric Diode Array), bước sóng 223 nm; thể tích tiêm mẫu: 20 µl KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết tinh chế andrographolide 3.1.1 Chiết xuất Quá trình chiết xuất tiến hành theo bước chính: chuẩn bị mẫu chiết, trích ly, loại bỏ tạp chất (chất béo, diệp lục…) Chuẩn bị mẫu: mẫu Xuyên tâm liên loại bỏ sâu, già sau sấy khơ 600C, xay nhỏ vừa phải (kích thước 0,1-0,2 cm) cân lên 1kg bột Trích ly: sử dụng 2L dung mơi Etanol 950 ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt 500C vịng 3h, lặp lại lần Tồn dịch chiết thu lọc kĩ với màng lọc sau loại dung mơi máy quay chân không áp suất thấp Cân khối lượng cao thu 223g Làm sạch, loại bỏ chất béo, diệp lục, tạp chất: tồn lượng cao thu hịa tan 2L nước cất lần Để loại bỏ chất béo, chất diệp lục tạp chất khác ta sử dụng chiết lỏng lỏng với 500mL petroleum ether, lặp lại lần Tạo phần cao chiết chứa andrographolide: Phần dịch nước tiếp tục chiết lỏng lỏng với 500mL ethyl acetate để thu phần cao chiết chứa andrographolide Quá trình chiết lặp lại lần, dịch chiết thu cô loại dung môi hệ thống máy cô quay chân không áp suất thấp cân thu 115g 3.1.2 Phân lập Sắc kí cột silica gel (500g silicagel đường kính 20-400 mesh) áp dụng cho cao etyl axetat (115 g), chạy sắc ký cột (CC đường kính 5cm, chiều dài cột 1M) dung mơi Chloroform/Metanol (10/1) Mỗi phân đoạn hứng 500 mL, theo dõi trình sắc kí TLC, kết thu phân đoạn APL1(12g), APL2 (13g), APL3 (54g), APL4 (9g), APL5 (11g) Các phân đoạn khảo sát chia đoạn sắc ký lớp mỏng ta thấy phân đoạn APL3 chưa khối lượng chất nhiều Sắc kí cột silica gel (300g silicagel đường kính 20-230 mesh) cho đoạn APL3 với cột sắc ký (CC đường kính 3cm, chiều dài cột 500mM) với dung môi rửa giải Chloroform/Metanol (5/1), dùng sắc ký mỏng để theo dõi trình sắc ký cột Kết phân đoạn APL31 (10g), APL32 (19g), APL33 (11g) Phân đoạn APL32 tiếp tục tiến hành sắc kí cột lọc gel Sephadex hệ Chloroform/Metanol (3/1) kết thu hợp chất dạng tinh thể phiến, kim, khơng màu, kí hiệu AP1 3.1.3 Xác định cấu trúc Phổ khối lượng AP1 cho thấy m/z hợp chất 351,2100 với cường độ hấp thụ 80% (cho thấy theo tính tốn tỉ lệ m/z [M+H]+ 351,2164) nên kết luận hợp chất hấp thụ cao sắc đồ MS andrographolide chiếm tỉ lệ khối lượng lớn mẫu phân lập Mặt khác, kết đo phổ 1H-NMR (DMSO,  ppm); Phổ 13C-NMR (DMSO,  ppm) kết hợp với phổ DEPT; HSQC; HMBC so sánh tài liệu công bố [12] hợp chất AP1 nhận danh andrographolide Bảng Dữ liệu phổ NMR hợp chất AP1 tài liệu tham khảo 13 C-NMR (125MHz, H-NMR (500MHz, DMSO, J Hz) HMBC TT DMSO) H→13C AP1 [15] AP1 [15] 36,5 36,5 1,21; 1,73 1,21; 1,72 C20, C10, C9 27,9 27,8 1,65 1,65 C10, C4, C3 78,4 78,4 3,26 3,25 C10, C4, C19 42,3 42,2 54,4 54,3 1,21 1,21 C20, C18, C10, C4, C19 24,0 23,9 1,35; 1,75 1,36; 1,75 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số xx, 20xx 37,5 10 11 12 13 14 15 147,6 147,6 55,5 55,4 38,6 38,5 24,0 23,9 146,3 146,2 128,9 128,8 64,5 64,5 74,3 74,3 16 17 18 19 169,9 169,9 108,1 108,2 23,0 23,0 62,6 62,6 20 3-OH 14-OH 19-OH 14,7 37,5 14,7 1,94 (td; 13 4,5) 2,33 (m) 1,95 (td; 13 4,5) 2,32 (m) C5 1,85 (d; 8) 1,85 (d; 8) C20, C10 1,70; 2,46 6,63 (td; 1,5) 1,70; 2,46 6,62 (td; 1,5) C13, C12; C9 C11, C9; C14; C16 4,91 (t, 6) 4,05 (dd; 10 2; H-15a) 4,39 (dd; 10 7; H-15b) 4,91 (t,6) 4,04 (dd; 10 2; H-15a) 4,39 (dd; 10 7; H-15b) C13, C12, C16 C13; C16 4,63 (s); 4,82 (s) 1,09 3,25 (br; H-19a) 3,86 (dd; 11 2,5; H-19b) 0,66s 5,03 5,70 4,13 4,62 (s); 4,81 (s) 1,08 3,25 (br; H-19a); 3,85 (dd; 11 2,5; H-19b) 0,66s 5,03 5,69 4,12 C7; C9 C4; C5; C19; C3 C18; C4; C3 C1; C10; C5; C9 C4; C3 C14; C15; C13 C4; C19 Hình Cấu trúc Androgrpholide 3.1.4 Kiểm tra độ tinh khiết andrographolide Để kiểm tra độ tinh khiết sơ ban đầu ta sử dụng sắc ký lớp mỏng phương pháp tổng diện tích peak tính tốn độ tinh khiết mẫu phân tích Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích peak phụ (tạp chất) sắc ký đồ tính độ tinh khiết hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Độ tinh khiết ban đầu xác định 80% 3.1.5 Tinh chế andrographolide Quá trình tinh chế andrographolide tiến hành sắc kí cột lọc gel LH20 hệ chloroform/metanol (1/1) kết thu hợp chất có khối lượng 1,5g Chất kiểm tra lại độ tinh khiết cho ta thấy sắc ký đồ HPLC thu cho pic hợp chất AP1 tách rõ ràng, sắc ký đồ chuẩn AP1 tinh có thời gian lưu 6.5 phút, nhiễu thấp mẫu chuẩn AP1 tinh sạch, andrographolide có độ >98%, phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu Như dùng điều kiện sắc ký lựa chọn để phân tích định lượng chất AP1 có mẫu thuốc thực phẩm chức [13-15] Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số xx, 20xx Hình Sắc ký đồ độ tinh khiết Andrographolide 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn andrographolide có nồng độ 160 µg/ml lặp lại 06 lần, ghi lại sắc ký đồ xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak Độ lệch chuẩn tương đối thời gian diện tích peak 0,055 0,049 (đều < 2%) có hệ số kéo 0,32 (< 1,5%) Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống sắc ký HPLC sử dụng ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính, định lượng andrographolide mẫu thực [14,15] 3.2.2 Độ đặc hiệu hệ thống Tiến hành sắc ký loại mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu phân tích andrographolide theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu phổ peak andrographolide sắc ký đồ Kết cho thấy sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất peak khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu andrographolide (tR~6.5 phút).) Vậy phương pháp phân tích andrographolide xây dựng có độ đặc hiệu cao [14,15] Hình Sắc ký đồ mẫu trắng sắc ký đồ andrographolide chuẩn 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính Chuẩn bị dung dịch chuẩn gồm 06 dung dịch andrographolide có nồng độ 20-140 μg/ml (ppm) cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với hệ số pha loãng khác Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm lần), ghi lại sắc ký đồ xác định diện tích peak tương ứng Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính nồng độ chất phân tích diện tích peak tương ứng sắc ký đồ phương pháp bình phương tối thiểu Kết phương trình hồi quy tuyến tính thu với andrographolide có hệ số xác định hệ số tương quan cao, độ tuyến tính chặt, khoảng tuyến tính rộng (sự tương quan tuyến tính nồng độ chất andrographolide (x) diện tích peak (y) với phương trình hồi quy: y = 38496x + 9993,77 có hệ số tương quan R2 = 0,9997 nằm khoảng giới hạn 0,99 ≤ R2 ≤ 1) [14] 3.2.4 Độ lặp lại Áp dụng quy trình phân tích trình bày mục 2.7 để xác định hàm lượng andrographolide tiến hành 06 thí nghiệm riêng biệt để định lượng 01 mẫu thuốc lựa chọn Chi tiết chuẩn bị mẫu cho phân tích theo phương pháp nêu mục 2.6 Các kết phân tích tính theo nồng độ chất dung dịch mẫu (µg/mL) Kết thu cho thấy hàm lượng trung bình tìm thấy chất Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số xx, 20xx andrographolide 4.6515 có %RSD = 0.72% Như áp dụng chương trình lựa chọn để định lượng chất andrographolide mẫu dược liệu [14] 3.2.5 Độ Độ phương pháp phân tích andrographolide xác định thơng qua độ thu hồi (Recovery) theo công thức: Re v(%) = C − C1  100 Co (1) Trong đó, C0 nồng độ chất phân tích thêm vào mẫu thật; C1 nồng độ chất phân tích mẫu thật; C2 nồng độ chất phân tích mẫu thật thêm chuẩn Độ thu hồi phương pháp xác định cách tiến hành xử lý mẫu phân tích (lặp lại lần) theo quy trình thêm lượng xác định chất chuẩn sau tiến hành phân tích ba lần lặp lại, tính kết trung bình Kết độ thu hồi phương pháp nêu bảng Độ phương pháp xác định từ tỉ lệ (%) thu hồi chất chuẩn thu từ kết định lượng so với lượng chuẩn thêm vào Kết thu ghi bảng 3.5 cho thấy quy trình định lượng chất AP1 có khả thu hồi cao (> 95%) tức phương pháp có độ cao [14,15] Bảng Kết thực nghiệm độ Lượng có sẵn (mg/ml) Lượng thêm vào (mg/ml) Diện tích Lượng tìm thấy (mg/ml) Tỷ lệ thu hồi (%) 0,160 0,160 0,080 0,080 2979570 2978833 0,077 0,077 96,25 96,25 0,160 0,080 2978076 0,077 96,25 0,160 0,160 6003467 0,156 97,50 100% 0,160 0,160 6001324 0,156 97,50 150% 0,160 0,160 0,160 0,160 0,244 0,244 5999379 9318478 9293136 0,156 0,242 0,241 97,50 99,20 98,77 0,160 0,244 9296077 97,66 0,241 99,77 Độ 50% TB 3.2.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích andrographolide đến tín hiệu chất phân tích sắc ký đồ thu có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3 Nồng độ xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp ứng với chất Giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp xác định dựa giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD Kết phân tích cho thấy phương pháp có giới hạn phát với andrographolide 1,5 ppm tương ứng có giới hạn định lượng ppm [14] 3.3 Phân tích andrographolide số chế phẩm từ xuyên tâm liên Hàm lượng andrographolide mẫu chế phẩm từ xuyên tâm liên xác định với điều kiện tối ưu theo phương pháp đường chuẩn xây dựng mục 2.6 2.7 Các kết thu được trình bày bảng Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu phương pháp nội suy để phân tích hàm lượng andrographolide chế phẩm sử dụng nghiên cứu đề tài cho kết sau: Bảng Kết phân tích hàm lượng andrographolide mẫu chế phẩm Ký Lần Lần Lần C% RSD Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số xx, 20xx hiệu % S C(mg/L) C% S C(mg/L) C% S C(mg/L) C(%) TB M1 0 0 0 0 0 M2 33656 0,615 0,002 34092 0,626 0,002 34177 0,628 0,002 0,002 1,120 M3 4902733 127,098 6,360 4970133 128,848 129,949 6,500 6,43 1,120 M4 187570 4,613 0,899 187277 4,605 4,665 0,910 0,902 0,700 6,440 5012495 0,898 189568 Từ kết cho thấy, phương pháp HPLC-PDA phân tích mẫu chế phẩm thuốc đạt độ lặp lại tương đối tốt RSD < 2% Như vậy, phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, phù hợp để xác định andrographolide mẫu chế phẩm thuốc từ xuyên tâm liên KẾT LUẬN Xây dựng thành cơng quy trình tách chiết tinh chế hợp chất andrographolide (1,5 g) từ xuyên tâm liên (1kg) làm chất kiểm định Chất kiểm định xác định cấu trúc dựa sở số liệu vật lý (phổ công hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR phổ khối lượng ESI-MS) thẩm định phương pháp phân tích Hợp chất tinh (độ tinh khiết > 99,5%) sử dụng làm chất chuẩn phân tích hàm lượng andrographolide mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ xuyên tâm liên sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC-PDA) có độ lặp lại cao, phù hợp để xác định andrographolide mẫu chế phẩm thuốc từ xuyên tâm liên LỜI CÁM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh tài trợ kinh phí thực đề tài Mã số 19.2TP01 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Sai Giridhar Sarma Kandanur, Nitesh Tamang, Nageswara Rao Golakoti, Srinivas Nanduri, Andrographolide: A natural product template for the generation of structurally and biologically diverse diterpenes, Eur J Med Chem., 176, (2019), pp 513-533 [2] Jiashu Lu, Yaoying Ma, Jingjing Wu, Huaxing Huang, Xiaohua Wang, Zhuo Chen, Jinliang Chen, Haiyan He, Chao Huang, A review for the neuroprotective effects of andrographolide in the central nervous system, Biomedicine Pharmacotherapy, 117, (2019), pp 109078 [3] Muhammad T Islam, Andrographolide, a new hope in the prevention and treatment of metabolic syndrome, Frontiers in pharmacology, 8, (2017), pp 571 [4] WS Daniel Tan, Wupeng Liao, Shuo Zhou, WS Fred Wong, Is there a future for andrographolide to be an anti-inflammatory drug? Deciphering its major mechanisms of action, Biochemical pharmacology, 139, (2017), pp 71-81 [5] Swati Gupta, KP Mishra, Lilly Ganju, Broad-spectrum antiviral properties of andrographolide, Archives of virology, 162, (2017), 3, pp 611-623 [6] Ovais Sareer, Sayeed Ahmad, Shahid Umar, Andrographis paniculata: a critical appraisal of extraction, isolation and quantification of andrographolide and other active constituents, Natural product research, 28, (2014), 23, pp 2081-2101 [7] Bin Zhou, Dayong Zhang, Xiaoming Wu, Biological activities and corresponding SARs of andrographolide and its derivatives, Mini reviews in medicinal chemistry, 13, (2013), 2, pp 298-309 Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số xx, 20xx [8] Jonathan Chee Woei Lim, Tze Khee Chan, David SW Ng, Sreenivasa R Sagineedu, Johnson Stanslas, WS Fred Wong, Andrographolide and its analogues: versatile bioactive molecules for combating inflammation and cancer, Clinical Experimental Pharmacology Physiology, 39, (2012), 3, pp 300310 [9] Đỗ Huy Bích cộng sự, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, (2004), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [10] Ming-Der Shi, Hui-Hsuan Lin, Tai-An Chiang, Li-Yu Tsai, Shu-Mei Tsai, Yi-Chieh Lee, Jing-Hsien Chen, Andrographolide could inhibit human colorectal carcinoma Lovo cells migration and invasion via down-regulation of MMP-7 expression, Chemico-biological interactions, 180, (2009), 3, pp 344-352 [11] Waranya Chatuphonprasert, Kanokwan Jarukamjorn, Sachiko Kondo, Nobuo Nemoto, Synergistic increases of metabolism and oxidation–reduction genes on their expression after combined treatment with a CYP1A inducer and andrographolide, Chemico-biological interactions, 182, (2009), 2-3, pp 233-238 [12] Qizhen Du, Gerold Jerz, Peter Winterhalter, Separation of andrographolide and neoandrographolide from the leaves of Andrographis paniculata using high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A, 984, (2003), 1, pp 147-151 [13] GA Akowuah, I Zhari, I Norhayati, Mariam, HPLC and HPTLC densitometric determination of andrographolides and antioxidant potential of Andrographis paniculata, Journal of Food Composition Analysis, 19, (2006), 2-3, pp 118-126 [14] L Huber, Validation of Analytical Methods, Agilent Technologies Printed in Germany, (2010), pp 5990-5140EN [15] W Horwitz, AOAC guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals, Gaithersburg, MD, USA: AOAC International, (2002), pp 12-19 Tác giả liên hệ: Tên: Nguyễn Ngọc Tuấn Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm Email: nguyenngoctuan@iuh.edu.vn Điện thoại: 0938759525