Tiểu luận - kiểm nghiệm dược phẩm - đề tài - Tìm hiểu về sắc ký

TÌM HIỂU VỀ SẮC KÝ

1 C ÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG

Thời gian lưu

tR : thời gian lưu của

một một cấu tử từ khi

vào cột đến khi tách ra

khỏi cột

to : thời gian lưu chết

tR’ : thời gian lưu thật

của một cấu tử

CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

CM : nồng độ cấu tử trong pha động

X pha động  X pha tĩnh

K = CS/CM

Hệ số dung lượng k’

Là thông số thực nghiệm quan trọng để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột

 Là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại

trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó

di chuyển trong pha động suốt chiều dài của cột nếu không bị lưu giữ tM

1 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG

Qs: lượng chất trong pha tĩnh

Qm: lượng chất trong pha động

tR: thời gian lưu

t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh

t0: thời gian chết

Ta có hệ thức:

Wh=1,18Wi

1 C ÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG

Hệ số đối xứng của pic F

 Hệ số đối xứng(hay hệ số kéo đuôi) của một pic được

tính theo công thức:

 Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic Khi F=1 thì pic hoàn toàn đối xứng (lí tưởng)

1 C ÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG

 Hiệu năng của cột và số đĩa lí

thuyết biểu kiến

 Hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của

cột) biểu thị dưới dạng số đĩa lí thuyết biểu

kiến(N), có thể tính theo công thức sau:

 Trong đó:

 tR: thời gian lưu hay thể tích lưu hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường

thẳng góc kẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất

 Wh: chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo (thời gian,thể tích hay

khoảng cách)

 Lưu ý: số đĩa lí thuyết biểu kiến thay đổi theo

chất,theo cột,theo thời gian lưu

2 MÁY HPLC

Sơ đồ nguyên lí của máy HPLC

2 MÁY HPLC

 Máy sắc ký hiệu năng gồm các bộ phận :

• Bình chứa dung môi

• Bơm phải tuân thủ các yêu cầu :

• Tạo được áp suất cao 3000-6000psi

• Lưu lượng bơm khoảng 0.1 – 10ml/phút

• Không bị ăn mòn bởi các thành phần pha động

• Tốc độ bơm ổn định

2 MÁY HPLC

 Hệ tiêm mẫu

• Có thể tiêm mẫu vào đầu cột Phương pháp phổ biến là dùng tiêm có vòng mẫu , có dung tích xác định và chính xác

• Một số máy HPLC hiện đại có thể lập trình toàn bộ trên máy tính

 Cột

• Được dùng phổ biến là thép không gỉ

• Chiều dài :10-30cm , dtr : 2-5mm, hạt chất nạp cỡ : 10um

5-• Chất nạp thường là : silicagel hoặc silicagel có bao một chất lỏng hữu cơ hoặc liên kết hóa học với một chất lỏng hữu cơ

2 MÁY HPLC

 Detector

• Là bộ phận phát tín hiệu và đo các tín hiệu sinh ra khi có các chất ra khỏi cột và được ghi dưới dạng pic

• Các loại detector hiện nay :

o Detector tử ngoại và khả kiến

o Detector diod

o Detector đo chỉ số khúc xạ

o Detector huỳnh quang , điện hóa

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

Sắc kí phân bố hiệu năng cao

 Nguyên lí: sự tách loại sắc kí này tuân theo các quy luật phân bố của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn là pha động và lớp màng pha tĩnh

 Ứng dụng: sắc kí phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì

có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối

lượng phân tử không quá lớn(<3000)

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

Sắc kí hấp phụ( sắc kí lỏng rắn)

 Nguyên lí: là quá trình hấp phụ chất phân tích trên bề

mặt chất rắn Pha tĩnh là chất rắn phân cực Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Lưu giữ chất phân tích bằng lực hấp phụ

 Ứng dụng: được dùng nhiều để tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước có phân

tử nhỏ hơn 5000 Phương pháp này mạnh hơn hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

Sắc khí trao đổi ion

 Nguyên tắc: dựa vào lực huts của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh Chất trao đổi anion có

nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan Chất trao đỏi cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút cation chất tan Chất trao đổi anion và cation gọi là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion

 Ứng dụng: dùng để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất Tăng nồng độ các thành phần vi lượng trong dung dịch

đủ để phân tích Áp dụng cho sắc kí hiện đại

-Các mẫu nước, bao gồm các dịch sinh lí cũng nhận được sự quan tâm của IPC

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

Sắc kí trên gel( sắc kí cỡ)

 Nguyên lí: sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử của các chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các

lỗ xốp của pha tĩnh Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ

chui vào bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải ra sau Các phân tử có kích thước lớn nằm ở lại

ngoài nên được rửa giải ra trước

 Ứng dụng: Tách các mẫu có khối lượng phân tử lớn,

polumer, xemlulozo,

3 C ÁC KĨ THUẬT HPLC

Sắc kí trên gel( sắc kí cỡ)

 Nguyên lí: sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử của các chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các

lỗ xốp của pha tĩnh Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ

chui vào bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải ra sau Các phân tử có kích thước lớn nằm ở lại

ngoài nên được rửa giải ra trước

 Ứng dụng: Tách các mẫu có khối lượng phân tử lớn,

polumer, xemlulozo,

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

Phương pháp chuẩn nội

Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp chuẩn hóa điện tích

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

 Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến

hành trong cùng điều kiện

 So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính

được nồng độ của các chất trong mẫu thử

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

 Chuẩn hóa nhiều điểm:

- Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao của pic ở mỗi điểm chuẩn

- Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ chất chuẩn(C)

- Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định có thể thực hiện tính toán theo hai cách:

+ Áp dụng dữ kiện diện tích hoặc chiều cao pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ chất phân

tích

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

+ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định

Y= a + bCX

Y: diện tích pic

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: độ dốc của đường chuẩnCx: nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải

nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

2 Phương pháp chuẩn nội.

- Thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

- Từ các dữ kiện : diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

Tính theo nồng độ:

mC, mIS là khối lượng của chất chuẩn và chuẩn nội

CC, CIS là nồng độ của chất chuẩn và chuẩn nội

SC, SIS là diện tích pic chuẩn và chuẩn nội

 Định lượng thành phần trong mẫu thử

- Phương pháp chuẩn 1 điểm: Chuẩn nội được thêm và cả hai, mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:

Tính theo nồng độ ta có:

 Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một

dãy chuẩn có chứa những lượng (hoặc nồng độ) chất

chuẩn khác nhau tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chuẩn nội

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

Sau khi sắc ký và thu được các dữ kiện diện tích, tiến hành

và vẽ đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic của chuẩn trên chuẩn nội (SS/Sis) với tỷ số của nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (Cs/CIS)

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

3 Phương pháp thêm chuẩn.

Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn nội và chuẩn ngoại

 Kỹ thuật so sánh:

Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký

Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất

chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử

Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện

Nồng độ chưa biết Cx của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ C và sự tăng của diện tích (hoặc

chiều cao) pic S theo CT:

- Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

- Dựng đường chuẩn tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của pic tổng (thử +chuẩn) với lượng hoặc

nồng độ của chất chuẩn thêm (C)

- Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành chính

là nồng độ của chất cần xác định

4 C ÁC PP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC

4 Phương pháp chuẩn hóa điện tích

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong

hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diên tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện

Tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau

Kỹ thuật này được sử dụng nhiều trong sắc ký khí vì

thường có đáp ứng như nhau ở detector ion hóa ngọc lửa Trong khi đó lợi ích của kỹ thuật này trong HPLC bị hạn chế vì đáp ứng như nhau là điều thiếu chắc chắn