Sắc ký trao đổi ion sắc ký đảo pha sắc ký kị nước

Sắc ký trao đổi ion- Sắc ký đảo pha- Sắc ký kị nước Giảng viên: TS Nguyễn Trí Nhân Sắc ký trao đổi ion ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY ĐỊNH NGHĨA �Sắc ký trao đổi ion (IEC) kỹ thuật phân tích thường sử dụng để phân tích xác định ion, phân tử phân cực Dựa vào điện tích chia làm loại: • Sắc ký trao đổi anion • Sắc ký trao đổi cation ĐIỆN TÍCH CỦA PROTEIN Protein tích điện thay đổi điện tích theo pH mơi trường ❖pI (Isoelectric point) :điểm đẳng điện giá trị mà tổng điện tích (+) tổng điện tích (-) ❖Ở pH thấp (pH < pI), protein tích điện dương ❖Ở pH cao (pH > pI), protein tích điện âm ❖Ở pH = pI +/- 1: protein có điện tích đủ để bám lên phần tử tích điện trái dấu ĐIỆN TÍCH CỦA PROTEIN Khoảng 70% protein có pI pH 4- 7, pH sinh lý, hầu hết protein có điện tích âm Ở pH sinh lý (7), Aspartic acid glutamic acid đóng góp điện tích âm bề mặt protein điện tích dương đóng góp arginine, lysine THÀNH PHẦN 3.1 Chất Chất bao gồm hạt nhóm chức tích điện dương âm liên kết cộng hóa trị với thành rắn Các chất phổ biến cellulose, agarose, polymethacrylate, polystyrene polyacrylamide 3.1 Chất Bảng: Tóm tắt loại resin phổ biến 3.1 Chất Nhóm chức Resin: 3.1 Chất Kích thước hạt: ❖ Smaller particles: cung cấp độ phân giải cao thường yêu cầu tốc độ dòng chảy thấp ❖ Larger particles: cho phép tốc độ dòng chảy cao mang lại độ phân giải thấp 3.1 Chất Tốc độ dòng chảy: ❖ Tốc độ dòng chảy (Flow rate): tốc độ dịng chất lỏng truyền qua resin Do đó, tốc độ dòng chảy xác định khoảng thời gian mà protein tương tác với resin, gọi thời gian lưu trú (residence time) tốc độ dòng định Thời gian lưu trú lâu làm tăng khả bắt giữ protein mục tiêu ❖ Sức chứa cột: khả bám lượng protein định, thường đo mg/ml protein Flow rate định 10 3.2 Buffer Examples of buffers which can be used for IEX ❖ Lựa chọn dung dịch đệm thích hợp, thường từ 10 đến 25 mM, pH =pI+1 (anion IEX), pH =pI-1 (cation IEX) (pI protein mục tiêu) ❖ Mẫu nên pha loãng loại buffer (correct pH, low salt) với pha động ban đầu (starting buffer) 11 HỆ THỐNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION • Một máy bơm áp suất cao, báo áp suất lưu lượng • Kim phun • Cột • Máy dị • Hệ thống thu thập liệu 12 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN EQUILIBRATION LOADING & WASHING ELUTION REGENERATION 13 5.1 EQUILIBRATION ❖ Starting buffer cho vào cột ❖ Counter ion liên kết với nhóm chức tích điện trái dấu resin 14 5.2 LOADING & WASHING ❖ Mẫu chuyển vào cột máy bơm, nhồi xy lanh,… ❖ Protein mang điện tích lớn gắn cạnh tranh vào resin nhóm chức tích điện ❖ Pha động ban đầu (starting buffer) dùng để rửa thành phần không bám vào resin 15 5.3 ELUTION ⮚ Các protein liên kết với cột rửa giải theo thứ tự tăng dần điện tích bề mặt ❖ Rửa giải gradient muối (NaCl) cách sử dụng nồng độ muối tăng dần ❖ Rửa giải thay đổi pH Làm thay đổi điện tích protein bị hấp phụ =>giảm lực với cột ❖ Rửa giải lực: bổ sung phối tử có điện tích trái dấu liên kết mạnh với protein mục tiêu 16 Rửa giải gradient muối 17 Rửa giải gradient muối 18 Rửa giải thay đổi pH Rửa giải protein (vết màu xanh) với pH tăng dần (vết màu đỏ) 19 Ví dụ: 20 .. .Sắc ký trao đổi ion ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY ĐỊNH NGHĨA ? ?Sắc ký trao đổi ion (IEC) kỹ thuật phân tích thường sử dụng để phân tích xác định ion, phân tử phân cực Dựa... phân tử phân cực Dựa vào điện tích chia làm loại: • Sắc ký trao đổi anion • Sắc ký trao đổi cation ĐIỆN TÍCH CỦA PROTEIN Protein tích điện thay đổi điện tích theo pH mơi trường ❖pI (Isoelectric... =pI+1 (anion IEX), pH =pI-1 (cation IEX) (pI protein mục tiêu) ❖ Mẫu nên pha loãng loại buffer (correct pH, low salt) với pha động ban đầu (starting buffer) 11 HỆ THỐNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION • Một