PowerPoint Presentation SẮC KÝ PHA ĐẢO Giảng viên TS Nguyễn Trí Nhân Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký phân bố partition chromatography Sắc ký ion ion chromatography Sắc ký hấp phụ adsorption ch[.]
SẮC KÝ PHA ĐẢO Giảng viên: TS Nguyễn Trí Nhân Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sắc ký ion ion chromatography Sắc ký hấp phụ adsorption chromatography Sắc ký phân bố partition chromatography Sắc ký pha thường Sắc ký rây phân tử gel permeation chromatography Sắc ký pha đảo GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮC KÝ PHÂN BỐ • Sắc ký phân bố (partition chromatography) kỹ thuật sắc ký mà chất tan tách dựa vào độ phân cực pha: pha động lỏng pha tĩnh chứa giá thể • Chất sử dụng làm giá thể pha tĩnh thường silica vật liệu khác Hình Hệ thống phân tích HPLC (shimadzu.com/an/service-support/technical-support/ analysis-basics/basic/what_is_hplc.htm) Hình Ngun lý sắc ký phân bố (Dale Faith Dumalagan) GIỚI THIỆU PHÂN BIÊT SẮC KÝ PHA THUẬN VÀ SẮC KÝ PHA ĐẢO Sắc ký pha thuận Nguyên lý • Pha tĩnh phân cực: nước, • Pha động phân cực: hexan, Áp dụng • Tách phân tích hợp chất có độ phân cực cao Sắc ký pha đảo Ngun lý • Pha tĩnh phân cực: hydrocarbon, • Pha động phân cực: methanol,… Áp dụng • Phân tích hợp chất từ khơng phân cực đến phân cực • Phân tích hầu hết hợp chất hữu có mạch carbon dài (ít phân cực) GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮC KÝ PHA ĐẢO Pha tĩnh: • Dung mơi khơng phân cực giá thể (silica) • Silica gắn thêm chất chứa 18 carbon (C18) carbon (C8) Từ giúp silica từ chất phân cực trở thành chất khơng phân cực Hình Cấu trúc giá thể gắn C18 C8 (vinaquips.com/vi/tai-lieu) GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮC KÝ PHA ĐẢO Pha động: • Chứa dung môi phân cực cao axetonitril, metanol 2-propanol bổ sung nước • Thành phần cố định thay đổi (gradient nồng độ) GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮC KÝ PHA ĐẢO Nguyên lý: • Các phân tử phân cực khơng có nhiều lực hút với nhóm khơng phân cực gắn silica, nên di theo pha động di chuyển nhanh • Các phân tử khơng phân cực có lực hút với nhóm gắn silica lực van der Waals tan pha động nên di chuyển chậm Hình Mơ hình kết HPLC (sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents) PHƯƠNG PHÁP • LIỆU VẬT Thiết bị: • Máy dị UV • Cột octadecylsilica (C18) đảo pha (đường kính 4,6,dài 250, kích thước hạt 5, kích thước lỗ 300) • Thiết bị lọc dung mơi có lọc Teflon 0,22 • Bộ lọc mẫu rỗng 0,22 • Buffer A: 0,1% TFA (Triflouroacetic acid) • Buffer B: 100% Acetonitrile) chứa 0,1 % TFA PHƯƠNG PHÁP • Phương pháp Chuẩn bị mẫu: • Hồ tan 1mg mẫu 1mL Buffer A • Lọc phần khơng tan lọc 0,22 Chuẩn bị dung mơi: • Dung mơi phải lọc qua lọc 0,22 • Nhằm loại bỏ hạt bụi làm tắt đường dung môi cột khử khí PHƯƠNG PHÁP Phương pháp • Hiệu chỉnh cột chạy thử: • Kết nối phần bảo vệ cột với hệ thống phân phối dung môi HPLC hiệu chỉnh điều kiện cân sau: Dung mơi: 100% buffer A Tốc độ dịng: 1mL/phút Bước sóng phát hiện: 215nm Nhiệt độ: mơi trường xung quanh • Sau thu đường ổn dịnh, bơm vào 10 nước siêu tinh khiết • Nên thực hai lần chạy thử để đảm bảo cân thích hợp cho cột PHƯƠNG PHÁP Phương pháp Tiêm phân tích mẫu: • Sau thu đường ổn dịnh, bơm vào 10𝜇𝑙 mẫu (bằng tay mẫu (bằng tay kim phun tự động) • Sự dụng gradient tuyến tính từ 0-100% buffer B 30 phút để rửa giải mẫu Hình Sơ đồ minh hoạ q trình tính chế peptit tổng hợp (Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography) 10 PHƯƠNG PHÁP Phương pháp Hình Hệ thống phân tích HPLC (shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis-basics/basic/ what_is_hplc.htm) 11 PHƯƠNG PHÁP • Một số yếu tố ảnh hưởng Thơng số hoạt động: thay đổi q trình phân tách • Phối tử cố định: loại n-alkyl (thường C18) ảnh hưởng đáng kể đến lưu giữ peptit protein nên sử dụng để điều khiển tính chọn lọc phân tách • Hình dạng hình học hạt: đường kính hạt từ 3-5 phổ biến sắc ký đảo pha • Kích thước cột: phụ thuộc vào hiệu mong muốn kích thước mẫu 12 PHƯƠNG PHÁP Một số yếu tố ảnh hưởng Thơng số hoạt động: thay đổi q trình phân tách • Dung mơi hưu cơ: axetonitril, metanol 2-propanol, thể độ suốt quang học cao bước sóng phát sử dụng để phân tích peptit protein • Tốc độ dịng: Tuỳ theo đường kính cột có tốc dộ dịng phù hợp Ảnh hưởng pH đến kết phân tích: • Mơi trường q acid (pH < 2) có phân ly nhóm ether (-O-SiC18) khỏi Lúc cột hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích khơng cịn tương tác tốt với pha tĩnh • Mơi trường base (pH > 7) giá thể silica bị hịa tan (SiO2 thành silicat) làm số nhánh ghép giảm thời gian lưu giảm Dẫn đến kết phân tích độ xác 13 PHƯƠNG PHÁP Một số yếu tố ảnh hưởng Hình Mơ hình kết HPLC (sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents) 14 KHUYẾT ĐIỂM Thường gây biến tính protein Hình Sự gắn kết protein peptide silica (Aguilar et al.,2004) 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aguilar, M I (2004) Reversed-phase high-performance liquid chromatography In HPLC of Peptides and Proteins (pp 9-22) Springer, Totowa, NJ Carr, D (2016) A guide to the analysis and purification of proteins and peptides by reversed-Phase HPLC Advanced Chromatography Technologies 16 ... BIÊT SẮC KÝ PHA THUẬN VÀ SẮC KÝ PHA ĐẢO Sắc ký pha thuận Nguyên lý • Pha tĩnh phân cực: nước, • Pha động phân cực: hexan, Áp dụng • Tách phân tích hợp chất có độ phân cực cao Sắc ký pha đảo Ngun... chromatography Sắc ký pha đảo GIỚI THIỆU GIỚI THIÊU SẮC KÝ PHÂN BỐ • Sắc ký phân bố (partition chromatography) kỹ thuật sắc ký mà chất tan tách dựa vào độ phân cực pha: pha động lỏng pha tĩnh chứa.. .Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sắc ký ion ion chromatography Sắc ký hấp phụ adsorption chromatography Sắc ký phân bố partition chromatography Sắc ký pha thường Sắc ký rây phân tử