Sắc ký ái lực sắc ký lọc gel

Môn: Protein: Cấu trúc, chức & công nghệ Giảng viên: TS Nguyễn Trí Nhân SẮC KÝ ÁI LỰC SẮC KÝ LỌC GEL -1- SẮC KÝ ÁI Affinity LỰC Chromatography -2- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý ❑ Sắc ký lực phương pháp phân tác SẮC KÝdựa ÁItrên LỰC protein tương tác chuyên protein mục tiêu pha động phối t cố định pha tĩnh ❑ Thành phần Pha động: Gồm hỗn hợp protein cần tinh sạ Pha tĩnh : ✔ Chất (resin): hỗ trợ để phối tử gắn v ✔ Vùng đệm (spacer arm): Tối ưu việc b phối tử protein mục tiêu ✔ Phối tử: bám với protein mục tiêu Figure Components of affinity chromatography -3- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý SẮC KÝ ÁI LỰC Kháng thể - Kháng nguyên Cơ chất - Enzyme -4- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý SẮC KÝ ÁI LỰC Lectin - Sugar Ion kim loại – Histidine Imidazole Thiol hoạt hóa – Protein chứa CYS trung tâm hoạt tính -5- SẮC KÝ ÁI LỰC Có tính trơ B, Điều kiện hoạt động RESI N để tránh liên kết đồng thời thành phần không mong muốn Ví dụ: vật liệu Silica Native silica Diol-bonded silica -6- SẮC KÝ ÁI LỰC Có tính hóa học ổn định B, Điều kiện hoạt động RESI N Ổn định trước tác nhân như: • Enzyme • Những dung dịch sử dụng sắc ký thay đổi đột ngột 🡪 Có thể phá vỡ liên kết cấu trúc resin, làm yếu liên kết resin phối tử -7- SẮC KÝ ÁI LỰC Độ bền học B, Điều kiện hoạt động RESI N Gặp nhiều áp lực ngược (backpressure) lipid, protein biến tính, tạp chất khác Hình ảnh mang tính chất minh họa Thực chất cột không trông -8- SẮC KÝ ÁI LỰC B, Điều kiện hoạt động RESI N Kích thước lỗ hợp lý • Kích thước lỗ > Kích thước protein khoảng lần Ví dụ: � Hạn chế cản trở protein loại trừ protein dựa kích thước • Nếu lỗ q to: diện tích bề mặt cịn lại tổng thể nhỏ đáng kể � Hạn chế khả bám với phối tử Nguồn: Medgadget Loại resin Kích thước lỗ 4% and 6% agarose 700 and 300 Å Silica 40 to 4000 Å Polymethacrylate 100, 200, 500, or 1000 Å -9- SẮC KÝ ÁI LỰC B, Điều kiện hoạt động RESI N Agarose loại giá thể phổ biến nhất: ▪ Giá thành rẻ ▪ Có tính trơ ▪ Trong khoảng pH rộng từ đến 12 ▪ Chịu tất chất rửa giải gốc nước hay sử dụng Yếu điểm: độ bền học không cao nên hạn chế sử dụng agarose làm resin sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Figure Độ phổ biến loại giá thể dùng sắc ký lực (được tác giả tổng hợp từ nghiên cứu từ năm 1968 tới năm 2019) ... Components of affinity chromatography -3- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý SẮC KÝ ÁI LỰC Kháng thể - Kháng nguyên Cơ chất - Enzyme -4- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý SẮC KÝ ÁI LỰC Lectin - Sugar Ion kim loại –...-1- SẮC KÝ ÁI Affinity LỰC Chromatography -2- SẮC KÝ ÁI LỰC A, Nguyên lý ❑ Sắc ký lực phương pháp phân tác SẮC KÝdựa ÁItrên LỰC protein tương tác chuyên protein... phối tử -16- SẮC KÝ ÁI LỰC C, Quy trình hoạt động Sắc ký lực cộng cố định kim loại Tinh protein có histag Nguồn: Modified from Biorender -17- SẮC KÝ ÁI LỰC C, Quy trình hoạt động Sắc ký lực cộng