THU NHẬN PROTEIN Lz-8 TỪ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO NẤM LINH CHI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT GPC VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số (14) – 2014 THU NHẬN PROTEIN Lz-8 TỪ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO NẤM LINH CHI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT GPC VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Bá Tư(1), Nguyễn Thanh Thuận(1), Nguyễn Anh Dũng(1), Tăng Công Trường(2) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một, (2) Sở Khoa học Cơng nghệ tỉnh Bình Dương TĨM TẮT Trong báo công bố kết từ việc sử dụng hệ thống sắc ký GPC sắc ký lỏng hiệu cao HPLC nhằm làm tăng hiệu thu nhận Lz-8 tự nhiên (Lz-8 protein họ protein điều chỉnh miễn dịch (fungal immunomodulatory protein -FIP)) Kết rằng, qua phân tích Deconvolution từ HPLC cho thấy có mass với giá trị: 12420 ±0.005 Da Lz-8 giàu Asparagine (chiếm 18.37%), Valin (9.79%) Threonine (8.24%) Đồng thời, kết Lz-8 tinh từ phân đoạn 1GPC thiếu vắng có mặt số amino acid Half-Cystein, Methionine Lz-8 thu nhận có phản ứng gây tan cục máu đơng bốn nhóm máu người, khơng làm tan máu cừu, điều chứng tỏ hoạt tính loại protein Sử dụng phương pháp HPLC thấy hiệu ly trích Lz-8 đạt 30%, cao phương pháp trước Kino cộng (cs) (1989) sử dụng hệ thống sắc ký lọc gel Sephadex G75 với hiệu thu thấp, khoảng 5-10 mg Lz-8 từ 340 gram thể qua Từ khóa: linh chi, thu nhận, sắc ký GPC, sắc ký HPLC, amino acid * Giới thiệu cứu mũi nhọn lĩnh vực y - sinh học, tập trung tác động vào hệ miễn dịch thể Họ nấm Linh chi (Ganodermataceae) chống lại bệnh nội sinh biết có 200 lồi với nhiều lồi quý kháng nguyên ngoại lai bất lợi [1],[2],[3] Linh chi chuẩn (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) sử dụng Về thành phần hoá học hoạt lĩnh vực y dược Phương Đông 2000 chất, xác định nấm năm (Stamets, 1993) nhằm điều trị Linh chi có khoảng 119 loại triterpens nhiều loại bệnh khác người nhiều loại polysaccharide có giá trị 1,3 bệnh viêm gan mãn tính, cao huyết áp, - D glucan xem yếu tố có cholesteron hố mạch máu, tiểu đường, tắc tác dụng chống ung thư Các nghiên cứu nghẽn động mạch vành, hen suyễn, viêm Krcmar cs (1999), Zhang cs loét dày (Hobbs, 1995) (2001), Tang cs (2006), Qin cs (2008)…, cho thấy hoạt chất triterpens, Hiện nay, việc ni trồng nấm linh chi polysacchrides, protein có nguồn gốc từ để thu nhận sinh khối chiết xuất sản thể nấm Linh chi có mối tương phẩm thứ cấp hướng nghiên 31 Journal of Thu Dau Mot University, No (14) – 2014 suất tổng hợp protein FIP tái tổ hợp (reFIP) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu suất thu nhận thấp mà hoạt tính reFIP xa FIP tự nhiên (Ko cs, 1997; Lin cs, 1997; Jinn cs, 2006; Li cs, 2010) Chính vậy, bối cảnh chưa tìm hệ thống hồn hảo sinh vật chuyển gen việc tìm mơi trường thích hợp cho ni cấy huyền phù thu nhận FIP tự nhiên hướng quan trọng nghiên cứu dược học Sắc ký cột GPC kết hợp với hệ sắc ký lỏng hiệu cao HPLC trở thành quy trình tối ưu cho việc tách chiết nhiều hợp chất thiên nhiên polysaccharide hay protein Lz-8 với chất lectin (dạng glyco-protein) xem phù hợp với hệ thống sắc ký Sau thu nhận hệ sợi từ kết nuôi cấy huyền phù, tiến hành ly trích protein đích Sau số kết đạt Vật liệu phương pháp – Chủng Linh chi đỏ (G Lucidum) cung cấp công ty TNHH nấm dược liệu Phú Trường An (huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai) – Hệ sợi thu nhận từ dịch lỏng, nghiền nhỏ rửa nhiều lần với PBS 10mM sau đem ly tâm 10.000 v/phút khoảng 10 phút – Thu dung dịch đông cô điều kiện lạnh thăng hoa làm giàu protein – Thu phân đoạn có khối lượng 1115KD sắc ký cột GPC • Cột Ultrahydrogel 500, kích thước 7.8 X 300mm ( đường kính 7.8mm, dài 300mm), kích thước hạt 10 àm ã Pha ng: dung dch Tris-HCl 10 mM pH •Tốc độ dịng 1mL/phút quan dương tính với đáp ứng miễn dịch thể Chẳng hạn, Tang cs (2006) chứng minh acid ganoderic T (AG-T) (một loại lanostane triterpenoid) loài Linh chi chuẩn với hàm lượng 50 µg/ ml gây ức chế dịng tế bào ung thư phổi 95 D thơng qua chế apoptosis gây nên nghỉ hoá chu kỳ tế bào sau 4-8 h, nghiên cứu tác giả cịn cơng bố AG-T có khả điều chỉnh mức biểu p53 Bax (hai protein quan trọng tham gia kiểm soát điểm giới hạn chu kỳ tế bào); hay Habijanic cs (2001) chứng minh hiệu điều chỉnh miễn dịch polysaccharide từ Linh chi đỏ lên khả tăng sinh số dịng cytokine (TNF- INF-¥) Ngoài ra, họ protein điều chỉnh miễn dịch FIPs (fungal immunomodulatory protein) giới khoa học ý việc nghiên cứu sử dụng điều trị bệnh hiểm nghèo FIP phát lần năm 1989 loài Linh chi chuẩn (Kino cs, 1989) với tên gọi Lz-8 (FIP-glu) FIP nghiên cứu kỹ với vai trò loại protein chống dị ứng phổ rộng điều hoà miễn dịch, Qin cs (2008) chứng minh với hàm lượng µg/ ml protein Lz-8 làm tế bào lách chuột tăng sinh tới 149% với hàm lượng 10 µg/ ml protein chống phản ứng ngưng kết máu người Cho tới nay, FIP tìm thấy nhiều lồi nấm khác từ nấm dược liệu linh chi đến nấm ăn kim châm, nấm rơm với phương pháp cổ điển phát Lz-8 Sau protein FIP phát tồn tự nhiên loài nấm, nay, gen mã hoá xác định chuyển vào thể mang bao gồm prokaryote eukaryote theo hướng DNA tái tổ hợp (reDNA) nhằm nâng cao hiệu 32 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số (14) – 2014 • Đầu dị RID (Refractive Index Detector) • Quy trình: mẫu sau đơng thêm dung dịch Tris-HCl 10mM pH lắc, ly tâm hút lấy phần nước tiêm vào hệ GPC Xác định hoạt tính LZ-8 phương pháp gây đơng máu máu người máu cừu ml máu loại đem rửa với PBS lần ly tâm 5000 v/phút 10 phút loại bỏ huyết tương, đem thử hoạt tính với 25µl protein (phân đoạn I GPC) 25µl gelatin 0,2% Ủ qua đêm (12 giờ) xem kết – Xác định khối lượng protein phương pháp HPLC-MS – Cột KommersiL C4, kích thước hạt 5µm, kích thước 2.1X150mm Pha động: Pha A: Tris HCl 0.01%; Pha B: acetolnitrin – Thành phần amino acid Quy trình phân tích: Thơng số kỹ thuật • Cột ZORBAX Extend C18, kích thước hạt 5µm, kích thước 4.6 X 250mm • Pha động: pha A: 90%dung dịch đệm pH 2.8 + 5% Acetonitril + 5% Isopropanol, pha B: 20% dung dịch đệm pH 1.8+ 40% Acetonitril +40% Isopropanol • Đầu dị UV bước sóng 250 nm • Tốc độ dịng 1mL/phút – Tiến trình: mẫu sau thủy phân protein thành amino acid tạo dẫn xuất hòa tan lại pha A tiêm vào hệ thống Xác định thành phần amino acid dựa phương pháp đường chuẩn (kit amino acid) Kết bàn luận Sau thu hệ sợi với sinh khối cao pH 5.0 300C (Nguyễn Bá Tư cs, 2013) từ q trình ni cấy huyền phù, chúng tơi tiến hành xác định có mặt protein Lz-8 phương pháp sắc ký GPC sắc ký lỏng hiệu cao HPLC sử dụng đầu dị UV MS 3.1 Tinh Lz-8 Hình 1: Sắc ký cột GPC thu nhận protein Lz8 Kết cho chạy GPC phát peak có khối lượng khoảng 11.000 Da -15.000 Da phù hợp với khối lượng chung protein FIP biết Phân đoạn sau thu nhận đem thử hoạt tính hemagglutination máu người (A, B, AB, O) máu cừu đề khẳng định protein đích thu Kết trình bày hình & Quy trình: ml máu loại đem rửa với PBS lần ly tâm 5000v/phút 10 phút loại bỏ huyết thanh, đem thử hoạt tính với 25µl protein (phân đoạn I GPC) 25µl gelatin 0,2% Ủ qua đêm (12 giờ) xem kết Hình 2: Kết thử hoạt tính Hemagglutination phân đoạn I GPC 33 Journal of Thu Dau Mot University, No (14) – 2014 Kết thử phản ứng gây tan cục máu đông cho thấy phân đoạn I GPC có phản ứng dương tính làm tan tất cục máu đơng với bốn nhóm máu người (A, B, AB, O) âm tính với máu cừu Kết protein đích cần thu nhận Lz-8 3.2 Khối lượng protein Sau xác định xác phân đoạn I GPC nhạy cảm với phản ứng hemagglutination, tiến hành xác định trọng lượng phân tử protein đích HPLCMS Kết hình Hình Kết phổ đồ MS Lz-8 giai đoạn tách GPC phân đoạn Ghi chú: Đường TIC Kết Deconvolution cho thấy có mass với giá trị: 12420 ±0.005 Da Kết cho thấy mass phân đoạn thu từ HPLC MS phù hợp với khoảng mass thu từ GPC (khoảng 11.000 Da -15.000 Da) phù hợp khối lượng xác peotein Lz-8 theo nghiên cứu Kino cs (1989); Ko cs (1997) khác so với khối lượng reLz-8 Liang cs (2009) với khối lượng 14.000 Da SDS-PAGE 12.722 kỹ thuật MALDI-TOF-MS, hay nghiên cứu Xue cs (2008) lại cho thấy reLz8 có khối lượng 17.000 Da… Từ kết cho thấy khối lượng thực tế protein Lz-8 có dao động tuỳ theo phương pháp tinh loại tự nhiên hay hoang dại Tuy nhiên, yếu tố định khẳng định xác có phải protein hay khơng thành phần, trình tự amino acid hoạt tính sinh học 3.3 Thành phần amino acid Xác định thành phần amino acid dựa phương pháp đường chuẩn (kit amino acid) Kết thu hình bảng Hình Sắc ký đồ mẫu protein tách từ phân đoạn GPC 34 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số (14) – 2014 Bảng Thành phần amino acid từ phân đoạn I GPC phương pháp HPLC-UV Amino acid Asparagine Threonine Glycine Serine Glutamic Alanine Half-Cystein Isoleucine Leucine % (W/W) 18,37± 0.15 8.24 ± 0.15 7.61 ± 0.10 5.78 ± 0.18 5.43 ± 0.32 6.77 ±0.15 0.00 ±0.00 5.31 ± 0.01 5.56 ±0.01 Amino acid Valine Methionine Arginine Trptophan Tyrosine Phenylalanine Lysine Histidine Proline Từ kết phân tích cho thấy Lz-8 giàu Asparagine (chiếm 18,37%), Valin (9.79%) Threonine (8,24%) Đồng thời, kết Lz-8 tinh từ phân đoạn 1GPC thiếu vắng có mặt số amino acid Half-Cystein; Methionine (trên thực tế amino acid tồn cấu trúc sơ cấp, hình % (W/W) 9.79 ±0.01 0.00 ±0.00 3.40 ±0.01 2.64 ±0.07 5.23 ±1.01 6.00 ±0.08 5.24 ±0.03 0.00 ±0.00 4.58±0.33 thành cấu trúc cấp hai amino acid Serine bị acetyl hoá nên liên kết với Methionine làm tách amino acid ra); chí cịn vắng mặt Histidine Kết phù hợp với công bố Kino cs (1989), Tanaka cs (1989), Ko cs (1995) 3.4 Hàm lượng đường tổng số Hình Kết phổ MS xác định hàm lượng đường phân đoạn từ GPC (mass [M+Na]+ 203.0524 Da) Kết từ phân tích HPLC-MS thu vấn đề: (1) nguồn vật liệu nấm thể hàm lượng đường tổng số chiếm 12.46% Từ hay hệ sợi, vách tế bào nấm phủ kết cho thấy hàm lượng đường lớp kitin dày nên việc phá tế bào cao nấm linh chi, mặt khác chất gặp nhiều khó khăn chí làm biến tính Lz-8 lectin (glyco protein), điều protein đích dẫn đến hiệu ly trích góp phần giải thích việc xác định khơng cao; (2) phương pháp ly trích protein xác khối lượng Lz-8 gặp nhiều khó FIP Trên thực tế có nhiều phương pháp khăn Trên thực tế có nhiều cơng bố áp dụng sắc ký cột nhồi không thống sinh khối Lz-8 (Kino Sephadex 75, sắc ký trao đổi ion, sắc ký cs, 1989; Xue cs, 2008; Li cs, 2011) lỏng cao áp với đầu dò UV MS… 3.5 Hiệu thu nhận protein Lz-8 Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp với đầu dò Theo nhiều nghiên cứu (Kino cs, MS UV từ phân đoạn GPC So với tác 1989; Ko cs, 1995; Hsu cs, 1997; …) giả khác phương pháp hiệu cho thấy hiệu ly trích protein tự (kết trình bày bảng 2) nhiên thuộc họ FIPs phụ thuộc chủ yếu hai 35 Journal of Thu Dau Mot University, No (14) – 2014 Bảng Hiệu thu nhận protein FIP từ phương pháp khác Loại FIP Nguồn gốc FIP- glu Ganoderma lucidum Nguồn vật liệu Hệ sợi Khối lượng mẫu (gram) 340 Lượng protein thu nhận (mg) 10 Hiệu thu nhận (%) Tác giả/năm FIP-fve Flammulina velutipes Thể 400 35 25 Sephadex G-75 Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion FIP-vvo Volvariella volvacea Thể 3000 115 32 Sắc ký trao đổi ion Hsu cs, 1997 Hệ sợi 500 39 30 Sắc ký lỏng HPLC 2012 FIP- glu Ganoderma lucidum Kết bảng cho thấy, thực tế phương pháp ly trích protein FIP tự nhiên từ chủng nấm chưa hoàn thiện, biểu hiệu ly trích cịn thấp biết rằng, hoạt tính protein tự nhiên cao nhiều so với protein thu từ mơ hình tái tổ hợp Trong kết này, việc sử dụng phương pháp HPLC góp phần cải thiện hiệu xuất ly trích từ 13% (Kino cs, 1990) lên 30%, nhìn chung so với phương pháp gần sử dụng sắc ký trao đổi in loại FIP khác chưa cao (FIP-vvo 32%; FIP-fve 25%) cách đáng kể Điều có lẽ cịn phụ thuộc nhiều yếu tố, chẳng hạn chủng nấm, cách phá tế bào, hay quy trình thiết lập hệ thống HPLC 13 Phương pháp Kino cs 1989 Ko cs, 1995 với pha động khác Như vậy, để nâng cao hiệu từ HPLC cần thay đổi pha động chí cột sắc ký hệ GPC trước đưa vào HPLC Kết luận Trong kết này, lần Lz-8, hai hệ sắc ký GPC HPLC kết hợp thu nhận thành công với hiệu tăng từ 13% (Kino cs, 1989) lên 30% Từ kết phân tích trọng lượng, thành phần amino acid Lz-8 cho thấy protein có trọng lượng 12420 Da với cho thấy giàu Asparagine (chiếm 18,37%), Valin (9.79%) Threonine (8,24%) Đồng thời, kết Lz-8 tinh từ phân đoạn 1GPC thiếu vắng sực có mặt số amino acid Half-Cystein; Methionine RECEIVING PROTEIN LZ-8 FROM SUSPENSOID FLUID CELLS OF REISHI MUSHROOM (GANODERMA LUCIDUM) BY THE TWO TECHNIQUES OF GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC AND HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (1) Nguyen Ba Tu , Nguyen Thanh Thuan(1), Nguyen Anh Dung(1), Tang Cong Truong(2) (1) Thu Dau Mot University, (2) The Department of Science and Technology of Binh Duong province ABSTRACT In this paper, we are publishing the results from the application of the gel permeation chromatography GPC and high-performance liquid chromatography HPLC to increase receiving efficiency of natural Lz-8 (Lz-8 is a protein in the immune regulatory protein family (fungal immunomodulatory protein FIP-)) Through deconvolution analysis from HPLC, the results indicated a mass with value of 12420 ± 0.005 Da Lz-8 is quite rich of Asparagine (accounted for 18.37%), followed by Valin (9.79%) and Threonine (8.24%) At the same time, 36 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số (14) – 2014 the results also indicated that Lz-8 purified from 1GPC segments is lack of the presence of certain amino acids such as Half-Cysteine; Methionine The acquired Lz-8 had reactions which caused blood clot-dissolving in the four types of human blood, but did not dissolve clots on sheep blood It showed the activity of this type of protein Using the HPLC method, we found that the achieved efficiency of extracted Lz-8 was 30%, higher than the method of Kino et al (cs) (1989) which used the Sephadex G75 gel filtration chromatography system with very low performance, only about 5-10 mg of Lz-8 from 340 gram of ascomata TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Hsu HC, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1997), Fip-vvo, a New Fungal Immunomodulatory Protein Isolated from Volvariella volvacea, J Biol Chem., 323: 557-565 [2] JINN et al, Functional Expression of FIP-gts, a Fungal Immunomodulatory Protein from Ganoderma Tsugae in Sf21 Insect Cells, 2006, Biology chemistry [3] Liang, et al (2009), Ganoderma lucidum immunomodulatory protein (Lz-8) expressed in Pichia pastoris and the identification of immunocompetence, Department of Cytobiology, Institute of Frontier Medical Science, Jilin University, Changchun, China [4] Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, Watanabe J, Tanaka S, KerKry O, Shimizu K, Tsunoo H (1989), Isolated and characterization of a new immunomodulatory protein ling zhi-8 (LZ-8), from Ganoderma lucidum, J Biol Chem., 264: 472-478 [5] Ko et al (1995), A new fungal immunomodulatory protein, FIP-fve isolated from the edible mushroom, Flammulina velutipes and its complete amino acid sequence, Eur J Biochem 228, 244-249 [6] Lin WH, Hung CH, Hsu CI, Lin JY (1997), Dimerization of the N-terminal Amphipathic a-Helix Domain of the Fungal Immunomodulatory Protein from Ganoderma tsugae (Fip-gts) Defined by a Yeast Two-hybrid System and Site-directed Mutagenesis, J Biol Chem., 272: 20044-20048 [7] Li QZ, Zheng SB, Wang XF, Bao TW, Zhou XW (2011), Preparation of rabbit antiGanoderma sinensis immunomodulatory protein polyclonal antibody, African Journal of Microbiology Research., 5(12):1562-1564 [8] Li QZ, Wang XF, Chen YY, Lin J, Zhou XW (2010a), Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungal immunomodulatory proteins (FIP-gsi) in mouse spleen cells, Appl Biochem Biotech., 162: 1403-1413 [9] Li et al 2011, Recent status and prospects of the fungal immunomodulatory protein family Critical Reviews in Biotechnology, 2011; 31(4): 365–375 [10] Liang CY, Zhang SQ, Liu ZY, Sun F (2009), Ganoderma lucidum immunomodulatory protein(Lz-8) expressed in Pichia pastoris and the identification of immunocompetence, C J Biotech 25(3): 441-7 [11] Naszeen Z et al., 2005, Study of different growth parameters in Ganoderma lucidum, Biotechnology and food research Center, PCSIR labs, USA [12] Qin et al., 2008, Functional expression of LZ-8, a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris, J Gen Appl Microbiol., (54) 37