THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ZEARALENON BẰNG SẮC KÝ CỘT MIỄN NHIỄM VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9591:2013 ISO 17372:2008 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ZEARALENON BẰNG SẮC KÝ CỘT MIỄN NHIỄM VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 9591:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 17372:2008; TCVN 9591:2013 Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ cơng bố THỨC ĂN CHĂN NI - XÁC ĐỊNH ZEARALENON BẰNG SẮC KÝ CỘT MIỄN NHIỄM VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn dùng để phân tích zearalenon thức ăn chăn ni ngun liệu thức ăn chăn nuôi, bao gồm lúa mạch, ngô, yến mạch, lúa mạch đen, bột mì, bột đậu tương, bột hạt canola ép lấy dầu (hạt cải dầu), gluten ngô, bã rượu khô, hạt đậu lăng bã củ cải đường Giới hạn định lượng 0,05 mg/kg (50 g/kg) Giới hạn định lượng thấp có tùy thuộc vào việc thực đánh giá thích hợp người sử dụng phòng thử nghiệm Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm - Lưới kim loại đan, kim loại đột lỗ lưới đột lỗ điện - Kích thước lỗ danh nghĩa TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích phịng thí nghiệm - u cầu kỹ thuật phương pháp thử TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Pipet mức TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Bình định mức TCVN 8488 (ISO 4788), Dụng cụ thí nghiệm thủy tinh - Ống đong chia độ Nguyên tắc Mẫu chiết axetonitril loãng lọc để làm Sau dịch chiết lỏng pha lỗng nước muối đệm phosphat (PBS) tinh sắc ký cột miễn nhiễm (IAC) Dịch chiết tinh phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) pha đảo có detector huỳnh quang Các mẫu nghi ngờ dương tính khẳng định cách tính tỷ số bước sóng, dùng phép phân tích HPLC pha chuẩn, cách dùng detector mảng diot Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác CẢNH BÁO - Xử lý dung môi dung dịch tủ hút Đeo kính an tồn, mặc quần áo bảo vệ tránh để tiếp xúc với da 4.1 Nước, loại phù hợp với quy định TCVN 4851 (ISO 3696) 4.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC 4.3 Metanol (CH3OH), loại dùng cho HPLC 4.4 Natri clorua (NaCL), có độ tinh khiết khơng nhỏ 99% khối lượng 4.5 Dung môi chiết, (CH3CN) = 90% thể tích Trộn 900 ml axetonitril (4.2) với 100 ml nước (4.1) Trộn 4.6 Axetonitril loãng, (CH3CN) = 50% thể tích Trộn phần thể tích axetonitril (4.2) với phần thể tích nước (4.1) Trộn Dung dịch dùng cho xyranh lấy mẫu tự động, 4.7 Metanol lỗng, (CH3OH) = 30% thể tích Trộn 75 ml methanol (4.3) với 175 ml nước (4.1) Trộn 4.8 Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4), độ tinh khiết không nhỏ 99 % khối lượng 4.9 Kali dihydrophosphat (KH2PO4), độ tinh khiết không nhỏ 99 % khối lượng 4.10 Kali clorua (KCl), độ tinh khiết không nhỏ 99 % khối lượng 4.11 Natri hydroxit (NaOH), độ tinh khiết không nhỏ 99 % khối lượng 4.12 Muối đệm phosphat (PBS) Hòa tan g natri clorua (4.4), 1,16 g dinatri hydrophosphat (4.8), 0,2 g kali hydrophosphat (4.9) 0,2 g kali clorua (4.10) lít nước (4.1) Chỉnh pH đến 7,4 dung dịch natri hydroxit (4.13) Ngồi ra, mua PBS đậm đặc chuẩn bị pha loãng để sử dụng 4.13 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,2 mol/l Hòa tan g natri hydroxit (4.11) lít nước (4.1) 4.14 Pha động HPLC Cho 460 ml axetonitril (4.2) vào bình đựng thuốc thử dung tích lít, thêm 460 ml nước (4.1) 80 ml metanol (4.3) Trộn lọc qua lọc có cỡ lỗ 0,45 m (5.14) 4.15 Dung dịch chuẩn gốc zearalenon, (C18H22O5)  50 g/ml CẢNH BÁO - Zearalenon oestrogen Việc xử lý có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học thuốc thử Cân 5,0 mg zearalenon, xác đến 0,1 mg Chuyển vào bình định mức vạch 100 ml (5.1.2) Hòa tan axetonitril (4.2) thêm axetonitril đến vạch Hiệu chuẩn dung dịch chuẩn sau: dùng pipet (5.1.3) lấy 4,0 ml chất chuẩn gốc cho vào bình định mức vạch 25 ml (5.1.2) thêm axetonitril đến vạch (khoảng g zearalenon mililit) Đo độ hấp thụ tia cực tím (UV), dùng cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm Xác định nồng độ, (C18H22O5) , tính miligam mililit, theo Cơng thức (1):  C18H22O5   Mr x1000 xAx25 x (1) Mr khối lượng phân tử tương đối zearalenon 318,4; A độ hấp thụ UV;  độ phát xạ, bước sóng 274 nm, 12 623  111 Báo cáo kết đến ba chữ số có nghĩa Dung dịch chuẩn gốc bền năm bảo quản điều kiện lạnh kín khí Hiệu chỉnh lại chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng (4.16 4.17) 4.16 Dung dịch thêm chuẩn, (C18H22O5) = 5,0 g/ml Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.15) đến 100 ml dung môi chiết (4.5) Bảo quản dung dịch tủ lạnh Chuẩn bị dung dịch tháng lần 4.17 Dung dịch chuẩn HPLC Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có nồng độ cho Bảng cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) dung dịch chuẩn HPLC (4.17.1) có pha động HPLC (4.14) Bảng - Chuẩn bị dung dịch chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn để pha lỗng Thể tích để pha lỗng Thể tích cuối Nồng độ zearalenon (ml) (ml) g/ml 4.17.1 4.16 2,0 50 0,20 4.17.2 4.16 1,5 50 0,15 4.17.3 4.16 1,0 50 0,10 4.17.4 4.16 1,0 100 0,050 4.17.5 4.17.1 5,0 50 0,020 Bảo quản tất dung dịch chuẩn HPLC tủ lạnh Chuẩn bị dung dịch tháng lần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 5.1 Dụng cụ thủy tinh thơng thường phịng thí nghiệm 5.1.1 Ống đong, phù hợp với loại A quy định TCVN 8488 (ISO 4788) 5.1.2 Bình định mức vạch, phù hợp với loại A quy định TCVN 7153 (ISO 1042) 5.1.3 Pipet, phù hợp với loại A quy định TCVN 7151 (ISO 648) 5.2 Máy đo quang phổ UV 5.3 Ống hút chân không, phù hợp với IAC 5.4 Bình nón, dung tích 125 ml 500 ml 5.5 Giấy lọc, đường kính 185 mm, ví dụ Whatman No 41 1) 5.6 Ống thủy tinh, đáy tròn, dung tích ml (kích thước 13 mm x 100 mm) loại tương đương 5.7 Ống ly tâm, dung tích 50 ml, polypropylen loại tương đương 5.8 Phễu thủy tinh, đường kính tối đa 60 mm 90 mm 1) Ví dụ sản phẩm phù hợp có bán sẵn Thơng tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm Các sản phẩm tương tự sử dụng chúng cho kết tương đương 5.9 Giấy lọc vi sợi thủy tinh, kích thước 125 mm, Whatman 934AH 1) 5.10 Cột miễn nhiễm, dung tích nạp  g zearalenon độ thu hồi  85 %, ZearalaTest1) [loại chuẩn WB (tốt loại lỗ rộng, bị tắc nghẽn)] EASI-EXTRACT 1) 5.11 Máy lắc, lắc vòng, loại tương đương 5.12 Xyranh chất dẻo, dung tích ml 5.13 Bộ lọc xyranh dùng lần, polyvinyldiflorua (PVDF), cỡ lỗ 0,45 m đường kính 13 mm 5.14 Hệ thống lọc dung môi: tất dụng cụ lọc thủy tinh thích hợp cho lọc đường kính 47 mm (5.15) nylon (polyamid) lọc PTFE đường kính 47 mm cỡ lỗ 0,45 m 5.15 Hệ thống HPLC gồm có: 5.15.1 Bơm, loại khơng xung, lưu lượng 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min 5.15.2 Hệ thống bơm mẫu, lấy mẫu tay tự động, có vịng thích hợp cho việc bơm 100 l 5.15.3 Cột phân tích, cột C18 m m, kích thước 150 mm x mm, ví dụ Waters Nova-Pak C18 1), Inertsil ODS-3 1), Lichrospher 100-RP-18 1), ACE C18 1), Waters Symmetry Shield RP18 1) Hypersil ODS/BDS 1) 5.15.4 Detector huỳnh quang, thích hợp để đo bước sóng kích thích 236 nm 274 nm đo bước sóng phát xạ 440 nm (detector có bước sóng biến thiên) 418 nm (detector có lọc phát xạ) 5.15.5 Bộ tích phân xử lý PC 5.15.6 Detector mảng diot, tùy chọn 5.16 Bộ lọc vi sợi thủy tinh, đường kính 21 mm, ví dụ Whatman GF/D 1) 5.17 Bình hứng, polypropylen, thích hợp để gắn vào đỉnh IAC, dung tích 20 ml đường kính 20 mm Có thể cần nối 5.18 Thủy tinh frit, dùng cho bình hứng (5.17), đường kính 20 mm cỡ lỗ 20 m 5.19 Sàng, phù hợp với quy định TCVN 2230 (ISO 565) 5.20 Bộ mẫu nitơ, có nồi cách thủy có khả trì nhiệt độ 50 oC  0C 5.21 Máy trộn Vortex Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình bảo quản vận chuyển Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) [1] Các mẫu cần bảo quản đông lạnh để tránh làm thay đổi mức độc tố vi nấm phát triển nấm mốc Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498) Nghiền tồn mẫu phịng thử nghiệm cho lọt hết qua sàng có cỡ lỗ danh nghĩa mm (5.19) Trộn kỹ Các nghiên cứu độc tố vi nấm khác cho thấy mẫu nghiền lọt qua sàng lỗ tròn cỡ lỗ 0,5 mm sàng cỡ lỗ 1,0 mm làm giảm độ biến thiên phép phân tích lặp lại làm tăng hiệu chiết Nên sử dụng thiết bị nghiền tạo cỡ hạt nhỏ mm; nhiên, cần cẩn thận tránh làm mẫu bị q nhiệt lỗ sàng trịn q nhỏ Nên dùng sàng lỗ tròn cỡ lỗ 0,75 mm; hầu hết mẫu nghiền lọt qua sàng có cỡ lỗ danh định 0,5 mm Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng Nên dùng mẫu kiểm soát chất lượng; kết phân tích phải đáp ứng yêu cầu độ thu hồi, nghĩa  85 % Phân tích mẫu kiểm sốt thêm chuẩn (0,10 mg/kg) theo nhóm mẫu Chuẩn bị mẫu cách dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch thêm chuẩn (4.16) cho vào 50 g phần mẫu thử trắng lúa mì ngơ trộn Phân tích thêm mẫu trắng 8.2 Chiết Tiến hành phần mẫu thử sau: Cân 50,00 g mẫu thử, xác đến 0,01g, cho vào bình nón 500 ml (5.4) Cân thêm g natri clorua (4.4) Thêm 150 ml dung môi chiết (4.5) Lắc h Tiến hành qui trình làm IAC (8.3) Các chất thức ăn gia súc ủ xilơ khơ hấp thụ gần hết 150 ml dung mơi chiết Trong trường hợp đó, tăng thể tích dung mơi chiết đến 200 ml 250 ml Bước lắc bắt đầu vào cuối ngày, dùng máy lắc (5.11) có thiết bị hẹn giờ, cần, lắc đến đầu buổi sáng ngày hôm sau, tiến hành bước 8.3 8.3 Làm cột miễn nhiễm Tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất IAC, dùng bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18), lọc GF/D (5.16) dùng cho cột ZearalaTest 1) (8.3.1) dùng cho cột EASI-EXTRACT 1) (8.3.2), rửa giải 2,0 ml chất rửa giải Đối với loại cột khác, tiến hành theo 8.3.1 8.3.2 Đối với phép phân tích mẫu nhuộm màu mức cao chất có mặt gây nhiễu sắc đồ, tùy chọn phương án Dùng methanol 30 % thể tích (4.7) rửa giải chất gây nhiễu mà khơng làm biến tính kháng thể; methanol khơng vượt q 35% thể tích Đối với tất loại IAC, để đạt giới hạn định lượng 0,05 mg/kg, để giảm biến thiên tăng sắc ký HPLC, làm bay chất rửa giải cột hịa tan thể tích tối thiểu (2,0 ml) pha động (4.14) CHÚ THÍCH 1: Có thể bổ sung nhiều 10 ml dịch lọc pha loãng vào cột bước 8.3.1.4 8.3.2.5 với điều kiện không vượt khả nạp cột Khi sử dụng thể tích lớn gây tắc thủy tinh frit cột; lúa mạch biết đến nguyên nhân gây tắc, sử dụng hai lọc thủy tinh frit để tránh tượng Cột có lỗ rộng gây tắc CHÚ THÍCH 2: Việc tinh dịch lọc dùng cho IAC ảnh hưởng đến hiệu suất cột Ngoài nguyên nhân gây tắc cột, hạt ngăn cản hấp thụ zearalenon vào kháng thể, dẫn đến độ thu hồi không ổn định thấp 8.3.1 Cột miễn nhiễm ZearalaTest 1) [dạng chuẩn lỗ rộng (WB)] 8.3.1.1 Lọc nhiều 10 ml dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.5) vào bình nón 125 ml (5.4) 8.3.1.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch chiết lọc cho vào bình định mức vạch 50 ml (5.1.2) thêm nước đến vạch Trộn Lọc dịch chiết pha loãng (khoảng 25 ml) qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7) 8.3.1.3 Nối IAC vào ống hút chân khơng (5.3) Lắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18) lên đỉnh cột Cần ống nối cho cột WB Gắn lọc vi sợi thủy tinh (5.16) Đối với cột dạng chuẩn cần đến hai lọc vi sợi thủy tinh cho số chất nền, ví dụ lúa mạch Nếu dung dịch lọc (8.3.1.2) khơng cần thủy tinh frit lọc 8.3.1.4 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc (8.3.1.2) cho vào bình hứng Rót dịch chiết qua cột tốc độ dịng cố định khơng khí qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành giọt nhỏ (từ giọt đến giọt giây) 8.3.1.5 Đối với sản phẩm có chất nhuộm màu mẫu có pic gây nhiễu rửa cột 15 ml metanol 30 % (4.7) tốc độ giọt đến giọt giây khơng khí qua cột Đối với tất loại mẫu khác, rửa cột 10 ml nước (4.1) tốc độ giọt đến giọt giây khơng khí qua cột 8.3.1.6 Tháo bình hứng lắp bình khơng có thủy tinh frit (không yêu cầu cột WB) rửa giải zearalenon cách cho 2,0 ml metanol (4.3) qua cột tốc độ khoảng giọt giây, thu lấy dịch rửa giải vào ống nghiệm ml (5.6) CHÚ THÍCH: Có thể loại bỏ thủy tinh frit khỏi bình hứng sử dụng cách dùng que khuấy đũa khuấy cho qua đáy bình hứng, bình hứng làm dùng lại 8.3.1.7 Làm bay dung dịch rửa giải đến khô, dùng cô mẫu nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0C  0C (5.20) Bổ sung 2,0 ml pha động HPLC (4.14) Trộn máy trộn vortex (5.21), tiếp tục tiến hành theo 8.4 8.3.1.8 Có thể lọc dung dịch thử qua lọc PVDF (5.13), dùng xyranh chất dẻo Dãy dịch lọc phải kiểm tra để xác nhận khơng có mặt pic gây nhiễu Với việc sử dụng thủy tinh frit (5.18) lọc bình hứng (5.17), dung dịch thử phải khơng cần phải lọc 8.3.2 Cột miễn nhiễm EASI-EXTRACT 8.3.2.1 Lọc nhiều 10 ml dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.5) vào bình nón 125 ml (5.4) 8.3.2.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch chiết lọc cho vào bình định mức vạch dung tích 50 ml (5.1.2) thêm dung dịch đệm PBS (4.12) đến vạch Trộn 8.3.2.3 Lọc dịch chiết pha loãng (khoảng 25 ml) qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7) 8.3.2.4 Nối IAC vào ống hút chân khơng (5.3) Lắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit lên đỉnh cột, dùng ống nối Gắn lọc vi sợi thủy tinh (5.16) Rửa cột 10 ml đến 20 ml dung dịch đệm PBS Nếu dung dịch lọc (8.3.2.3) không cần thủy tinh frit lọc 8.3.2.5 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc (8.3.2.3) cho vào bình hứng Rót dịch chiết qua cột với tốc độ dịng cố định khơng khí qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành giọt nhỏ (1 giọt đến giọt giây) 8.3.2.6 Đối với sản phẩm có chất nhuộm màu mẫu có pic gây nhiễu, rửa cột 15 ml metanol 30 % thể tích (4.7) tốc độ giọt đến giọt giây không khí qua cột Đối với tất loại mẫu khác rửa cột 20 ml nước (4.1) tốc độ giọt đến giọt giây khơng khí qua cột 8.3.2.7 Tháo bình hứng rửa giải zearalenon cách cho 2,0 ml axetonitril (4.2) qua cột tốc độ khoảng giọt giây, thu lấy dịch rửa giải vào ống nghiệm ml (5.6) 8.3.2.8 Làm bay dịch rửa giải đến khô, dùng cô mẫu nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0C  0C (5.20) Bổ sung 2,0 ml pha động HPLC (4.14) Trộn máy trộn vortex (5.21) 8.3.2.9 Có thể lọc dung dịch thử qua lọc PVDF (5.13), dùng xyranh chất dẻo Lô dịch lọc cần kiểm tra để xác nhận khơng có mặt pic gây nhiễu Với việc sử dụng thủy tinh frit lọc bình hứng dung dịch thử phải khơng cần lọc 8.4 Phân tích HPLC 8.4.1 Các điều kiện vận hành HPLC Pha động xem 4.14 Tốc độ dịng 1,0 ml/min Thể tích bơm 100 l Cột xem 5.15.3, có cột bảo vệ C18 Bước sóng detector Bước sóng kích thước: 274 nm Bước sóng phát xạ: 440 nm (đối với detector có bước sóng biến thiên) 418 nm (đối với detetor có lọc phát xạ) 8.4.2 Sự tương thích hệ thống 8.4.2.1 Q trình phân giải Bơm dung dịch chuẩn HPLC nồng độ 0,050 g/ml (4.17.4) Phải quan sát pic đơn lẻ; nhiên có có pic khác kèm theo pic zearaleon phải phân giải đường 8.4.2.2 Hệ số không đối xứng Hệ số không đối xứng theo dược điển Hoa Kỳ, tương đương hệ số đối xứng theo dược điển châu Âu, F, phải nhỏ 1,6 8.4.3 Xác định 8.4.3.1 Bơm 100 l (đủ vòng) dung dịch chuẩn HPLC 0,020 g/ml (4.17.5) Thực bơm dung dịch chuẩn hai lần nhiều để đảm bảo độ lập lại diện tích pic ~2 % Xác định độ tuyến tính cách bơm 100 l (đủ vịng) dung dịch chuẩn HPLC (4.17) Dựng đồ thị diện tích pic theo nồng độ zearalenon, tính microgam mililit Hệ số tương quan phải  0,999 độ tin cậy 95% giá trị chắn y phải gồm zero (bằng phép phân tích phần cịn lại) 8.4.3.2 Bơm 100 l dung dịch thử Bơm năm dung dịch chuẩn HPLC (4.17) cuối dãy phép phân tích dung dịch thử tính giá trị trung bình diện tích pic thu từ 8.4.3.1 để dựng đường chuẩn Xếp nhóm từ năm đến tám lần bơm dung dịch thử nghiệm với lần bơm 100 l dung dịch chuẩn, để kiểm tra độ dội Pha loãng dung dịch thử diện tích pic nằm ngồi phạm vi đường chuẩn 8.4.3.3 Nếu nồng độ khối lượng zearalenon mẫu thử vượt mg/kg, để đảm bảo IAC khơng bị q tải, pha lỗng dịch chiết (8.2) 10 lần dung môi chiết (4.5), lặp lại qui trình quy định 8.3 8.4.3.4 Có thể khẳng định mẫu dương tính nghi ngờ sử dụng bước sóng phát xạ 236 nm (quan sát độ nhạy tăng lên) dùng detector mảng diot Sử dụng kỹ thuật nêu 8.4.3.4.1, 8.4.3.4.2 8.4.3.4.3 8.4.3.4.1 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn derteri, sử dụng dung dịch thử 8.3.1.7 8.3.2.8 Chỉnh dải detector tắt dần máy tích phân để thu pic tương tự 8.4.3.1 Sự đồng pic khẳng định tỷ lệ diện tích pic dung dịch chuẩn dung dịch thử bước sóng 236 nm 274 nm khơng đổi Đối với diện tích pic dung dịch chuẩn tương ứng, tỷ lệ diện tích pic dung dịch mẫu thử phải phạm vi 5% 8.4.3.4.2 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn flash xenon việc xác định tỷ lệ pic sử dụng sắc ký pha đảo khơng khả thi, cường độ đèn thấp 236 nm Xác nhận lại áp dụng 8.4.3.4.1 cho detector này; cịn khơng sử dụng điều kiện pha chuẩn (xem Phụ lục A) để khẳng định mẫu nghi ngờ dương tính Thực lại 8.3 mẫu thử mẫu kiểm soát giai đoạn bay (8.3.1.7 8.3.2.8), thêm 2,0 ml hỗn hợp chloroform,hexan propan-2-ol, tỷ lệ thể tích tương ứng 50+50+3 (A.1.2) Tiến hành theo Điều A.3, dùng cột silica LC (Điều A.2) 8.4.3.4.3 Nếu dùng detector mảng diot sử dụng dung dịch thử 8.3.1.7 8.3.2.8 Ghi lại phổ (bước sóng từ 200 nm đến 400 nm) pic thời gian lưu zearalenon so sánh với phổ dung dịch chuẩn tương tự Đối với mẫu dung dịch chuẩn, phải quan sát ba độ hấp thụ tối đa (236 nm, 274 nm 316 nm) cường độ tương đối phải Bước sóng hấp thụ tối đa mẫu phải phạm vi  2nm bước sóng hấp thụ tối đa chất chuẩn Đối với phổ pic tương tự có giá trị giới hạn > 950 nằm ngồi 000 khẳng định có mặt zearalenon CHÚ THÍCH: Có thể detector mảng diot không đủ nhạy mức gần giới hạn phép định lượng Có thể cần thêm thời gian chạy, để tránh pic rửa giải chậm cần điều chỉnh pha động (4.14) để thu độ chọn lọc thích hợp pic bổ sung xuất với phép xác định UV Tính kết Tính phần khối lượng mẫu zearalezone, ws, miligam kilogam, dùng Công thức (1) Công thức (2): w s  t x ws  150 50 x x x fd m 10 v At 150 50 st x x x x fd A st m 10 V (1) (2) Trong đó:  t nồng độ zearalenon, dung dịch thử xác định từ đường chuẩn, tính microgam mililit (g/ml); At diện tích pic zearalenon dung dịch thử; Ast diện tích pic zearalenon dung dịch chuẩn HPLC (trung bình dãy chất chuẩn); st nồng độ zearalenon dung dịch chuẩn HPLC, tính microgam mililit (g/ml); m khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); V thể tích dịch lọc 8.3.1.4 8.3.2.5, tính mililit (ml); fd hệ số pha lỗng (bằng 1, trừ thể tích cuối khác ml) Báo cáo kết đến chữ số có nghĩa VÍ DỤ At 65 224 Ast 72 578 st 0,051 g/ml m 50,10 g Thể tích cuối 2,0 ml V (8.3.1.4) 10 ml fd ws  65224 150 50 2,0 x0,0510 x x x 0,137 72578 50,10 10 10 (3) 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm thực năm 2005 tiến hành theo Tài liệu tham khảo [6] [7] (xem Phụ lục B) Việc kiểm tra xác nhận phòng thử nghiệm đơn lẻ cho thấy phương pháp áp dụng cho tất loại thức ăn chăn nuôi loại hạt ngũ cốc, bột đậu tương, bột hạt có dầu (cây dải dầu), gluten ngô, loại bã rượu khô, đậu lăng củ cải đường 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử nghiệm độc lập, riêng lẻ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình xác định được, thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giới hạn lặp lại tương đối, rrel, tính Cơng thức (4): rrel  2,8 xCV(r ) (4) CV(r) hệ số biến thiên lặp lại 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng lẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình xác định được, thu sử dụng phương pháp, vật liệu giống thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không vượt 5% trường hợp vượt giá trị giới hạn tái lập tương đối, R rel, tính công thức (5): Rrel = 2,8 x CV(R) (5) Trong CV(R) hệ số biến thiên tái lập Tiêu chí độ lặp lại độ tái lặp lấy từ Bảng B.2 cho Bảng Bảng - Tiêu chí độ lặp lại độ tái lập Thông số CV(r), tối đa (%) 12,1 CV(r), giá trị trung bình a 9,25 rrel, tối đa rrel, trung bình Giá trị 34,0 a 25,9 CV(R), tối đa 19,7 CV (R), giá trị trung bình a Rrel, tối đa Rrel, trung bình 15,4 55,3 a a 43,1 Được xác định phép phân tích phương sai Các nghiên cứu cho thấy độ biến thiên phép phân tích phụ thuộc vào nồng độ chất nồng độ zearalenon 10.4 Giới hạn phép định lượng Giới hạn phép định lượng 0,05 mg/kg (50 g/kg) 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm; e) kết thử nghiệm thu kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu Phụ lục A (Quy định) Khẳng định cách dùng sắc ký pha chuẩn A.1 Thuốc thử A.1.1 Pha động HPLC Chuẩn bị cách bổ sung thể tích diclorometan, hexan, propan-2-ol axit axetic với tỷ lệ tương ứng 485+484+50+1 trộn đề A.1.2 Dung môi dùng cho chất chuẩn HPLC Chuẩn bị cách bổ sung thể tích cloroform, hexan propan-2-ol với tỷ lệ tương ứng 50+50+3 trộn A.1.3 Các dung dịch chuẩn HPLC để khẳng định Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có nồng độ nêu Bảng A.1 cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) dung dịch chuẩn (A.1.3.1) với dung môi (A.1.2) Bảng A.1 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn HPLC Chất chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn để pha loãng Thể tích để pha lỗng Thể tích cuối Nồng độ zearalenon ml ml g/ml A.1.3.1 4.16 2,0 50 0,20 A.1.3.2 4.16 1,5 50 0,15 A.1.3.3 4.16 1,0 50 0,10 A.1.3.4 4.16 1,0 100 0,050 A.1.3.5 A.1.3.1 5,0 50 0,020 Bảo quản tất chất chuẩn HPLC tủ lạnh Chuẩn bị chất chuẩn sáu tháng lần A.2 Cột Ngoài thiết bị HPLC quy định 5.15, dùng cột Zorbax SIL đường kính 4,6 mm, loại tương đương 2) m, dài 250 mm A.3 Phân tích HPLC A.3.1 Các điều kiện vận hành HPLC Pha động xem A.1.1 Tốc độ dòng 1,0 ml/min Thể tích bơm 100 l Cột bảo vệ silica 2) Ví dụ sản phẩm phù hợp có bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm Các sản phẩm tương tự sử dụng cho kết tương đương Bước sóng detector (dùng cho detector máy đơn sắc đơi) bước sóng kích thích 236 nm bước sóng phát xạ 440 nm A.3.2 Sự phù hợp hệ thống Bơm 100 l dung dịch chuẩn 0,050 g/ml (A.1.3.4; 100 l chứa 5,0 ng zearalenon) Cải tiến pha động (bằng cách chỉnh hàm lượng propan-2-ol) để thu hệ số lưu k  2,0, cần Bơm hai lần nhiều dung dịch chuẩn để đảm bảo độ lặp lại diện tích pic ~2% Xác định độ tuyến tính cách bơm 100 l dung dịch chuẩn HPLC (A.1.3) Dựng đồ thị diện tích pic zearalenon theo khối lượng, tính nanogam Hệ số tương quan phải  0,999 độ tin cậy 95% giá trị chắn y phải gồm zero A.3.3 Xác định Bơm 100 l dung dịch thử nghiệm (đã pha loãng theo nồng độ xác định pha đảo, cần) So sánh lần bơm hai dung dịch thử nghiệm với lần bơm 100 l dung dịch chuẩn thích hợp Sự đồng pic khẳng định tỷ lệ diện tích pic dung dịch chuẩn dung dịch thử bước sóng 236 nm 274 nm khơng đổi Đối với diện tích pic dung dịch chuẩn tương ứng, tỷ lệ diện tích pic dung mẫu thử phải phạm vi % Phụ lục B (tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm B.1 Cách tiến hành mẫu Một phép thử liên phòng thử nghiệm tổ chức thực theo Tài liệu tham khảo [6] [7], chín vật liệu chọn làm mẫu thử Mỗi vật liệu từ 2,5 kg đến kg nghiền, dùng máy nghiền Retsch SR3 3)được trang bị sàng cỡ lỗ 1,0 mm (từ 60 % đến 80 % vật liệu nghiền lọt qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm) Vật liệu nghiền trộn vectơ h, chia thành 50 g đến 60 g mẫu phòng thử nghiệm, dùng máy chia Retsch rotary PTZ 3) Độ đồng mẫu phòng thử nghiệm kiểm tra xác nhận cách phân tích năm nhiều mẫu phịng thử nghiệm chọn ngẫu nhiên Việc mơ tả kết thử độ đồng vật liệu nêu Bảng B.1 Tổng số 20 phòng thử nghiệm từ 13 nước châu Âu, Canada, Mỹ, Nhật Uruguay mời tham gia vào phép thử liên phòng thử nghiệm Việc nghiên cứu tiến hành hai giai đoạn: giai đoạn nghiên cứu phổ biến gồm có phép phân tích, phép khẳng định mẫu thêm chuẩn hai mẫu bị nhiễm giai đoạn nghiên cứu cộng tác gồm có phép phân tích mẫu kép mù Tổng số 13 phịng thử nghiệm chọn cho nghiên cứu cộng tác sở kết từ phép nghiên cứu phổ biến Trong tổng số 20 mẫu phòng thử nghiệm cung cấp chín mẫu Bảng B.1 mẫu mù hai lần, mẫu ngô trắng mù mẫu bột mì trắng mù Mẫu bột mì trắng cung cấp để chuẩn bị mẫu kiểm soát Tất phòng thử nghiệm gửi trả lại liệu chấp nhận khoảng thời gian u cầu Hai phịng thử nghiệm có kinh nghiệm pic nhiễu sắc đồ, nhận biết chất nhiễm bẩn Không thể nhận biết nguồn gây nhiễu, thay đổi pha động thay đổi cột HPLC đề cập báo cáo kết Vì số liệu từ phòng thử nghiệm bị loại bỏ đánh giá thống kê Đối với tất phòng thử nghiệm, hai mẫu trắng báo cáo "không phát zearalenon" mức vết (