Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của môi trường, nước dừa, BA và NAA tới khả năng nhân chồi và tạo rễ của cây trầu bà cánh phượng (Philodendron xanadu) in vitro

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của môi trường nên, nước dừa, BA va NAA đến khả năng nhân chồi và tạo rễ của cây trầu bà cánh phượng Philodendron xanadu invitro” đã được tiến hành tạ

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM TP HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

38 28 28 26 2K OK

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ANH HUONG CUA MOI TRUONG, NƯỚC DỪA, BA

VA NAA TOI KHA NANG NHAN CHOI VA TAO RE

CUA CAY TRAU BA CANH PHUQNG

(Philodendron xanadu) IN VITRO

SINH VIÊN THUC HIEN : NGUYEN MAU HUYNGANH : NONG HOC

NIEN KHOA : 2019 - 2023

Thanh phố Hồ Chí Minh, Tháng 5 năm 2024

ANH HUONG CUA MOI TRƯỜNG, NƯỚC DỪA, BA

VÀ NAA TỚI KHẢ NĂNG NHÂN CHÒI VÀ TẠO RẺ

CUA CAY TRAU BÀ CÁNH PHƯỢNG (Philodendron xanadu) IN VITRO

Tac gia

NGUYEN MAU HUY

Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng kỹ sư ngành Nông Học

Hướng dẫn khoa học

ThS NGUYEN THỊ THANH DUYÊN Wey

Thành phố Hồ Chi Minh, Tháng 5 năm 2024

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính khắc ghi công ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và day dỗ

dé con nên người, anh trai và những người thân trong gia đình đã hết lòng yêu thương,động viên và tạo mọi điêu kiện thuận lợi cho con có được ngày hôm nay.

Xin gửi lời tri ân đến ThS Nguyễn Thị Thanh Duyên, giảng viên Bộ môn Ditruyền chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí

Minh đã tận tình hưỡng dẫn cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu nhà Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô khoa Nông học Trường Đại học Nông Lâm Tp

Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bỏ ích trong suốt thời gian học tậptại nhà trường.

Quý thầy cô trong Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng đã tạo điều kiện chotôi trong thời gian thực hiện đề tài

Lời cảm ơn đến các bạn Duyên Thùy, Mậu Huy, Nhật Hào, An Khang, Thúy Vy,Minh Đức và Tú trinh đã đồng hành, truyền đạt, chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ nhiệt tình

tôi trong quá trình học tập và khoảng thời gian làm khóa luận.

Các anh, chị, các ban trong và ngoài lớp đã luôn ủng hộ động viên va tận tìnhgiúp đỡ trong thời gian tiến hành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Tp, Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2024

Sinh viênNguyễn Mậu Huy

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của môi trường nên, nước dừa, BA va NAA đến

khả năng nhân chồi và tạo rễ của cây trầu bà cánh phượng (Philodendron xanadu) invitro” đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm, Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng,

Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 8/2023 đến tháng

5/2024 Các thí nghiệm được bồ trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tô và haiyếu tố với ba lần lặp lại, nhằm xác định môi trường, lượng nước dừa, nồng độ BA và

NAA phù hợp với kha năng tạo chồi và phát triển rễ của cây trầu bà cánh phượng in

vitro.

Tir két quả nghiên cứu dat được, rút ra được một số kết luận:

Môi trường MS được bồ sung các lượng nước dừa có tác động đến quá trình tạochi của trầu bà cánh phượng Trong đó môi trường MS có bồ sung 150 mg/l liều lượngnước dừa cho các kết quả tốt nhất về số chồi (3 chdi), số lá (12 14), chiều cao chổi (1,4cm) và khối lượng chdi (2,8 g)

Môi trường MS có bồ sung hai chất điều hòa sinh trưởng BA va NAA có tác động

đến quá trình nhân nhanh chdi của trầu bà cánh phượng Trong đó, chồi cấy trong môitrường MS được bồ sung 1,5 mg/L nồng độ BA + 0,3 mg/L nồng độ NAA cho các kếtquả tốt nhất về số chồi (3,5 chồi), số lá (11 lá), chiều cao chdi (1,3 em) và khối lượng

chổi (2,8 g)

Trong giai đoạn ra rễ, chi trầu bà cánh phượng nuôi cấy trong môi trường MS

có bồ sung 0,9 mg/L NAA cho số rễ (13rễ), chiều dài rễ (7 cm), khối lượng rễ (0,8 g),

chiều cao cây (0,8 cm) và số lá (8 lá) đạt kết quả tôi ưu nhất

Trang MTR ING TA 1030 mm ÔỎ I

LOT CAM 1900 ẻ ˆ II

TOM TAT oie —- IIMỤC LUỤC 222222222222212222211222221122211122211122221112222111222211222112222121 ca IV(oe ee eS TT ƒŸỹẽeeeeccccceeeeeeeeseeeeeeeavesreosrrtoersrgtesgr VII

DANH SÁCH CÁC HÌNH -22-©22+222E2E21222112711122112211122112111 11 IX

| ' 1DAat PP l

NI 16 asassebsBebidbnoisbiaiGicttosspe4410981850:L8g/GioxE3ulS0iedgtoidgcisJ6 S3 Bi3S9BSii83SG8086b013dg8quci8gbaERx8gu/884 3Yêu cầU 5-52 222522122221221211212212112122121121112112101112121112111111121212112121 2212 rrey 2HƠI NHT1sexsseesviissdEiakiasdebsetergggirtkvaldbrgi:44004880c6180cxxgrblredirkg0EuiEbikoidainhrdbrraodisgipdinitl4itsgsggzg012xcEe® 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU -2 22©22222E222E£22E22EEtzzxzzzxrzzzszrsszscc-s 3

Val Giới CHIẾU can gá1n t0 ti EAD538188E1SSIEEIGRSSRRESSEESHBSGSSE.SESGESHESEEESEHHSNGSSLESSLE.S80858ỂL8088 M80 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại trau bà cánh phượng - 22-2 5¿22222E+2E2E+z£Ezzzzzzxe2 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học cây trầu ba cánh phượng 2-22 2 2z52+222z+- 41.2 Giới thiệu về nuôi cây mô tế bào thực vật - 2 222222+E2E22E22E22E2222222222222z2, 4

1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cay mô tế bào thực vật ở ngoài nước - 4

1.2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở trong nước -: -: :+-++ 71.2.3 Lợi ich của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô - 2-5: §

1.2.4 Quy trình nhân giống in vifrO -2-©5:©22222222222222E222221221221221221221 2c 91.2.5 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm - - 552522 <2<£+<£+c+cse2 10

10/6 NT alesse nungt08003013200E8RESESEHEEEESESBBEESSREREESERESSSESREBIEPEEHHEPSRGEEDECEREESEBNSSEBIBSSSEEGLEGESEG8E8 111.2.7 Các chất điều hòa sinh trường thực vật trong nuôi cay mô tế bào thực vật 12Deol APRS se sree cel ale rp en ecm 12

Í 22g uố! Ca EOIKKTHTTTILs.s;„sss6ss352a586282800166<6.0,Ẫ.0d3E ein enon svn Sai 300636 2808256130108053480:08081.48u86 le 33,16.5 13

1.2.8 Các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật - 14

CN naayaggueeaaavaotyyvgttirxgOAGGDENGESIONEEDRNEGSINDEGHNGUUNEGESNGEEESGI 14 1.2.8.2 Môi trường nuôi cấy - 222222222 22+222122212221222122212211 221221121122 ee 14 ID 6N 0n 15

1.3 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trên thế giới và ở Việt Nam 15

1.3.1 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trên thé giới 15

1.3.2 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trong nước 16

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU -. - 18

2.1 Thoi gian 0n 0/0 ‡'`›-. :-:Ãä^53114 18

5.2: V at Liew thigh Sin sesso 125681016161 0IESESEANGSEIAGJEERELEGG-EEEESGIEEIGSEGVERGG2EGRUS coca 18 DEO A Vat WOO TT co co 18 2.2.2 Thiết bị va dung cụ thí nghiệm -2-©22+22222E222E2221227112212271227122712221222 e2 20 2.2.2.1 Trang thiết bị thí nghiệm - 2 2 ©22+2E22E2E1221221122122122112712212221 22c 20 2.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất khác - 2 2 ©22221+2E22EE2EE22EE22122122212712221222 22c 21 2:3 Phuong phapmehién GHI cc:1scc6256662 1051 6001546805565ã58463ẸX5203EI50SG.5G0)A01535538253 85626143608 21 eek 21 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước diva đến khả năng ra chỗồi của cây trầu bà cánh phượng in Vi/rO - 2-22 5222222222222222222222222zzzscrxee 21 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chỗi của cây trầu bà cánh phượng int WifrO -. -2+©22-52-©222222222222223222122122122112212211221 21c 22 2.4 Phuong 00 0002.001 a Ả 25

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©22222222222222E2zxerxrzrrerxees 26 3.1 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng tạo chồi của cây trầu bũ cũnh phượng ŸW UŨ sen ỢH HH HH Lo 1L HH gu 0001311, 0801140 26 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và nồng độ NAA đến khả năng nhân chổi của cây trầu N3 0010915707722 37 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây trầu bà cánh phượng in

FT == ằ _ ằằằằẰ-: 52PDE TT HỊ esss-<¿ssEtsssogi2ixecB0ususgipocurliliniosogtfinesdibgBBsisxtBbsauvnorDnuiiucnordliukniosrdiroeiostdinsoso3liulobasgS1ad 52TÀI LIEU THAM KHẢO 2-222-©22222222223222212221122112211222112111 2211221112 1e 53

XU LY 495000 60

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ (ý nghĩa)

BS Gamborg et al, 1968

BA 6 — Benzyl Aminopurine

CRD B6 tri kiéu hoan toan ngau nhién

CRD — 2 Bồ trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tố

Ctv Cộng tác viên

Đ/c Đối chứng

IAA Acid Indoleacetic

ELL Lan lặp lại

MS Murashige và Skoog, 1962

MTN Môi trường nền

MT Môi trường

NAA Naphthalene Acitic Acid

NSC Ngày sau cấy

NT Nghiệm thức

TDZ Thidiazuron

Tp Thành phố

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 2.1 Thành phan của các môi trường sử dung trong thí nghiệm 19Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm Ï - - ©5555 cee testes teeeeeees DdBang 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm -2-©22©2222E+2EE+2EEE2EEE2EEESEEEerErerrrerre 21

Bang 2.4 Các thi nghiệm trong thí nghiệm 2 «0.0.0.0 eee eee eee ceeceee eee eeeeeeeenes 23

Bảng 2.5 Sơ đồ bó trí thí nghiệm 2 -2- 2 22©2222222EE2EE22EE2EE22EE2EE222E2EE2EErrrree 23Bảng 2.6 Sơ đồ bồ trí thí nghiệm 3 -©22-222222222222222E2222E2211 22A EEErrrrrrrrev 24Bang 3.1 Ảnh hưởng của hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đến số chéi(chồi) của cây trầu bà cánh phượng -2-22-©222©2+22E+2EE+2EE+2EE+2EE+2EE+zrxrzrrrsrrree Qi]Bang 3.2 Anh hưởng của hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đến số lá (lá)

iE efyiriu/Eá U2 11h (11:1: a ee ee ee eee 30

Bang 3.3 Ảnh hưởng của hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đến chiều caochỗi (cm) của cây trầu bà cánh phượng - 2 2-52©22+2E22EE+EEeEEEtrxrrrrrrrerreee 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đến khối lượng

chỗi (g) của cây trầu bà cánh phượng ở 42 NSC 2- 2: 5¿222+2222z22xczzzzzxces 36Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA và nồng độ NAA đến số chồi (chồi) của cây trầu

bã GãnH:PHWUHỠ basssesnixsyseg5551015 055000538 101133311SE8ASE14408330051395353493G114134013303430010103g00GP5H030SSE 38Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA và nồng độ NAA đến số lá (1a) của cây trầu bàcánh pHƯỢỠ sasssessseesnieesiiinitiiiiigtil11311113001383983813354556818080561335148551318cES88358S648 051504816098336 41Bang 3.7 Anh hưởng của nồng độ BA và nồng độ NAA đến chiều cao chồi (cm) của cây

TỐ ẶKSẶST-ẶẰẶẶằẶẰŸnŸằẶŸỶŸẶŸỶŸỶŸÝỶŸẰŸỶŸẰẳẶẴẰẽỶẶẰ=-.ằẶẰẮ=ỶẳỶ= 44

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ BA và nồng độ NAA đến khối lượng chồi (g) của câytriệu Ee ee 47Bang 3.9 Anh hưởng của nồng độ NAA đến kha năng ra rễ (rễ) của cây trầu bà cánh

Bang 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ (cm), khối lượng rễ (g), chiều

cao cây (cm) và số lá (lá) của cây trầu bà cánh phượng thời điểm 42NSC 50

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cây trầu bà cánh phượng 2-2-2 ©2+©2++EE++EE++EE++EE++EEtzrxrzrxrsrresrer 3 Hình 2.1 Mẫu choi trước khi cấy -2-©22¿©5222+22E+2EE+2EE+2EE+2EEvzExvzrrrrrrrrrree 22

Hình PL1.1 Dung dịch pha Stock MS và chất điều hòa sinh trưởng 55

Hình PL1.2 Bình đựng mau chồi cây trầu bà cánh phượng -: 55

Hiimh PL1.3 Dém 86 56

Himh PILL1.4 Do chidu 8n 56

Hình PL1.5 Do chiều cao ChOi ccsscsseessesseessessesssessessessesseesseesessesseesessseesesseesesesee 56 Hình PL1.6 Mẫu bị nhiễm ¿2-22 2 S52 2E2EESE2EEEE2E2EEE2EEEE2EE2E2E2E2E212.21222.cxe2 56 Hình PL1.7 Sơ đồ bồ trí TN l -55-©22222222222222222122122212212212221221221 221 Lee 56 Hình PL1.8 Sơ đồ bố trí TN 2 - 5-55-2222 2222222112212 1.cxee 57 Hình PL1.9 Sơ đồ bố trí TN 3 ©22©222E22E22E22E22E225125221121121121121121122122222 X2 57 Hình PL1.10 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến cây trầu bà cánh 16) O1U(04 8 Nes Reeeterr cette ce eer eer net eee nent ner ere eerie ernest ere eee ere reer tree ee meer eect 58 Hình PL1.11 Anh hưởng của BA va NAA đến kha năng nhân chổi cây trầu bà cánh j 8) 08 ea 58 Hình PL1.12 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây trầu bà cánh phuogng 59

GIỚI THIỆU

Đặt vân dé

Cùng với sự tiến bộ của đời sống cả về vật chất lẫn tinh thần, cây cảnh đã trở nên

gần gũi và được con người sử dụng nhiều hơn Có nhiều loài cây được con người sửdụng với nhiều mục đích trang trí khác nhau Cây trầu bà cánh phượng (Philodendron

xanadu) là loại cây cảnh luôn được người dùng ưa chuộng dùng làm trang trí nội thấtgia đình, văn phòng, khách sạn (Nguyễn Thị Anh Thư, 2021) Cây có màu sắc đẹp, có

khả năng thích ứng tốt trong không gian kín, cây có hình dáng lá đẹp và tao nhã phù hợplàm cây trang trí nội that, cây trồng chậu hoặc cắt cành dé phục vụ cắm hoa Từ những

lợi ích mang lại khiến cây trầu bà cánh phượng ngày càng được săn đón

Hiện nay có nhiều cách nhân giống cây trầu bà cánh phượng như giâm cành, gieohạt, ghép cành tạo bầu Nhưng tất cả những cách trên đều không thực sự tối ưu, thậm

chí làm cho giống bị thoái hóa, pha tạp, hệ số nhân giống không cao mà còn ảnh hưởng

đến sinh trưởng và phát triển của cây mẹ Do đó việc tìm ra giống đạt tiêu chuẩn: đúnggiống, sạch bệnh, giá thành hợp lý, chất lượng cao với số lượng lớn trong thời gian ngắn

là điều cần thiết (Phạm Thi Thu Hang va ctv, 2015)

Bên cạnh đó cấy trầu bà cánh phượng nuôi cấy mô là phương pháp rất hiệu quả

và có rất nhiều ưu điểm: sạch bệnh, dé vận chuyền và nhân nhanh với số lượng lớn

Trong đó môi trường là yêu tố rất quan trọng dé nhân chdi, tạo rễ nhanh được số lượnglớn và đồng nhất Ngoài ra nước dừa được sử dụng dé thúc đây sự tăng trưởng trong môitrường nuôi cấy mô, đặc biệt nước dừa còn có khả năng điều chỉnh sự phát triển như

cytokinin và auxin Hiện nay các chất BA và NAA được sử dụng phô biến trên thị trườngbởi tính không độc, an toàn với môi trường, dễ tìm và tác động nhanh tới khả năng nhânchôi và tạo rễ

Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài: “Ảnh hưởng của loại môi trường, nước dừa,

BA va NAA đến khả năng nhân chổi và tạo rễ của cây trầu bà cánh phượng(Philodendron xanadu) in vitro” đã được thực hiện.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu

1.1.1 Nguồn góc, phân loại trầu bà cánh phượng

Cây trầu bà hay còn được biết với cái tên: Cây trầu bà xanh, cây Hoàng TâmDiệp Loại cây này có nguồn gốc từ đảo Solomon, tên khoa học là Epipremnum aureum,

thuộc họ Araceae Hiện nay trên thé giới có rất nhéu loại trầu bà đẹp, đa dạng về màusắc và hình đáng, nhưng nỗi trội nhất vẫn là trầu bà cánh phượng nhờ vẻ đẹp vốn có vànhững công dụng mà nó mang lại.

Hình 1.1 Cây trầu bà cánh phượng

Trau bà cánh phượng được phân biệt với các loại trầu bà khác nhờ hình dang láđộc đáo của nó Hiện nay trên thế giới có các loại trầu bà tiêu biểu như: Trầu bà xanh,

trầu bà sữa, trầu bà Pháp, trầu bà cánh phượng, trau bà dé vuong xanh, trau ba dé vuong

vàng Mỗi loài đều có cho minh những đặc điểm nổi trội và ý nghĩa phong thủy riêng.Trong đó trau bà cánh phượng (Philodendron xanadu) hay còn gọi với những cái tên

như: Trầu bá lá lỗ, trầu bà lá rách, trầu bà khía là lựa chọn quen thuộc được nhiều người

sử sung để trang trí gia đình và nơi làm việc (trích dẫn bởi Pham Thị Thương, 2021)

Phân loại khoa học

GIớI (regnum) Plantae

(không phân hạng) Angiospermae

(không phan hạng) Monocots

Bộ (ordo) Alismatales

Ho (familia) Araceae

Chi (genus) Philodendron

Loai (species) Philodendron xanadu

1.1.2 Đặc điểm thực vật học cây trầu bà cánh phượng

Trau bà cánh phượng tên khoa học (Philodendron xanadu) là loài cây thân thao,

thuộc họ Ráy (Araceae), có nguồn gốc từ các nước Nam Mỹ, chính xác hơn là từ Brazil

và Paraguay (trích dẫn bởi Lurdes Samiento, 2019)

Thân cây dạng thảo, có kích thước khá lớn, cây trong tự nhiên thường mọc thànhbụi với tan lá day, chiều cao của cây tùy thuộc vào điều kiện môi trường có thể đạt được

từ 1 - 3 m, trên thân có nhiều rễ kí sinh

Lá cây có màu lục thẫm, mặt lá bóng, phiến lá có thể phát triển độ dài lên đến 60

cm, xẻ sâu theo đường gân lá, chia thùy thành dang giống hình lông chim, cuống lá dài,

cứng màu xanh đạm, gốc có bẹ ôm

Khi cây còn nhỏ lá trên cây toàn bộ không có thùy hoặc rãnh, những rảnh thùynay sẽ sớm xuất hiện khi cây đạt đến một độ tuôi nhất định

Hoa của cây trầu bà cánh phượng mọc thành cụm, nhị và nhụy hoa được bao bọc

bằng mo hoa màu trắng

1.2 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở ngoài nước

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lich sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liền

với các sự kiện nồi bật như sau :

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết về tính toàn năng của

tế bảo vào thực nghiệm Theo ông, tất cả tế bao thực vật đều có tính toàn năng, mỗi tế

bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và khi gặp điều kiện

thuận lợi thì có thê phát triển thành một cơ thê hoàn chỉnh Tuy nhiên, ông đã dùng tếbào quá chuyên biệt nên không thành công.

Năm 1922, Kotte và Robbins thực hiện lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thànhcông trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hòa thảo

Năm 1934, White (Hoa Kỳ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu

rễ cây cà chua trên môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường và dịch chiết nắmmen Ở các thí nghiệm tiếp theo, White chứng minh có thể thay thế dịch chiết nắm menbằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B Thiamin (B1), Pyridoxin(B) va Nicotinic acid Từ

đó, việc muôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác

Năm 1955, Skoog tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong tỉnh dịch cá bẹ là 6 —Furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào Việc phát

hiện vai trò của NAA, JAA, 2,4D và Kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin

và nước dừa là một bước tiến quan trọng, đây là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các

môi trường xác định về mặt hoá học, cho việc làm các thí nghiệm én định và dẫn đến

những thành công tiếp theo của ngành khoa học này

Năm 1957, Skoog va Miller công bố các kết quả nghiên cứu về anh hưởng của ty

lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹothuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hưởng phát triển rễ Ngược

lại thì dan đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác nhận trên

nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khién sinh trưởng, phát triển của

mô tê bào trong nuôi cây.

Từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cay tế bào đơn đã được phát triển Muir,

Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sửdụng máy lắc

Năm 1960, Bergman công bồ có thé ding phương pháp lọc đơn giản dé thu đượchầu hết là tế bào don mà không phải là dính cum Các tế bào đơn có thé gieo trên môi

trường, tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của

Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào,

chứng minh được tính toàn thể của tế bào

Năm 1960, Cooking (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vàcellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn không vỏ bọc, gọi làprotoplast.

Đầu những năm 1970, Nagati và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho

các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo và cellulose, phân chia, tạo nên một quần thể

tế bào trong môi trường lỏng

Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định

và hấp thụ các phân tử lớn hoặc thậm chí từ các cơ quan tử từ bên ngoài Các nhà nuôi

cây mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast dé chọn giống có kết quả hơn

Năm 1965, Ledoux và ctv đề xưởng về vấn đề biến tính của tế bào Ông cho rằngcác tế bào có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào, gây nên sự biến tính ở thực vật

Từ 1980 đến 1992, có nhiều các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene

thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyền gene ngoại lai vào nhiều họ thực

vật.

Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong nhữngứng dụng nuôi cấy mô thực vật Theo Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng củacác loại địa lan (Cymbidizm) khi đem nuôi cây sẽ hình thành các protocorm Khi chiacắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới Khi để trong các

điều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thé phát triển thành cây lan còn Do đó,

có thể phục trang, tạo ra các dòng vô tinh không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt

có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính

khác.

Hiện nay, đang bước vào giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng và phát

triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp

có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Nuôi cấy môthực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại

(Nguyễn Văn Uyén, 1989)

1.2.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở trong nước

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến

kỹ thuật nuôi cây mô thực vật

Phòng thí nghiệm nuôi cay mô tế bao đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học

Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xưởng Bước đầu phòng tập trung nghiên

cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cây bao

phan, nuôi cấy mô seo và protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa vàthuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1997; Lê Thị Xuân và ctv,

1978) Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và NguyễnĐức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981)

Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở Tp HồChí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật NôngNghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã có rất

nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện DiTruyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các Trường Đại học), mà có cả ở một

số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ

Tĩnh).

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật

phát triển mạnh Nhưng kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giốngkhoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp)

Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh

(Lê Bích Thủy va ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mat nước (Nguyễn Tường Vân

va ctv, 1994; Định Thị Tông va ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bao trần, chuyên

gen lục lạp cũng thu được kết quả khả quan (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997).Nuôi cây bao phân đề tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh

Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồnnguồn gen va tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang

được phát triển (Bùi Bá Bỗng, 1995)

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước

tiễn vượt bậc Cụ thể: Các công trình nghiên cứu tại Lâm Đồng đạt được nhiều thànhtựu: Dương Tấn Nhựt thu được nhiều kết quả trong nuôi cấy các loại hoa cúc, lyli, salem,

hồng môn, hoa hồng và đặc biệt ứng dụng hệ chiếu sáng đơn sắc của công nghệ đènLED vào luận án tại Đại học Kagawa, Nhật Bản (2002) Mới dây tác giả đã đạt được

nhiều kết qua mới về công nghệ sinh khối sâm K5 Panax vietnamensis, thông đó Taxus

wallichiana, công nghệ phôi vô tính các loại Hồ điệp (Phalaenopsis spp.), mở ra hướngcông nghệ tạo giống chủ động và sinh khối chất lượng cao với những công trình phong

phú cùng những đề tài tiềm năng lớn; Nguyễn Văn Kết và ctv triển khai thác khá thành

công nuôi cấy các loại lan rừng Cát Tiên - Lâm Đồng - Đồng Nai, và đặc biệt là đưatừng bước công nghệ nuôi cấy mô hiện đại với các hệ thống Bioreactor vào thực tiễn

nhân giống, xuất phát từ luận án tiễn sĩ tại Đại học Chungbuk, Hàn Quốc (2005) PhạmXuân Tùng đã phát triển công nghệ tạo giống khoai tây kết hợp nuôi cấy in vitro (củ bị

và siêu bị - microtuber) với công nghệ gieo hạt Hiện nay tác giả cùng các cộng sự tiếp

tục triển khai kết quả công nghệ lai tạo và chọn lọc các dòng hoa quý: cúc, đồng tiền,cầm chướng có giá trị thương mại cao (Lê Xuân Thám, n.d)

1.2.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô là:

Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ

Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn

Tạo ra các cây con sạch bệnh.

Không chiếm nhiều điện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại

cảnh Một giống cây quý có thé được nhân ra nhanh chóng dé đưa vào sản xuất Việc

trao đôi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được thực hiện

dễ dàng Thông qua nuôi cấy mô có thể ứng dụng việc chuyên gen cho những thực vật

bậc cao dé chon tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bong, 1995)

1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Đức Thanh (2000), quy trình nhân giống in vitro gồm:

Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vi trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tinh trạng của cây

mẹ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ can thận, cây mẹ thường là cây

có nhiều đặc tính ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao Sau đó, chọn cơ quan dé lay mau

thường là mô non, đoạn than có chéi ngủ, lá non hoặc hoa non Mô chon dé nuôi cây

thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được

các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, it nguy cơ biến đị Tùy theo điều kiện, giai đoạnnày có thể kéo đài 3 - 6 tháng

Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo nguyênliệu sạch bệnh cho nhân giông, giai đoạn này được tiên hành theo các bước Khử trùng

bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy Cay mau vật vào ống nghiệm hoặcbình nuôi cây có san môi trường nhân tạo (giai đoạn nay là giai đoạn cây mâu in vitro).

Các mẫu nuôi cấy nêu không bị nhiễm khuẩn, nam, virus sẽ được nuôi trong

phòng nuôi cây với điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định,

từ mẫu nuôi cay đã bat đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc các phối vô

tính Giai đoạn này phụ thuộc vào từng đối tượng đem nhân giống, thông thường kéo

dai từ 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cay chuyền

Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trình nuôicấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cây sạch đãđược tạo ra, từ đó nhận được các cum chi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt trong quá

trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh

cao nhât trong điêu kiện nuôi cây Thành phân và điêu kiện môi trưởng cân tôi ưu hóa

để tạo được mục tiêu nhân nhanh Đối với môi trường nhân chi, người ta sử dụng các

chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng độ khác nhau

tùy từng đối tượng cây Quy trình cấy chuyền đề nhân nhanh chồi thường trong khoảng

1 — 2 tháng tùy loài cây Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2 — 8 lần sau một lần cấy chuyên

Nhìn chung giai đoạn thường kéo dai 10 — 36 tháng Giai đoạn nhân nhanh chồi ban đầukhông nên kéo dai quá lâu dé tránh sự hình thành biến di soma

Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chéi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thé phát triển rễ tự sinh, nhưng

thông thưởng các chỗi này phải cay chuyền sang một môi trường khác dé kích thích tạo

rễ Đối với môi trường tạo rễ, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộcnhóm auxin như a - NAA, IAA, IBA Thông thường giai đoạn này kéo dài 2 - 8 tuần tuỳ

đối tượng Khi cây có đủ các bộ phận thân, lá, rễ với kích thích nhất định đảm bảo cho

sinh trưởng, phát triển bình thường ngoài tự nhiên, người ta mới tiến hành giai đoạn tiếptheo là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên.

Chuyén cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu cây được chuyên từ điều kiện vô trùng trong ống nghiệm ra

ngoài môi trường tự nhiên Giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng của quy trìnhnhân giống in vitro Da số các loài cây trồng chỉ sau khi chỗi đã ra rễ tạo thành cây hoản

chỉnh với kích thước nhất định mới được huấn luyện và chuyên ra ngoài vườn ươm Câynuôi cấy in vitro được sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt

độ, độ âm, pH, dinh dưỡng Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần huấn luyện cây

dé thích nghi với điều kiện tự nhiên Quá trình thích nghỉ với điều kiện bên ngoài củacây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt Vì vậy, cây được chuyên từmôi trường từ bão hòa hơi nước sang vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu: che câynon bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp độ 4m và làm mát cây; giá thê trồngcây có thé là đất mun, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, xơ đừa mùn cưa và

bọt biên, trau Giai đoạn này đòi hỏi 4 - 16 tuần

1.2.5 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường nền MS (Murashige và Skoog 1962) và B5

Môi trường nền MS và B5 đều là những loại môi trường được sử dụng phô biến

trong nuôi cay mô và tế bao thực vật, đặc biệt ở những môi trường tái sinh và nuôi cay

mô seo.

Môi trường nền MS là môi trường khởi dau cho moi quá trình nuôi cay mô đốivới mọi đôi tượng nuôi cấy Môi trường nền MS là môi trường thích hợp với nhiều loại

cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng (Trần Văn Minh, 2005)

Môi trường BŠ có khả năng kích thích tăng trưởng va phân nhánh của cây Vivậy, môi trường BS được sử dụng rộng rãi trong nuôi cay mô thực vật dé đảm bảo sự

phát triển và sinh sản của các tế bào mô (Gusmiaty và ctv, 3023)

1.2.6 Nước dừa

Nước dừa được sử dụng rộng rãi như một thành phần thúc đây tăng trưởng trongmôi trường nuôi cấy mô hơn một nửa thế kỉ trước, khi Overbeck và cộng sự đầu tiêngiới thiệu nước dừa như một thành phần mới của môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy

mô sẹo Một số thành phần quan trọng có trong nước đừa là tập hợp của phytohormone;trong đó, quan trọng và hữu ích nhất là cytokinin (Dương Tan Nhựt, 2004)

Theo George, nước dừa bao gồm nhiều axit amin, hợp chất đạm, hợp chất vô cơ,

các axit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin và có khả năng điều chỉnh sự phát triển nhưcytokinin và auxin Yong va ctv, cho thấy nước đừa chứa 94 % là nước và là chất thúc

day tăng trưởng của chéi Trong một số loài thực vật, quá trình tái sinh được gia tăngbằng cách bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy Ngoài ra, nước dừa đã được báo

cáo là có khả năng làm tăng quá trình sinh trưởng và phát triển của hoa lan trong ống

nghiệm do có sự liên quan đến sự hiện diện của một loại cytokinin (Trích dẫn bởi ĐoànHồng Trang, 2019)

Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shantz va ctv khi b6 sung nướcdừa có tác dụng kích thích quá trình nhân nhanh tế bào va mô do nước đừa có chứa một

số yêu tố tăng trưởng Khi bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy, hiệu quả kích

thích được nhận thấy chỉ xảy ra khi hàm lượng nước dừa được thêm vào từ 10 - 15% vàhàm lượng 20% là cần thiết cho quá trình tăng trưởng của mô sẹo ở một số loài cây

Năm 2012, Saranjtet va ctv nhận thay b6 sung 10% nước dừa đã thúc day qua

trình nhân nhanh protocorm và hình thành chéi có từ 2 - 3 lá và 1 - 2 rễ, đạt 73,75%(Dương Tan Nhựt, 2004)

1.2.7 Các chất điều hòa sinh trường thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong đời sống thực vật, ngoài các chất dinh dưỡng như glucid, protein, lipid,cây còn nhiều chất hoạt tính sinh lý như các vitamine, enzyme, các chất điều hòa sinh

trưởng (phytohormon) Trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật, các phytohormon rất

quan trọng trong quá trình thay đổi các đặc trưng hình thái sinh lý của cây trồng, đặcbiệt là trong tạo mô sẹo và hình thành cây hoàn chỉnh (Lê Văn Tri, 1997) Một số đặc

tính và cơ chế tác dụng của nhóm chất như auxin, cytokinin

1.2.7.1 Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA)

IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bao và điều khiển sự hình thành rễ

Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 —diclophenoxy axetic axit (2,4D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sựphân chia của mô và trong quá trình tạo rễ NAA được Went và Thimann (1937) pháthiện Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tínhenzim và ảnh hưởng đến trao đôi chất nito, tăng kha năng tiếp thụ và sử dung đường

trong môi trường NAA là một axit nhân tạo, có hoạt tính mạnh hon auxin tự nhiên IAA(Nguyễn Đức Thành, 2000)

Tác động sinh lý của auxin

Auxin có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chéi

bên (duy trì hiện tượng ưu thé ngọn)

Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng dia).

Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào Sự kéo tế

bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc) Nhờ vào tác dụng này mà

auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ, làm củ, quảphình to ra.

Auxin kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kíchthích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyén, 1989).

Ứng dụng

Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên

mô nuôi cấy Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt

Dé tăng đậu qua, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta xử lýauxin dưới dang NAA 20 ppm, 2,4 - dichlorophenoxyl acetic acid (2,4D) 10 ppm cho

một sô cây trông như ca chua, cam, chanh.

Dé kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dich NAA

(10 - 20 ppm) (Nguyễn Văn Uyên, 1989)

Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của auxin là rất cần thiết

dé kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên mỗi trường

có cytokinin dé biệt hóa chéi (Vũ Văn Vụ, 1999) Cytokinin cùng auxin điều tiết chutrình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ Nếu auxIn/cytokinn >

1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin < 1: kích thích hình thành chồi; auxin/cytokinin = 1:

kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyên và ctv, 1993)

Cytokinin kích thích sự phát triển mam hoa Cytokinin cảm ứng hình thành chồicây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũngnhư hạn chế sự phát triển của rễ

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thidiazuron),

BA (6 — Benzyl aminopurine), kinetin (6- Furfuryl amino purine) va cytokinin tự nhiêntrong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tao chi in vitro (Nguyễn Văn

Nên việc chon mẫu dé dùng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, các

kết quả nghiên cứu cho thay dé bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhấtđịnh, người ta chú trọng đến các chdi bên và mô phân sinh đỉnh của cây (Nguyễn Đức

Lượng, 2002).

1.2.8.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trưởng nuôi cấy có chứa các thành phần thích hợp cho các loài nắm, vi khuẩn

phát triển mà tốc độ phân chia tế bao của nam và vi khuân lớn hơn nhiều so với tế bào

thực vật Nếu môi trường nuôi cay bị nhiễm một vai bao tử nắm hoặc vi khuẩn thì sauvài ngày đến một tuần thì toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy sẽ bị phủ kín bởi nam,

khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy sẽ không phát triển và chếtdan Cho nên mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô rất cao mới có hi vọng

thành công Đề đảm bảo được điều đó đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

+ Vô trùng phòng cấy

+ Vô trùng mô cấy

+ Vô trùng dụng cụ, môi trường và nút đậy.

+ Thao tác trong nuôi cây cân gọn gàng tránh làm rơi các tác nhân mang nâm,

khuẩn lên bề mặt môi trường và tủ cấy

Phương pháp vô trùng mẫu cây thường dùng hiện nay là dùng các chất hóa học

có hoạt tính diệt nam, khuân Hiệu lực diệt nam khuân của các chat này phụ thuộc vào

thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng lên bề mặt mô cấy (Trần Văn

Minh, 2005).

1.2.8.3 Than hoạt tính

Than hoạt tính (Activated charcoal - AC) được sản xuất bằng cách chưng cất gỗ

và các vật liệu chứa cacbon, từ cacbon cơ bản, bằng cách loại hết tạp chất và oxy hóa bềmặt thu được than hoạt tính Than hoạt tính xốp, không vị, bao gồm các nguyên tửcacbon sắp xếp theo dạng quasi - graphitic trong dạng hạt nhỏ, có đặc tính hấp phụ cao

đối với chất rắn keo, khí và hơi nhờ mạng lưới lỗ và diện tích bề mặt lớn Các chất tiếpxúc với than hoạt tính được hấp phụ đến khi cân bằng sự hấp thụ và phân hủy (TrâmAnh, 2015).

Theo Đoàn Hồng Trang (2019), bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cay

có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các

hợp chất phenol, trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên

cứu Than hoạt tinh làm thay đổi môi trường ánh sáng, vì môi trường trở nên sam màukhi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn

là một trong những chất chống Oxy hóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng đến 3 mặt:

+ Hút các hợp chất có tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy

+ Hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy.

+ Làm đen môi trường.

1.3 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trên thế giới và ở Việt Nam1.3.1 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trên thé giới

Cây trầu bà được mô tả khoa học lần đầu tiên vào năm 2002 và đã nhanh chóng

trở thành cây trồng trang trí nội thất có giá trị Vì vậy việc mở rộng quy mô sản xuất câytrầu bà được quan tâm phát triển và mở rộng, đã có một số nghiên cứu bằng phương

pháp nhân giống in vitro rất nồi bật

Theo (Kumar Dinesh, 1998) nhân giống vô tính in vitro philodendron pertusum

đã đạt được thành công bang cách sử dung các đoạn chéi dai khoảng 1 cm lam mẫu cay

Các mẫu được khử trùng đúng cách bằng HgCl› sau đó là NaOCl Những mau cấy này

được cấy trên môi trường MS bồ sung 10 mg/1 BA kết hợp với 0,2 mg/1 IBA Sự tăng

sinh chồi được tăng cường với 3 mg/l kinetin và 1 mg/l BA trong môi trường Sự ra rễđược kích thích ở cây con diễn ra bình thường trên môi trường này

Mô tả kỹ thuật nhân giống Philodendron panduraeforme Scott bằng nuôi cay invitro chồi nách Sự tái sinh chồi xảy ra khi chồi nách được nuôi cấy trên môi trường

Murashige va Skoog (MS) thiếu chất điều hòa sinh trưởng Tái sinh nhiều chồi thu được

bang cách nuôi cay các đoạn đốt của chồi tái sinh trên môi trường MS, làm đông đặcvới 0,7% agar và bồ sung 3 mg/L benzyladenine Sự tái sinh rễ diễn ra với tần suất cao

khi các chồi tái sinh được nuôi cay lai trên môi trường MS cường độ cao, 3% sucrose,

0,7% agar và 2 mg/L than hoạt tính Các môi trường nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độkhông đổi 27°C và chu kỳ quang 14 giờ Các cây con tái sinh sau đó được trồng thànhcông trong chậu (E Flachsland và ctv, 1999).

1.3.2 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây trầu bà trong nước

Hiện nay, trên lĩnh vực công nghệ sinh học, vê cây trâu bà lá xẻ có ít nghiên cứu

ở nước ta.

Theo (Lê Thị Thúy và ctv, 2022) Nghiên cứu được thực hiện dé đánh giá tác

động của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh chdi, ra rễ và ảnhhưởng của các hợp chất hữu cơ không xác định lên sự sinh trưởng của cây trầu bà cung

dan in vitro Trong thí nghiệm tạo chồi, chồi đỉnh được nuôi cấy trên môi trường MS có

bổ sung riêng lẻ benzyl adenine (BA), kinetin và thiđiazuron (TDZ) ở những nồng độ

khác nhau Sau 12 tuần nuôi cấy, kết qua cho thay khả năng tạo chồi mới tốt nhất trên

môi trường bổ sung 1,0 mg/L BA với 59 chồi/mẫu Nghiên cứu cũng đã tiến hành bổsung nước dừa và dịch nghiền khoai tây ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôicay dé theo dõi sự sinh trưởng của chỗi cây trầu bà cung đàn Trên môi trường bổ sung

100 mL/L nước dừa, sự sinh trưởng của chôi là tốt nhất Đối với giai đoạn ra rễ, môi

trường thích hợp cho tạo rễ là môi trường MS, trong khi đó, môi trường MS và 1⁄2MS bổsung naphthalene axit axetic (NAA) ở các nồng độ khác nhau đều không thích hợp đến

sự hình thành rễ của chồi in vitro Sau giai đoạn tạo chéi và tạo rễ, các chéi in vitro đượcnuôi cay trong các bình nuôi cấy kín và túi nylon thoáng khí dé khảo sát ảnh hưởng của

hệ thống nuôi cấy lên chất lượng cây con in vitro Kết quả thu được cho thấy ở điều kiện

thoáng khí, chdi có kha năng sinh trưởng tốt hơn và cây con có tỷ lệ sống cao ở giaiđoạn vườm ươm (73,33%).

Theo (Ninh Thị Thảo và ctv, 2023) Cây trau bà Vàng Chanh (Philodendronhederaceum) là cây trồng mang lại nhiều lợi ích và có nhu cầu sử dụng cao Nghiên cứunày được tiến hành nhằm khảo sát khả năng nhân giống in vitro cây Trầu bà vàng chanh

(Philodendron hederaceum) Kết quả thu được cho thấy, môi trường MS bé sung 1,0

mg/l BA là thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh với hệ số nhân chéi đạt 2,73 lần, chiều

cao chi đạt 5,38 cm và số lá/chồi đạt 4,33 lá sau 6 tuần nuôi cấy Trong giai đoạn tiếptheo, chồi được chuyền sang môi trường MS + 0,25 mg/1 IBA dé tạo rễ Sau 5 tuần nuôicấy, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, 3,9 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình đạt 11,04 cm, cây

sinh trưởng phát triển tốt Ở giai đoạn vườn ươm, tỷ lệ cây sống đạt 100%, chiều cao

chồi và số lá tăng thêm đạt lần lượt 2,19 em và 1,96 lá sau 4 tuần trên giá thểpeatmoss:dat:xo dừa với tỷ lệ 1:1:1 Các kết quả đạt được của nghiên cứu góp phan thiết

lập quy trình vi nhân giống loài cây này với hệ số nhân giống và chất lượng cây giống

tốt làm cơ sở cho việc cung cấp nguồn giống chất lượng cho thị trường cây cảnh ở Việt

đến khả năng nhân chồi va tạo rễ của cây trau bà cánh phượng (Philodendron xanadu)

in vitro” đã được thực hiện.

Chương 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: Từ tháng 8/2023 đến tháng 5/2024

- Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng, Trại

thực nghiệm khoa Nông Học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu và hóa chất thí nghiệm

2.2.1 Vật liệu và hóa chất

- Chéi giống cây trầu bà cánh phượng sáu tháng tuổi, chiều cao 0,7 với 4 lá

- Nước dừa tươi , giống dừa xiêm

- Các chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA:

+ BA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic — Canada)

+ NAA độ tinh khiết > 99 % (hãng BioBasic — Canada)

- Môi trường nuôi cay MS và B5 có các thành phan theo bang sau:

Bảng 2.1 Thành phần của các môi trường sử dụng trong thí nghiệm.

CaCl;.2HzO 332,2 150 NaHzPO¿ ° 130,5 MgSO¡.7HaO 370 250

KH¿PO¿ 170 7

Vi luong/Micro (20x) với thê tích stock là 100ml (nồng độ 5mg/I MT)

MnSO¡.4H2O 16,9 10,0 ZnSO4.7H20 8,6 2,0 CuSO4.5H20 0,025 0,025 CoCl.6H20 0,025 0,025 NazMo4.2H2O 0,25 0,25 H3PO3 6,2 3

KI 0,83 0,75Sat EDTA (20x) với thé tích stock là 100ml (nồng độ 5mg/1 MT)

FeSOy4.7H20 17 578

NazEDTA 37,3 37,3Vitamin (20x) với thể tích stock là 100ml (nông độ 5mg/1 MT)

Myo-Inositol 100 100 Thiamine HCl (B1) 0,5 0,1 Pyridoxine HCl (B6) 0,1 10,0

Glycine 2,0 Nicotine acid (B5) 0,5 1,0

-Các thành phần khác:

- Dung địch Javen y tế (NaOCl — 12%)

- Đường saccarose: 30¢/1

- Agar: 8g/l

Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 + 0,05 (bang NaOH IN va HCI IN) trước

khi hấp khử trùng bằng nồi hap khử trùng ở 117°C, latm trong 15 phút đối với các dung

cụ thí nghiệm, dung cụ thủy tinh không chứa môi trường thì khử trùng ở 121°C, latm trong 15 phút).

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.2.2.1 Trang thiết bị thí nghiệm

Dé tiết kiệm không gian ở góc phòng còn có khu vực rửa các đồ dùng sau khithao tác, các dụng cụ, vật tư, chai lọ.

chai cấy, khẩu trang, áo blouse, gang tay và phòng có trang bị đèn UV dé khử trùng

Phòng sinh trưởng nuôi cây

Cây sau khi được cấy sẽ được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ầm, độ

dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp

Thông thường phòng nuôi có nhiệt độ khoảng từ 15- 30 oC tùy theo mẫu cây vàmục đích của thí nghiệm.

Nhiệt độ phân bố đều trong toàn phòng nuôi, có đầy đủ ánh sáng huỳnh quang

(2000-3000 lux) và có thé điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng

Phương pháp thí nghiệm: Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên (CRD - 2) với 3 lần lặp lại

Yếu tố A (môi trường): MS, B5

Yếu tô B (nước dừa): 0 mL/L; 50 mL/L; 100 mL/L; 150 mL/L

Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1.

Liều lượng nước dừa (mL/L)

Môi trường

0 50 100 150

MS NTI NT2 NT3 NT4

B5 NT5 NT6 NT7 NT8Quy mô thí nghiệm:

+ Số mẫu/chai: 2 mẫu / chai

+ Số chai: 13 chai / 1 ô cơ sở

+ Tổng số mẫu cho TN: 2 x 13 x 8 x 3 = 624 mẫu

Bảng 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

NTS NT2 NT8

NT2 NT6 NT6

NT4 NT4 NT2

Chéi cây Trầu bà cánh phượng vô trùng có chiều cao 0,7 cm có 4 lá.

Hình 2.1 Mẫu chồi trước khi cayPhương pháp lấy mẫu và chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi 10 mẫu / 5 chai/ 1 ô cơ sở, các chỉ tiêu được theo dõi 7 ngày/ lần, theo dõitrong 6 tuần

Số chồi (chồi): đếm tat cả số chdi trên cùng 1 gốc

Số lá/ chdi (1á): đếm tat cả số lá trên cụm chdi

Chiều cao chổi (cm): dùng thước do từ bề mặt thạch đến đỉnh chồi

Khối lượng chồi (g): cân khối lượng chéi ở thời điểm 42 NSC

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi

của cây trầu bà cánh phượng in vitro

Môi trường nền: Sử dụng môi trường tối ưu nhất được xác định ở thí nghiệm 1

Phương pháp thí nghiệm: Thí nghiệm hai yếu tô được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên (CRD - 2) với 3 lần lặp lại

- _ Yếu tố A (BA): 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l

- Yéu tố B (NAA): 0,3 mg/l; 0,6 mg/l; 0,9 mg/I

Bang 2.4 Cac thi nghiém trong thi nghiém 2.

Nồng độ BA Nông độ NAA (mg/l)

(mg/l) 0,3 0,6 0,9

0,5 NTI NT2 NT31,0 NT4 NT5 NT6L5 NT7 NT8 NT9

Quy mô thí nghiệm:

+ Số mẫu/chai: 2 mẫu / chai

+ Số chai: 13 chai / 1 ô cơ sở

+ Tổng số mẫu cho TN: 2 x 13 x 9 x 3 = 702 mẫu

Vật liệu:

Chỗi cây Trầu bà cánh phượng vô trùng có chiều cao 0,7 cm có 4 lá (Hình 2.1)

Phương pháp lấy mẫu và chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi 10 mẫu/ 5 chai/ 1 6 cơ sở, các chỉ tiêu được theo dõi 7 ngay/ lần, theodõi trong 6 tuần

Số chồi (chồi): đếm tất cả số chồi trên cùng 1 gốc

Số lá/ chồi (1á): đếm tat cả số lá trên cụm chdi

Chiều cao chồi (cm): dùng thước đo từ bề mặt thạch đến đỉnh chi

Khối lượng chồi (g): cân khối lượng chi ở thời điểm 42 NSC

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây trầu bàcánh phượng in vitro

Môi trường nền: Lay môi trường tối ưu nhất ở thí nghiệm 1

Quy mô thí nghiệm:

+ Số mau/chai: 2 mẫu / chai

+ Số chai: 13 chai / 1 ô cơ sở

+ Tổng số mẫu cho TN: 2 x 13 x 6 x 3 = 468 mẫu

Phương pháp lấy mẫu và chỉ tiêu theo dõi:

- Theo dõi 10 mẫu / 5 chai, các chỉ tiêu được theo dõi 7 ngay/ lần, theo dõi trong 6tuần

- _ Số rễ (rễ): đếm tất cả số rễ trên thân chính

- _ Chiều đài rễ (cm): dùng thước đo chiều dai rễ dai nhất của cây ở thời điểm 42

NSC.

- _ Khối lượng rễ (g): cân khối lượng rễ ở thời điểm 42 NSC.

- _ Chiều cao cây (cm): dùng thước do từ bề mặt thạch đến đỉnh cây ở thời điểm 42

NSC.

Số lá (1a): đếm tat cả số lá trên thân chính của cây ở thời điểm 42 NSC

(*) Rễ phát triển từ phần cấy vào môi trường mà mắt thường có thé thấy được quamặt chai cấy

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được tông hợp và tính trung bình bang phần mềm Microsoft Excel và

phân tích bảng ANOVA và trắc nghiệm phân hạng (nếu có) ở mức ý nghĩa a = 0,05trắc nghiệm phân hạng bằng chương trình R 4.1.3

Chương 3KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của môi trường và liều lượng nước dừa đến khả năng tạo chồi của

cây trầu bà cánh phượng in vitro

Môi trường nuôi cấy in vitro là một trong những yếu tố quan trọng anh hưởngđến sự sinh trưởng và phát triển hình thái tế bào mô thực vật, việc lựa chọn môi trường

thích hợp cho từng loại cây là khâu quyết định sự thành công của nuôi cấy tế bào Môi

trường nuôi cấy thích hợp góp phần cho cây sinh trưởng tốt đáp ứng cho nhu cầu côngtác nhân giống in vitro Trong đó, môi trường MS và B5 đều được sử dụng nhiều trongnuôi cấy vì hàm lượng chất dinh đưỡng cao, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của cây Tuy

nhiên, tùy vào từng giai đoạn của cây mà cung cấp đủ chất dinh dưỡng cần thiết để cây

phát triển tốt, bên cạnh đó không những có thê tiết kiệm được chỉ phí sử dụng hóa chất

mà còn mang lại hiệu quả kinh tế, do đó môi trường MS và BS được dùng để khảo sát

trên cây trầu bà cánh phượng

Đồng thời, nước dừa đã được xác định là rất giàu hợp chất hữu cơ, các khoángchất và chất kích thích sinh trưởng (George, 1996) Nước dừa được sử dụng để kíchthích phân hóa và nhân nhanh chôi ở nhiều loại cây Quá trình nhân nhanh cây trau bàcánh phượng cần môi trường thích hợp với liều lượng nước dừa hợp lý dé tạo chồi, cây

sinh trưởng tốt

Bảng 3.1 Anh hưởng của hai loại môi trường và các liêu lượng nước dừa đên sô chôi(chéi) của cây trầu bà cánh phượng

NSC Liều lượng ND Môi trường TB

Ghi chu: Trong cùng một nhóm giá tri trung bình, các số có cùng: ký tự đi kèm thể hiện sự khác

biệt không có ÿ nghĩa thong kê "*: không có khác biệt thong kê; `: khác biệt có ý nghĩa về mặt

thong kê (P<0,05); `: khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thong kê (P<0, 01).

Qua bảng phân tích thống kê ở bảng 3.1 cho thấy:

Ở thời điểm 7 NSC kết quả cho thấy chồi trầu bà cánh phượng được nuôi cấy

trong hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đều cho số chồi không có ý nghĩatrong thống kê Sự tương tác giữa các loại môi trường và các mức liều lượng nước dừa

ở các nghiệm thức cho số chéi khác nhau nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê

Khi ở thời điểm 14 NSC chồi trau bà cánh phượng được nuôi cấy trong hai loại

yếu tô môi trường cho số chéi trung bình 1,15 — 1,18 chồi không có ý nghĩa trong thống

kê Tuy nhiên lại có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức liều lượng nước dừa 150 mL/L cho

số chồi trung bình cao nhất đạt 1,22 chồi so với các mức liều lượng nước dừa còn lại

Sự tương tác giữa các loại môi trường và các mức liều lượng nước dừa ở các nghiệm

thức cho số chéi khác nhau nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê

Đến thời điểm 21 NSC kết quả hình thành chi tại hai môi trường có sự khác

biệt có ý nghĩa trong thống kê Trong đó, số chéi trầu bà cánh phượng khác biệt có ý

nghĩa ở yếu tô môi trường, rất có ý nghĩa ở yếu tố nước đừa Trong đó so với môi trườngB5 thì môi trường MS cho ra kết quả số chồi trung bình cao hơn dat 1,43 chồi Tiếp tục

chéi được cấy ở mức liều lượng nước dừa 150 mL/L vẫn cho số chồi trung bình cao nhấtđạt 1,52 chồi, có sự khác biệt so với bố sung 50mL/I nước dừa và bồ sung 100 mL/L

nước dừa và có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với không bé sung nước dừa Bên cạnh đó

sự tương tác giữa các loại môi trường và các mức liều lượng nước dừa ở các nghiệmthức cho số chồi khác nhau nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê Trong đó chỗồi

được nuôi cấy ở nghiệm thức môi trường MS và được bổ sung thêm 150 mL/L có sốchồi cao nhất ở đạt 1,57 chồi và số chồi đạt thấp nhất ở nghiệm thức môi trường B5 và

không được bồ sung thêm nước dừa (1,30 chi)

Thời điểm 28 NSC chéi trầu bà cánh phượng có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở

cả hai yêu tố môi trường và nước đừa Trong đó so với môi trường B5 thì môi trường

MS vẫn cho ra kết quả số chéi trung bình cao hơn đạt 1,74 chồi Chồi được cay ở mứcliều lượng nước dừa 150 mL/L cho số chéi trung bình cao nhất đạt 1,8 chồi, có sự khác

biệt có ý nghĩa so với bô sung 100 mL/L, 50 mL/I và không bổ sung nước dừa Bên cạnh

đó sự tương tác giữa các loại môi trường và các mức liều lượng nước đừa ở các nghiệmthức cho số chồi khác nhau nhưng lại không có ý nghĩa trong thống kê Trong đó chồi

được nuôi cay ở nghiệm thức môi trường MS và được bồ sung thêm 150 mL/L có sốchồi cao nhất ở đạt 1,97 chdi và số chồi đạt thấp nhất ở nghiệm thức môi trường B5 và

không được bồ sung thêm nước dừa (1,60 chdi)

Số chồi trầu bà cánh phượng khi cấy vào các loại môi trường và các liều lượng

nước dừa khác nhau thì khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở thời điểm 35 NSC.Trong đó, môi trường MS cho kết quả về số chdi là 2,3 chồi khác biệt rat có ý nghĩa sovới môi trường B5 (2,1 chdi) Khi bổ sung 150 mL/L nước dừa cho kết quả tốt nhất về

số chồi là 2,4 chỗồi, có sự khác biệt có ý nghĩa so với liều lượng 50 và 100 mL/L và có

sự khác biệt rất có ý nghĩa khi không bé sung nước dừa Sự tương tác giữa môi trường

và nước dia không có ý nghĩa trong thong kê

Ở thời điểm 42 NSC, chồi trầu bà cánh phượng khi cấy vào các môi trường

khác nhau thì cho kết quả khác nhau về số chdi và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở

cả hai yếu tố môi trường và nước dừa Trong đó ở môi trường MS cho số chồi cao nhất

là 2,7 chồi khác biệt rất có ý nghĩa khi cấy vào môi trường B5 (2,5 chồi).Khi bé sung

150 mL/L nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi là 2,8 chồi, có sự khác biệt so với

các liều lượng còn lại Sự tương tác giữa môi trường và nước diva không có ý nghĩa trong

thống kê Trong đó số chéi đạt nhiều nhất ở nghiệm thức được cấy trong môi trường MS

và được bồ sung 150 mL/L nước dừa đạt 2,9 chỗồi và thấp nhất ở nghiệm thức được cấy

trong môi trường BS và không bé sung nước dừa 2,4 chi

Tóm lại từ phân tích thống kê cho ta thấy chồi trầu bà cánh phượng được nuôi

cấy trong môi trường MS được b6 sung 150 mL/L nước dita tại thời điểm 42 NSC cho

số chổi trung bình đạt nhiều nhất là 2,9 chi

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của hai loại môi trường và các liều lượng nước dừa đến số lá (lá)của cây trầu bà cánh phượng

NSC Liêu lượng ND Môi trường TB

Chỉ chú: Trong cùng mot nhóm gid trị trung bình, các số có cùng ký tự đi kèm thể hiện sự khác

biệt không có ý nghĩa thong kê "°: không có khác biệt thong kê; `: khác biệt có ỷ nghĩa về mặt

thong kê (P<0,05); `”: khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thong kê (P<0,01).