NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật Mã số: 62.42.01.12 Người hướng dẫn khoa học: Chức danh, tên GV1: TS NGUYỄN HỮU HỔ Chức danh, tên GV2: PGS.TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG Hà Nội – 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tác giả luận án Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn: - Các thầy giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Hổ PGS.TSKH Ngơ Kế Sương ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu - Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi quan tâm sâu sắc công việc thực nghiên cứu - Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp Bạn bè hỗ trợ công tác chuyên môn, ủng hộ tinh thần cho ý kiến xác đáng trình thực nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ba, Mẹ Gia đình ln hỗ trợ vật chất tinh thần Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch iii TĨM TẮT Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) dược liệu quan trọng, rễ chứa thành phần Plumbagin, naphthoquinone có nhiều đặc tính dược liệu quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm kháng côn trùng Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ Bạch hoa xà, sở: chọn quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu chuyển gen tác động đồng thời thời gian ủ hàm lượng acetosyringone; xác định tác động đồng thời số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng elicitor) lên khả sinh trưởng, tích lũy Plumbagin rễ tơ đánh giá biểu tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin Kết nghiên cứu xác định quan chọn để chuyển gen tạo rễ tơ Bạch hoa xà, có tác động đồng thời thời gian ủ hàm lượng acetosyringone lên hiệu chuyển gen theo Acetosyringone 134,09 µM 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao (0,025%) Khả phát triển rễ tơ Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: môi trường MS, rễ nuôi điều kiện tối môi trường dạng lỏng điều kiện tối ưu cho phát triển sinh khối rễ tơ Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá tác động đồng thời nhiều yếu tố (dinh dưỡng elicitor) lên khả sinh trưởng tích lũy Plumbagin, qua chọn lọc xác định điều kiện mơi trường ni cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L peptone 500 g/L thu kết tối ưu với trọng iii lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khơ: 0,46 g hàm lượng Plumbagin: 13,135 mg Ngồi ra, hoạt tính Plumbagin kiểm chứng qua việc cảm ứng biểu đặc điểm hình thái thay đổi cân biểu số gene liên quan tới trình chết tế bào HepG2, thơng qua mật độ trung bình tế bào HepG2 giảm, phân mảnh nhân biểu gene (bax bcl-2) liên quan đến trình apoptosis iv ABSTRACT Plumbago zeylanica L is an important pharmaceutical plant Its roots contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects This research aims to produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L hairy roots on the selection of suitable plant segment for transgene The study also identifies the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47 days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134.09 µM acetosynringone P Zeylanica L hairy roots showed to be grow best in liquid MS media and in dark condition Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water, 100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone With the listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.135 mg Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells It also affects some apoptotic genes of HepG2 cells The results showed that there were iv a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression of apoptotic bax and bcl-2 genes v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cây Bạch hoa xà 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng dịch trích ly từ rễ BHX 1.2 Plumbagin 1.2.1 Cấu trúc đặc tính hóa học v 1.2.2 Sinh tổng hợp Plumbagin thực vật 1.2.3 Hoạt tính Plumbagin 1.2.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 1.2.3.2 Hoạt tính kháng viêm 1.2.3.3 Hoạt tính kháng ung thư 10 1.2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn 12 1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm 13 1.2.4 Độc tính plumbagin 13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật 16 1.3 Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật 20 1.3.1 Hợp chất thứ cấp từ thực vật 20 1.3.2 Con đường chuyển hóa hợp chất thứ cấp 21 1.3.3 Dược tính hợp chất thứ cấp từ thực vật 24 1.4 Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp 25 1.4.1 Sự hình thành rễ tơ thực vật 27 1.4.2 Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes 28 1.4.2.1 Ri-plasmid vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 28 1.4.2.2 Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật 29 1.4.2.3 Sự biểu gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mô thực vật 32 1.4.2.4 Tạo rễ tơ thực vật Agrobacterium rhizogenes 39 1.5 Nuôi cấy rễ tơ thực vật 40 1.5.1 Ảnh hưởng dòng rễ tơ 41 v 1.5.2 Nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy 41 1.5.3 Ảnh hưởng elicitor 43 1.5.4 Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận hoạt chất thứ cấp 44 CHƯƠNG 48 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48 2.1 Vật liệu 48 2.1.1 Nguyên vật liệu 48 2.1.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 49 2.2 Phương pháp thực nghiệm 49 2.2.1 Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen 49 2.2.1.1 Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu 49 2.2.1.2 Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 50 2.2.1.3 Phát triển hoàn chỉnh từ chồi in vitro 52 2.2.1.4 Khảo sát khả tạo rễ bất định từ đoạn thân Bạch hoa xà in vitro 52 2.2.2 Ảnh hưởng số yếu tố đến hình thành rễ tơ 54 2.2.2.1 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ 54 2.2.2.2 Kiểm tra diện gen rol T-DNA vi khuẩn hợp vào gen tế bào rễ tơ phương pháp PCR 56 2.2.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy hoạt chất plumbagin ni rễ tơ Bạch hoa xà 58 2.2.3.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường 58 v 2.2.3.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả sinh trưởng rễ tơ 59 2.2.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng rễ tơ 59 2.2.3.4 Ảnh hưởng khối lượng ban đầu 60 2.2.3.5 Xác định đường cong tăng trưởng 60 2.2.3.6 Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ 61 2.2.4 Định tính định lượng hoạt chất Plumbagin rễ tơ 62 2.2.4.1 Ly trích chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC 62 2.2.4.2 Định tính Plumbagin sắc ký lớp mỏng (TLC) 63 2.2.4.3 Định lượng Plumbagin HPLC 63 2.2.5 Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin 64 2.2.6 Xử lý số liệu 67 CHƯƠNG 68 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro 68 3.1.1 Xác định điều kiện khử trùng mẫu 68 3.1.2 Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 70 3.1.3 Phát triển hoàn chỉnh từ chồi in vitro 73 3.1.4 Khảo sát khả tạo rễ bất định đoạn thân Bạch hoa xà in vitro 75 3.2 Chuyển gen tạo rễ tơ Bạch hoa xà 79 3.2.1 Ảnh hưởng số yếu tố đến hình thành rễ tơ 79 v 3.2.2 Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy rễ tơ 85 3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tổng hợp Plumbagin 87 3.3.1 Trạng thái môi trường 87 3.3.2 Điều kiện chiếu sáng 88 3.3.3 Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng rễ tơ 89 3.3.4 Ảnh hưởng lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy 91 3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng 92 3.3.6 Ảnh hưởng số yếu tố sinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy 94 3.4 Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin 101 CHƯƠNG 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107 4.1 Kết luận 107 4.2 Đề nghị 108 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 109 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3MeDAB Aminoazobenzene 3-methyl-4-dimethyl BHX Bạch hoa xà AQ Anthraquinone BRCA Breast cancer CADs Caffeic acid CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Con A Concanavalin A ER Estrogen receptor GHS Glutathione HaCaT Human keratinocyte line HEK Human Embryonic Kidney IL Interleukin MeJA Methyl jasmonate MMPs Matrix metalloproteinases NPAAs Non-protein amino acids vi NSCLC Non-small cell lung cancer OCD Ornithine cyclodeaminase ROS Reactive oxygen species SM Secondary metabolism TLK Trọng lượng khô NT Nghiệm thức TLT Trọng lượng tươi TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate NF-kB Nuclear factor-kappaB NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PARP Poly polymerase ADP-ribose MMP-2 Matrix metalloproteinase-2 ABCG2 ATP-binding cassette sub-family G member SA Salicylic acid Trp Tryptophan McC McCown-Lloyd MS Murashige and Skoog vi B5 Gamborg's B-5 BA 6-benzyladenine NAA Naphthalene Acetic Acid IAA Indole-3-acetic acid GA3 Gibberellin A3 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA Indole-3-butyric acid GSH Glutathione GSL Glucosinolate SIR Sulfur induced resistance vii DANH MỤC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 Một số kết ghi nhận nghiên cứu in vitro thu nhận 16, 17, Plumbagin 18, 19 2.1 Điều kiện khử trùng đoạn thân Bạch hoa xà để tạo mẫu in 49 vitro 2.2 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm 51 tạo chồi từ chồi bên in vitro Bạch hoa xà 2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 53 thực vật đến khả hình thành phát triển rễ bất định mẫu in vitro 2.4 Ảnh hưởng thời gian ủ hàm lượng acetosyringone lên 55 tỉ lệ chuyển gen 2.5 Các cặp mồi dùng phản ứng PCR 58 2.6 Một số loại môi trường ni cấy thí nghiệm 60 2.7 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng số yếu tố lên sinh 62 trưởng rễ tơ 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước Javel thời 69 gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân Bạch hoa xà 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả tạo chồi từ chồi bên in vitro 71 vii Bạch hoa xà 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng IBA lên phát triển 75 Bạch hoa xà từ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo rễ 76, 77 bất định từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi 83 tỉ lệ mẫu chuyển gen 3.6 Dữ liệu dự đoán tỉ lệ chuyển gen theo thuật tốn 84 3.7 Ảnh hưởng trạng thái mơi trường nuôi đến khả sinh 87 trưởng rễ tơ Bạch hoa xà 3.8 Ảnh hưởng chiếu sáng đến khả sinh trưởng rễ tơ 89 Bạch hoa xà 3.9 Ảnh hưởng loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX 90 nuôi cấy 3.10 Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng rễ 92 tơ BHX nuôi cấy 3.11 Sự thay đổi trọng lượng rễ hàm lượng Plumbagin theo thời 94 gian 3.12 Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên 95 sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy 3.13 Mức tác động số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy 96 vii 3.14 Ảnh hưởng yếu tố lên sinh trưởng rễ tơ BHX ni 97 cấy 3.15 Phân tích phương sai phương trình hồi quy theo mơ hình 100 D-Optimal 3.16 Tế bào HepG2 sau ngày cảm ứng Plumbagin nồng độ 102 khác 3.17 Tỉ lệ đứt gãy DNA đuôi tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet 104 viii DANH MỤC HÌNH TÊN HÌNH ẢNH SỐ TRANG 1.1 Cây Bạch hoa xà 1.2 Cấu trúc phân tử Plumbagin 1.3 Con đường sinh tổng hợp Plumbagin thực vật 1.4 Sơ đồ tóm tắt hoạt động Plumbagin 16 1.5 Sinh tổng hợp trao đổi chất thứ cấp bào quan 23 1.6 Cấu trúc Ri-plasmid A rhizogenes 29 1.7 Sự tương tác A.rhizogenes chế chuyển T-DNA 32 1.8 Sơ đồ nuôi cấy rễ tơ vi khuẩn Agrobacterium 40 rhizogenes 3.1 Mẫu Bạch hoa xà sau tuần nuôi cấy in vitro 68 3.2 Mẫu đối chứng sau tuần nuôi cấy 72 3.3 MS + 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA sau tuần nuối cấy 72 3.4 Các nghiệm thức E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6 sau tuần nuôi 74 cấy 3.5 Rễ bất định từ (a) đoạn thân (b) 76 3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi chung với vi khuẩn 79