Luận án nghiên cứu tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (plumbago zeylanica l ) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tác giả luận án Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn: - Các thầy giáo hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Hổ PGS.TSKH Ngô Kế Sương ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu - Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi quan tâm sâu sắc công việc thực nghiên cứu - Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp Bạn bè hỗ trợ công tác chuyên môn, ủng hộ tinh thần cho ý kiến xác đáng trình thực nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ba, Mẹ Gia đình hỗ trợ vật chất tinh thần Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch iii TĨM TẮT Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) dược liệu quan trọng, rễ chứa thành phần Plumbagin, naphthoquinone có nhiều đặc tính dược liệu quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm kháng côn trùng Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ Bạch hoa xà, sở: chọn quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu chuyển gen tác động đồng thời thời gian ủ hàm lượng acetosyringone; xác định tác động đồng thời số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng elicitor) lên khả sinh trưởng, tích lũy Plumbagin rễ tơ đánh giá biểu tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin Kết nghiên cứu xác định quan chọn để chuyển gen tạo rễ tơ Bạch hoa xà, có tác động đồng thời thời gian ủ hàm lượng acetosyringone lên hiệu chuyển gen theo Acetosyringone 134,09 µM 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao (0,025%) Khả phát triển rễ tơ Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: mơi trường MS, rễ nuôi điều kiện tối môi trường dạng lỏng điều kiện tối ưu cho phát triển sinh khối rễ tơ Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá tác động đồng thời nhiều yếu tố (dinh dưỡng elicitor) lên khả sinh trưởng tích lũy Plumbagin, qua chọn lọc xác định điều kiện môi trường ni cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L peptone 500 g/L thu kết tối ưu với trọng iii lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g hàm lượng Plumbagin: 13,135 mg Ngồi ra, hoạt tính Plumbagin kiểm chứng qua việc cảm ứng biểu đặc điểm hình thái thay đổi cân biểu số gene liên quan tới trình chết tế bào HepG2, thơng qua mật độ trung bình tế bào HepG2 giảm, phân mảnh nhân biểu gene (bax bcl-2) liên quan đến trình apoptosis iv ABSTRACT Plumbago zeylanica L is an important pharmaceutical plant Its roots contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects This research aims to produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L hairy roots on the selection of suitable plant segment for transgene The study also identifies the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47 days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134.09 µM acetosynringone P Zeylanica L hairy roots showed to be grow best in liquid MS media and in dark condition Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water, 100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone With the listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.135 mg Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells It also affects some apoptotic genes of HepG2 cells The results showed that there were iv a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression of apoptotic bax and bcl-2 genes v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cây Bạch hoa xà 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Cơng dụng dịch trích ly từ rễ BHX 1.2 Plumbagin 1.2.1 Cấu trúc đặc tính hóa học v 1.2.2 Sinh tổng hợp Plumbagin thực vật 1.2.3 Hoạt tính Plumbagin 1.2.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 1.2.3.2 Hoạt tính kháng viêm 1.2.3.3 Hoạt tính kháng ung thư 10 1.2.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn 12 1.2.3.5 Hoạt tính kháng nấm 13 1.2.4 Độc tính plumbagin 13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật 16 1.3 Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật 20 1.3.1 Hợp chất thứ cấp từ thực vật 20 1.3.2 Con đường chuyển hóa hợp chất thứ cấp 21 1.3.3 Dược tính hợp chất thứ cấp từ thực vật 24 1.4 Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp 25 1.4.1 Sự hình thành rễ tơ thực vật 27 1.4.2 Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes 28 1.4.2.1 Ri-plasmid vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 28 1.4.2.2 Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật 29 1.4.2.3 Sự biểu gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mô thực vật 32 1.4.2.4 Tạo rễ tơ thực vật Agrobacterium rhizogenes 39 1.5 Nuôi cấy rễ tơ thực vật 40 1.5.1 Ảnh hưởng dòng rễ tơ 41 v 1.5.2 Nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy 41 1.5.3 Ảnh hưởng elicitor 43 1.5.4 Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận hoạt chất thứ cấp 44 CHƯƠNG 48 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48 2.1 Vật liệu 48 2.1.1 Nguyên vật liệu 48 2.1.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 49 2.2 Phương pháp thực nghiệm 49 2.2.1 Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen 49 2.2.1.1 Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu 49 2.2.1.2 Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 50 2.2.1.3 Phát triển hoàn chỉnh từ chồi in vitro 52 2.2.1.4 Khảo sát khả tạo rễ bất định từ đoạn thân Bạch hoa xà in vitro 52 2.2.2 Ảnh hưởng số yếu tố đến hình thành rễ tơ 54 2.2.2.1 Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ 54 2.2.2.2 Kiểm tra diện gen rol T-DNA vi khuẩn hợp vào gen tế bào rễ tơ phương pháp PCR 56 2.2.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy hoạt chất plumbagin ni rễ tơ Bạch hoa xà 58 2.2.3.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường 58 v 2.2.3.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả sinh trưởng rễ tơ 59 2.2.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng rễ tơ 59 2.2.3.4 Ảnh hưởng khối lượng ban đầu 60 2.2.3.5 Xác định đường cong tăng trưởng 60 2.2.3.6 Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ 61 2.2.4 Định tính định lượng hoạt chất Plumbagin rễ tơ 62 2.2.4.1 Ly trích chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC 62 2.2.4.2 Định tính Plumbagin sắc ký lớp mỏng (TLC) 63 2.2.4.3 Định lượng Plumbagin HPLC 63 2.2.5 Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin 64 2.2.6 Xử lý số liệu 67 CHƯƠNG 68 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro 68 3.1.1 Xác định điều kiện khử trùng mẫu 68 3.1.2 Khảo sát tìm mơi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ 70 3.1.3 Phát triển hoàn chỉnh từ chồi in vitro 73 3.1.4 Khảo sát khả tạo rễ bất định đoạn thân Bạch hoa xà in vitro 75 3.2 Chuyển gen tạo rễ tơ Bạch hoa xà 79 3.2.1 Ảnh hưởng số yếu tố đến hình thành rễ tơ 79 * 10 0.29 0.31 -0.018 0.403-0.902-0.895 -0.735 0.046 11 0.34 0.35 -0.011 0.669-0.733-0.719 -1.022 0.090 12 0.45 0.43 0.019 0.3380.8780.870 0.621 0.033 13 0.34 0.39 -0.048 0.413-2.389-3.064 * -2.57 0.334 14 14 0.38 0.37 0.013 0.2850.5960.580 0.367 0.012 11 15 0.28 0.27 0.012 0.4330.5780.563 0.491 0.021 24 16 0.47 0.47-4.956E-003 0.783-0.403-0.389 -0.739 0.049 17 0.39 0.35 0.030 0.3031.3771.431 0.944 0.069 18 0.36 0.38 -0.019 0.391-0.934-0.929 -0.744 0.047 19 0.40 0.40-7.291E-003 0.726-0.527-0.512 -0.834 0.061 22 20 0.38 0.38-9.912E-004 0.454-0.051-0.049 -0.045 0.000 17 21 0.43 0.43-2.114E-003 0.338-0.098-0.094 -0.067 0.000 10 22 0.33 0.34-6.505E-003 0.371-0.310-0.299 -0.230 0.005 19 23 0.34 0.36 -0.022 0.405-1.094-1.103 -0.909 0.068 24 0.35 0.37 -0.015 0.285-0.672-0.657 -0.415 0.015 15 25 0.44 0.39 0.047 0.4132.3002.869 * 2.40 0.310 Exceeds limits + Hàm lượng plumbagin Response plumbagin Transform: None Mean F p-value Square Value Prob > F Sequential Model Sum of Squares [Type I] Sum of Source Squares df Mean vs Total3319.63 3319.63 Linear vs Mean396.45 99.11 1.54 0.2291 2FI vs Linear858.69 143.12 4.67 0.0083 Suggested Quadratic vs 2FI 181.95 45.49 1.84 0.1980 Cubic vs Quadratic 240.86 48.17 37.17 0.0006 6.48 1.30 5004.06 25 200.16 Residual Total "Sequential Model Sum of Squares [Type I]": Suggested Select the highest order polynomial where the additional terms are significant and the model is not aliased Lack of Fit Tests Sum of Mean F p-value Source Squares df Square Value Prob > F Linear 1281.50 15 85.43 65.92 0.0001 2FI 422.81 46.98 36.25 0.0005 Quadratic 240.86 48.17 37.17 0.0006 Cubic 0.000 Pure Error 6.48 "Lack of Fit Tests": Suggested Aliased 1.30 Want the selected model to have insignificant lack-of-fit Model Summary Statistics Std Adjusted Predicted Source Dev R-Squared R-Squared R-Squared PRESS Linear 8.02 0.2354 0.0824 -0.4185 2389.44 2FI 5.54 0.7451 0.5631 -0.8590 3131.39 Quadratic 4.97 0.8532 0.6476 -1.5751 4337.50 1.14 0.9962 0.9815 Cubic + Case(s) with leverage of 1.0000: "Model Summary Statistics": Focus on the model maximizing the "Adjusted R-Squared" Use your mouse to right click on individual cells for definitions Aliased PRESS statistic not defined and the "Predicted R-Squared" Response + Suggested plumbagin ANOVA for Response Surface Reduced Cubic Model Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III] Sum of Mean F p-value df Square Value Prob > F 1674.17 17 98.48 67.15 < 0.0001 A-nuoc dua 126.27 126.27 86.10 < 0.0001 B-chitosan 15.47 15.47 10.55 0.0141 C-SA190.61 190.61 129.96 < 0.0001 145.95 145.95 99.51 AB12.44 12.44 8.48 0.0226 AC229.48 229.48 156.46 < 0.0001 AD48.99 48.99 33.40 0.0007 BC49.26 49.26 33.59 0.0007 BD13.00 13.00 8.86 0.0206 CD38.10 38.10 25.98 0.0014 B223.97 23.97 16.34 0.0049 C210.30 10.30 7.02 0.0329 D260.96 60.96 41.56 0.0004 ABC24.84 24.84 16.93 0.0045 ACD47.68 47.68 32.51 0.0007 BCD51.29 51.29 34.97 0.0006 A2B5.85 5.85 3.99 0.0859 10.27 1.47 Lack of Fit 3.79 1.89 Pure Error 6.48 1.30 Cor Total 1684.43 24 Std Dev 1.21 Source Squares Model D-pepton Residual Mean11.52 R-Squared Adj R-Squared C.V % 10.51 PRESS 310.79 1.46 < 0.0001 0.3166 0.9939 0.9791 Pred R-Squared 0.8155 Adeq Precision 42.717 The "Pred R-Squared" of 0.8155 is in reasonable agreement with the "Adj R-Squared" of 0.9791 "Adeq Precision" measures the signal to noise ratio desirable A ratio greater than is Your ratio of 42.717 indicates an adequate signal the design space This model can be used to navigate Coefficient Factor Standard 95% CI 95% CI Estimate df Error Low High Intercept 7.03 0.79 5.32 8.75 A-nuoc dua 1.31 0.32 0.62 1.99 1.11 -0.75 0.33 -1.47 -0.033 1.14 AB-0.97 0.39 -1.81 -0.12 1.32 AD1.21 0.47 0.19 2.23 1.75 BC0.95 0.37 0.16 1.75 1.17 BD-1.41 0.38 -2.23 -0.59 1.22 CD-0.90 0.40 -1.77 -0.024 1.25 B22.22 0.88 0.33 4.12 1.79 C21.48 0.69 -0.018 2.98 1.23 ACD-2.00 0.60 -3.29 -0.71 2.24 -0.73 0.40 -1.60 0.14 C-SA A2 B Final Equation in Terms of Coded Factors: plumbagin = +7.03 +1.31 * A -0.75 * C -0.97 * A * B +1.21 * A * D +0.95 * B * C -1.41 * B * D -0.90 * C * D +2.22 * B2 +1.48 * C2 -2.00 * A * C * D -0.73 * A2*B VIF 1.36 Response plumbagin Transform: None Diagnostics Case Statistics InternallyExternallyInfluence on Standard * Actual Predicted Studentized StudentizedFitted ValueCook's Order Value Value Residual Leverage Residual Residual DFFITS Distance 10.59 10.60-9.797E-003 0.957-0.039-0.036 -0.172 0.002 20 10.59 10.73 -0.14 0.497-0.167-0.155 -0.154 0.002 21 10.57 11.21 -0.64 0.889-1.598-1.856 * -5.25 * 1.14 12 7.61 8.19 -0.58 0.479-0.659-0.630 -0.604 0.022 23 10.92 11.38 -0.46 0.897-1.196-1.241 * -3.67 0.693 18 10.55 10.549.399E-003 0.9980.1660.154 * 3.30 0.702 7 6.71 7.27 -0.56 0.908-1.529-1.735 * -5.46 * 1.29 16 7.97 7.42 0.55 0.8831.3261.418 * 3.90 0.740 25 14.70 14.69 0.017 0.9890.1360.126 1.218 0.096 13 10 9.35 9.42 -0.078 0.927-0.238-0.221 -0.791 0.040 11 12.46 12.07 0.39 0.8770.9170.905 * 2.41 0.332 12 10.35 10.65 -0.30 0.464-0.343-0.321 -0.298 0.006 13 13.68 11.91 1.77 0.4712.0122.870 * 2.71 0.200 14 14 9.92 10.38 -0.45 0.493-0.527-0.497 -0.491 0.015 11 15 8.33 7.81 0.52 0.6720.7510.725 1.037 0.064 24 16 10.03 10.86 -0.83 0.708-1.271-1.342 * -2.09 0.218 17 6.86 7.53 -0.67 0.866-1.500-1.686 * -4.28 0.805 18 6.78 6.65 0.13 0.9860.9200.908 * 7.75 * 3.42 19 9.19 8.83 0.35 0.8630.7850.761 1.913 0.216 22 20 8.66 8.08 0.58 0.7690.9930.992 1.809 0.182 17 21 11.59 10.65 0.94 0.4641.0551.065 0.991 0.054 10 22 10.67 10.73 -0.061 0.497-0.071-0.065 -0.065 0.000 19 23 8.27 8.19 0.080 0.4790.0920.085 0.081 0.000 24 11.14 10.38 0.77 0.4930.8920.877 0.865 0.043 15 25 10.60 11.91 -1.31 0.471-1.486-1.662 -1.568 0.109 Exceeds limits Run Order - Tối ưu hóa Constraints Name Goal Lower Upper Lower Upper Limit Limit Weight Weight Importance nuoc dua is in range 10 30 1 chitosan is in range 100 300 1 SA is in range 10 100 1 pepton is in range 100 500 1 4.96833 luong tuoi maximize 2.24267 1 luong kho maximize 0.279667 0.510333 1 14.7033 pepton luong tuoi plumbagin maximize 5.05527 Solutions Number nuocdua kho chitosan SA luong plumbagin Desirability 114.33 100.00 19.40 500.00 4.96838 0.454644 11.0107 0.777 Selected 214.17 100.00 19.73 500.00 5.02979 0.456746 10.914 0.775 314.20 100.00 14.53 500.00 4.96835 0.443537 11.382 0.775 414.30 106.05 10.00 500.00 4.98112 0.429588 11.4738 0.756 511.31 100.00 10.09 499.84 6.07102 0.45557 10.5237 0.756 614.55 110.94 10.00 500.00 4.9685 0.426858 11.2877 0.744 717.04 100.00 46.74 500.00 4.33765 0.485803 10.1144 0.711 829.58 300.00 43.85 100.01 4.96828 0.518957 8.50208 0.710 910.12 100.00 17.45 486.56 6.1658 0.456357 9.53605 0.709 1028.92 299.86 38.91 100.00 4.96831 0.515453 8.45698 0.706 1127.50 299.98 23.75 100.02 4.96832 0.502806 8.50789 0.702 1229.51 300.00 40.34 107.16 4.96832 0.514166 8.3781 0.701 1326.93 300.00 13.06 100.00 4.96922 0.490235 8.67769 0.700 1426.91 299.99 12.12 100.00 4.97349 0.489118 8.69264 0.700 1530.00 122.22 76.44 100.00 4.34857 0.475315 9.70261 0.681 1630.00 128.22 69.27 100.59 4.54834 0.480185 9.09705 0.675 1730.00 132.89 65.39 100.00 4.68813 0.482946 8.74981 0.671 1830.00 100.71 65.75 100.00 3.991 0.484303 9.97744 0.662 1930.00 180.12 74.09 100.00 4.96653 0.467661 8.37006 0.654 2030.00 210.82 72.87 100.00 4.96831 0.465062 8.2496 0.643 2123.74 300.00 10.00 100.00 3.91034 0.445263 9.86735 0.603 2216.31 177.84 10.00 499.99 4.90594 0.403374 9.06877 0.602 2330.00 178.98 89.74 500.00 4.45864 0.447108 8.21437 0.578 2430.00 184.80 99.82 500.00 4.61562 0.447107 7.76632 0.562 2510.00 279.61 65.73 100.00 3.53916 0.44175 9.47698 0.535 2610.04 264.56 47.02 100.00 3.61714 0.442436 9.19103 0.534 2730.00 223.05 63.48 500.00 3.9491 0.433015 8.3603 0.522 2810.00 300.00 73.60 500.00 3.772 0.463899 6.35718 0.393 28 Solutions found Number of Starting Points: nuoc duachitosan SA 30 pepton 10.838275.40017.443 199.320 13.114192.18031.906 483.880 22.934199.70050.140 447.880 29.510200.44097.075 180.920 26.090296.28036.100 491.920 13.198116.00083.071 106.560 11.458256.10087.661 498.040 29.594265.14060.382 110.440 23.248104.02057.709 341.440 10.290112.82013.204 242.200 18.142215.16057.619 301.360 28.816192.06025.480 271.880 17.280156.12041.320 206.200 28.782257.36073.081 460.160 10.694151.68075.646 229.040 24.628263.94052.291 378.680 14.278175.96036.901 132.720 14.806171.50044.587 180.440 19.220268.98083.818 165.480 27.492173.22097.561 320.160 13.970277.98016.516 406.000 18.772149.54062.119 124.200 18.696223.84041.995 158.480 23.374147.14026.056 411.480 12.216292.60065.629 198.840 17.836282.94083.719 163.120 11.484251.64029.062 269.040 16.246272.74071.947 443.520 23.512291.30034.309 222.840 18.416185.40082.378 369.760 Factor Name A nuoc dua 14.33 10.00 30.00 0.000 Actual B chitosan 100.00 100.00 300.00 0.000 Actual C SA 19.40 10.00 100.00 0.000 Actual D pepton 500.00 100.00 500.00 0.000 Actual 95% CI low 95% CI high SE Pred 95% PI low Response Level Low Level High Level Std Dev Coding Prediction SE Mean luong tuoi 4.96838 0.46 3.91 6.03 0.52 3.77 6.16 luong kho 0.45098 0.020 0.41 0.50 0.033 0.38 0.53 0.98 8.89 13.13 1.62 7.50 14.52 plumbagin 11.1352 95% PI Phụ lục 4: Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan plumbagin 4.1 Ảnh hưởng plumbagin lên mật độ tế bào HepG2 SAMPLE CONTROL CELL QUANTITY (CELLS/ml) x 104 2.5 57 55 22 135 113 57 58 23 137 118 60 59 25 Data source: Data in Notebook1 Equal Variance Test: Passed (P = 0.555) Group Name control 2.5 10 20 N 3 3 Source of Variation Between Groups Residual Total Missing 0 0 DF 10 14 Mean 137.667 115.333 58.000 57.333 23.333 SS 26306.667 50.667 26357.333 Std Dev 3.055 2.517 1.732 2.082 1.528 MS 6576.667 5.067 20 115 One Way Analysis of Variance Passed (P = 0.412) 10 141 Xử lý thống kê Sigmaplot 11.0 Normality Test: SEM 1.764 1.453 1.000 1.202 0.882 F 1298.026 P