Luận án nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra

i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học Công nghệ GS.TS Lê Huy Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, người thầy định hướng, truyền dạy kiến thức khoa học, động viên tạo điều kiện giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn trở ngại suốt trình thực luận án Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình làm luận án Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh, Viện Nông Nghiệp Tài Ngun tạo điều kiện giúp tơi hồn thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập nghiên cứu bốn năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân Trường Đại học Vinh hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tơi suốt q trình thực luận án Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, tạo điều kiện cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày…… tháng năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận án cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác - Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Hà Nội, ngày… tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Mỹ Dung iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GELATIN 1.1.1 Cấu trúc tính chất gelatin 1.1.2 Gelatin có nguồn gốc từ da cá 1.2 GELATINASE 11 1.2.1 Đặc điểm, chức gelatinase 11 1.2.2 Phân loại gelatinase 13 1.2.3 Cấu trúc chế hoạt động gelatinase 16 1.2.4 Tính chất chung gelatinase 19 1.2.5 Nguồn sản xuất gelatinase 25 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP 27 1.3.1 Gen mã hóa gelatinase 27 1.3.2 Sản xuất gelatinase tái tổ hợp 32 1.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu sản xuất gelatinase 41 1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá 42 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 50 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 50 2.2.1 Hóa chất 50 2.2.2 Thiết bị 51 2.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 52 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.4.1 Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase 52 2.4.2 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 55 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu rGEL 61 2.4.4 Phương pháp thu hồi, tinh đặc tính rGEL 63 iv 2.4.5 Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da tra 65 2.4.6 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 71 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 72 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao 72 3.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa định tên chủng vi khuẩn lựa chọn 74 3.2 TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP 79 3.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E faecalis MD4 79 3.2.2 Nhân dịng gen gelE mã hóa gelatinase 79 3.2.3 Giải trình tự phân tích gen gelE 81 3.2.4 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu gen gelE E coli BL21(DE3) 84 3.2.5 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE 86 3.3 ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL 87 3.3.1 Ảnh hưởng pH đến biểu rGEL 88 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu rGEL 89 3.3.3 Ảnh hưởng IPTG đến biểu rGEL 93 3.3.4 Động thái trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp 95 3.4 THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL 96 3.4.1 Thu hồi tinh rGEL 96 3.4.2 Đặc tính gelatinase tái tổ hợp 99 3.5 ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 106 3.5.1 Kết xác định điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra rGEL 106 3.5.2 Đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC 145 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ADG : Average daily growth ADN : Acid deoxyribonucleic AMP : Ampicillin ARN : Acid ribonucleic BLAST : Basis Local Aligment Search Tool bp : base pair BSA : Bovine Serum Albumin Dal : Dalton E : Enzym EC : Classification enzyme EDTA : Ethyllene diamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium Bromide FCR : Feed change rate IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside kDa : Kilo Dalton Kb : Kilo base LB : Lubria – Bertani MMP : Matrix metalloprotease MMP : Matrix metalloprotease MMPs : Matrix metalloproteases NST : Nhiễm sắc thể OD : Optical density (mật độ quang) PBS : Phosphate buffer PCR : Polymerase Chain Reactions rGelE : recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp) vi RE : Restriction enzyme (enzyme giới hạn) S : Cơ chất SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis SGR : Special growth rate sprE : serine proteinase TAE : Tris - acetate - EDTA TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí TTHĐ : Trung tâm hoạt động UV : Ultra violet VT TTH : vector tái tổ hợp VSV : vi sinh vật vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần axit amin gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) Bảng 1.2 Các thành phần axít amin chủ yếu gelatin da số loại cá bì lợn (thành phần 1000g) 10 Bảng 1.3 Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs 14 Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng thức ăn 68 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng công thức thức ăn thí nghiệm 69 Bảng 2.3 Thành phần axit amin loại thức ăn thí nghiệm 69 Bảng 3.1 Hoạt tính phân giải gelatin dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ mẫu cá nước bị bệnh sau 48 nuôi cấy 72 Bảng 3.2 Khả đồng hoá nguồn carbon nitơ đặc điểm sinh trưởng chủng MD4 sau ngày nuôi cấy 37°C 75 Bảng 3.3 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng chủng đăng ký Genbank (NCBI) 77 Bảng 3.4 Mức độ tương đồng trình tự nucleotit gen gelE chủng E faecalis MD4 với gen gelE tương ứng vi khuẩn đăng kí GenBank 81 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn gen gelE chủng E faecalis MD4 với gen gelE tương ứng vi khuẩn đăng kí GenBank 84 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng biểu GEL 93 Bảng 3.7 Hiệu suất tinh GEL tái tổ hợp 97 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính GEL tái tổ hợp 103 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân 106 Bảng 3.10 Thành phần axít amin sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra 110 viii Bảng 3.11 Diễn biến yếu tố mơi trường nước q trình ương cá Mú chấm đen 111 Bảng 3.12 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày cá Mú chấm đen theo khối lượng mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 113 Bảng 3.13 Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày cá Mú chấm đen theo chiều dài mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 114 Bảng 3.14 Hệ số chuyển đổi thức ăn cá Mú mức bổ sung chế phẩm axit amin khác 116 Bảng 3.15 Hệ số biến động cá Mú chấm đen giai đoạn giống 117 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc điển hình gelatinase A, B có nguồn gốc từ người 17 Hình 1.2 Cấu trúc enzym gelatinase 18 Hình 1.3 Sơ đồ trình tự axit amin dự đốn gelatinase 28 Hình 1.4 A) Hệ thống điều hòa biểu gen gelE operon 31 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein 61 Hình 2.2a Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) 67 Hình 2.2b Hệ thống giai ương thí nghiệm 67 Hình 2.3 Thức ăn cơng nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen 68 Hình 3.1 Khả thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng chủng MD4 73 Hình 3.2 Vòng phân giải chất gelatin chủng vi khuẩn 73 Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường MPA (a), tế bào MD4 kính hiển vi điện tử quét (b) nhuộm Gram (c) 75 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 76 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại dựa việc so sánh trình tự gen 16S rRNA chủng MD4 với trình tự gen tương ứng chủng khác GenBank 78 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA E faecalis MD4 80 Hình 3.7 Điện di đồ kiểm tra plasmid mang gen 80 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách dòng enzym giới hạn 80 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide gen gelE từ chủng E faecalis MD4 với trình tự gen gelE đăng ký GenBank 83 Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn gelE chủng E faecalis MD484 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm gen tinh từ vector tách dòng cắt mở vòng vector biểu pET-22b(+) 85 Hình 3.12 Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) plasmid tái tổ hợp xử lý HindIII SalI (b) 85 Hình 3.13 Điện di đồ protein tái tổ hợp SDS-PAGE 86 x Hình 3.14 Hình ảnh sàng lọc dịng E coli BL21(DE3)[pET22b(+)-gelE] mơi trường thạch hình ảnh kiểm tra hoạt tính GEL dịng đĩa thạch đục lỗ 87 Hình 3.15 Ảnh hưởng pH đến biểu gelE tái tổ hợp 88 Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu gelE tái tổ hợp 90 Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu 37oC (a) 34oC(b) gel SDSPAGE 91 Hình 3.18 Điện di đồ protein GEL tái tổ hợp biểu nồng độ IPTG khác gel SDS-PAGE 94 Hình 3.19 Động thái trình lên men sinh tổng hợp rGEL 95 Hình 3.20 Điện di đồ protein tái tổ hợp trước sau tinh GEL cột sắc ký lực 97 Hình 3.21 Quy trình thu nhận gelatinase tái tổ hợp từ chủng E coli BL21 (DE3) ) [pET 22(b+) –GelE]…………………………………………… …97 Hình 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính rGEL ………… 100 Hình 3.23 Độ bền nhiệt rGEL 100 Hình 3.24 Ảnh hưởng pH tới hoạt động xúc tác GEL 101 Hình 3.25 Ảnh hưởng pH đến độ bền GEL tái tổ hợp 102 Hình 3.26 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính rGEL 105 Hình 3.27 Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ gelatinase (a) đồ thị Lineaweaver -Burk gelatinase tái tổ hợp với chất gelatin (b) 106 Hình 3.28 Hiệu thủy phân gelatin nồng độ gelatinase khác 107 Hình 3.29 Hiệu suất thủy phân gelatin gelatinase mức nhiệt độ khác 108 Hình 3.30 Hiệu suất thủy phân gelatin gelatinase mức thời gian thủy phân 109 Hình 3.31 Tỷ lệ sống cá Mú chấm đen kết thúc thí nghiệm 113 137 [113] Paulina Ducka&Ulrich Eckhard&Esther Schönauer& Stefan Kofler&Gerhard Gottschalk&Hans Brandstetter&Dorota Nüss (2009), “A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E coli”, Appl Microbiol Biotechnol 83, pp.1055–1065 [114] Perez M., Calles-Enríquez M., del Rio B., Ladero V., Martín MC., Fernández M., Alvarez MA (2015), “IS256 abolishes gelatinase activity and biofilm formation in a mutant of the nosocomial pathogen Enterococcus faecalis V583”, Can J Microbiol 61(7), pp.517-519 [115] Podbielski A & Kreikemeyer B., (2004), “Cell density dependent regulation: basic principles and effects on the virulence of Grampositive cocci” Int J Infect Dis, (2), pp.81-95 [116] Poppe J (1997), Gelatin, in A Imeson (ed.) Thickening and Gelling Agents for Food (2nd ed.), pp.144-168 [117] Potter, N N and Hotchkiss, J H (1998), Food Science 5th Edition Aspen Publishers Inc, Gaithersburg, Maryland pp.359- 379 [118] Pourmotabbed T, Solomon TL, Hasty KA, Mainardi CL (1994), “Characteristics of 92 kDa type IV collagenase/gelatinase produced by granulocytic leukemia cells: structure, expression of cDNA in E coli and enzymic properties”, Biochim Biophys Acta 1204(1), pp.97-107 [119] Qadar SAU, Shireen E., Iqbal S., Anwar A (2009), “Optimization of protease production from newly isolated strain of Bacillus sp PCSIR EA-3”, India Journal biotechnol; 8, pp.286- 290 [120] Qin X., Singh KV., Weinstock GM., Murray BE (2000), “Effects of Enterococcus faecalis fsr genes on production of gelatinase and a serine protease and virulence”, Infect Immun 68(5): pp.2579-2586 [121] Rachmansyah A., Laining and Mangawe A.G (2000), Pengaruh rasio protein lemak yang berbeda terhadap pertumbuhan ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis) /n: Suparno, J Widodo, A Sudradjat, 138 A Poernomo, E.S Heruwati, K Sumantadinata (Eds.) Prosiding Seminar Hasit penelitian perikanan 1999/2000, 21-22 Sep 2000, Jakarta, Indonesia pp:221-225 [122] Rawlings Neil D., Salvesen Guy (2013), “Handbook of proteolytic Enzymes” 3rd Edition Elsevier Ltd ISBN: 978-0-12- 382219-2 Chapter 117 pp: 575-577 [123] Rbii K, Surel O, Brambati N, Buchert AM, Violleau F (2011), “Study of gelatin renaturation in aqueous solution by AFlFFFMALS: Influence of a thermal pre-treatment applied on gelatin”, Food Hydrocol 25, pp.511-514 [124] Rimmer M.A., McBride S (eds 2004), Advances in grouper aquaculture, Australian center for international Agriculture Research, Canberra, pp.1-135 [125] Roques B.P., (1993), Zinc metallopeptidases: active site structure and design of selective and mixed inhibitors: new approaches in the search for analgesics and anti-hypertensives, Biochemical Society transactions, 21 ( Pt 3) 678-685 [126] Rosen, H., (1957), Arch of Biochem Biophys 67: 10 [127] Sai-Ut S, Benjakul S, Sumpavapol P.(2013), “Gelatinolytic enzymes from Bacillus amyloliquefaciens isolated from fish docks characteristics and hydrolytic activity”, Food Science Biotechnol 22(4), pp.1015–1021 [128] Sambrook J and Russell D (2001), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring laboratory Press, New York [129] Sarabia A I., Go´mez-Guille´n M C., & Montero P (2000), “The effect of added salts on the viscoelastic properties of fish skin gelatin”, Food Chemistry, 70, pp.71–76 139 [130] Saxena Rajshree, Singh Rajni (2011), “Characterization of a metalloprotease produced in solid state fermentation by a newly isolated Bacillus strain”, Acta Biologica Szegediensis 55(1), pp.13-18 [131] Sanaei Ardekani V., Mahmoodani F., See S.F., Yusop S.M., & Babji A.S., (2013), “Processing Optimization and Characterization of Gelatin from Catfish (Clarias gariepinus) Skin”, Sains Malaysiana 42(12): pp.1697–1705 [132] Sayed EEM., Saad MM., Awad HM., Selim MH and Hassan HM (2012), “Optimization conditions of extracellular proteases production from a newly isolated Streptomyces pseudogrisiolus NRC-15”, EJournal of Chemistry; 9(2), pp.949-961 [133] Schellman J.A (1997), Temperature, stability, and the hydrophobic interaction Biophys J 73: 2960-2964 [134] Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R (2007), “Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth”, Journal Bacteriol 189(23), pp 8746-8749 [135] Shaheen M., Shah AA., Hameed A., Hasan F (2008), “Influence of culture conditions on production and activity of protease from Bacillus subtilis BS1”, Pak.J.Bot; 40(5): pp.2161- 2169 [136] Shahidi F (1994), Proteins from seafood processing discards In Z.E Sikorski, B S Pan, & F Shahidi (Eds.) Seafoods proteins NewYork, NY: Chapman and Hall, pp.171-193 [137] Shanmugasundaram Senthil Balan, Rajendiran Nethaji, Sudalayandi Sankar, Singaram Jayalakshmi (2012), “Production of gelatinase enzyme from Bacillus spp isolated from the sediment sample of Porto Novo Coastal sites”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S1811-S1816 [138] Sharma A., Dour, P & Gupta P (2006), “Screening of Enterobacterial Contamination During Gelatin Production and its 140 Effect on Pharmaceutical Grade Gelatin”, World J Microbiol Biotechnol 22, pp.1049-1054 [139] Shin CS, Hong MS, Bae CS, Lee J (1997), Enhanced production of human mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3)[pET-3aT2M2] Biotechnol Prog 13:249–257 doi: 10.1021/bp970018m [140] Shiau S.-Y., Lan, C.-W (1996), « Optimum dietary protein level and protein to energy ratio for growth of grouper (Epinephelus malabaricus)”, Aquaculture 145, pp.259–266 [141] Shojaosadati SA, Kolaei SMV, Babaeipour1 V, Farnoud AM (2008), Recent advances in high cell density cultivation for production of recombinant protein Iranian J Biotechnol 6(2): 63-77 [142] Small B.C., & Soares J.H Jr.(2000), “Quantitative dietary lysine requirement of Juvenline striped bass Morone saxatilis”, Aquaculture Nutrition pp.207-212 [143] Stack MS, Gray RD (1990), “The effect of pH, temperature, and D2O on the activity of porcine synovial collagenase and gelatinase” Arch Biochem Biophys 281(2), pp.257–263 [144] Stainsby, G (1987), Gelatin gels, in A.M Pearson, T.R Dutson, and A.J Bailey (eds.), Advances in Meat Research 4: pp.209-222 [145] Steck Natalie, Hoffmann, Irina G.Sava, Sandra C.Kim; HannesHahne; Susan L.Tonkonogy, KatrinMair; DagmarKrueger; MihaelaPruteanu, FergusShanahan; BernhardKuster; RogerVogelmann; BalforSartor faecalis Metalloprotease R Compromises MichaelSchemann; (2011), Epithelial Enterococcus Barrier and Contributes to Intestinal Inflammation Gastroenterology Volume 141, Issue 3, pp.959-971 [146] Steffensen B, Wallon UM, Overall CM (1995), “Extracellular matrix binding properties of recombinant fibronectin type II-like modules of 141 human 72-kDa gelatinase/type IV collagenase High affinity binding to native type I collagen but not native type IV collagen”, Journal Biol Chem 12;270(19), pp.11555-11566 [147] Sternlicht MD, Werb Z., (2001), How matrix metalloproteinases regulate cell behavior Annu Rev Cell Dev Biol 17: pp:463-516 [148] Strandberg L, Enfors SO (1991), Factors influencing inclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli Appl Environ Microbiol 57:1669–1674 [149] Su Y A., Sulavik M C., He P., Makinen K K., Makinen P L., Fiedler S., Wirth R & Clewell, D B (1991), “Nucleotide sequence of the gelatinase gene (gelE) from Enterococcus faecalis subsp liquefaciens”, Infect Immun 59, pp.415–420 [150] Susanna Monaco, Valentina Sparano, Magda Gioia, Diego Sbardella, Donato Di Pierro, Stefano Marini,Massimo Coletta (2006) “Enzymatic processing of collagen IV by MMP-2 (gelatinase A) affects neutrophil migration and it is modulated by extracatalytic domains”, Protein Science 15(12), pp.2805–2815 [151] Teixeira Neuza, Sofia Yokohata, Vijayalakshmi Santos, Paulo S Iyer, Jiro Marujo, Ryoji Nakayama, Lynn E Hancock, Pascale Serror, and Maria de Fátima Silva Lopes., (2012), “ The incongruent gelatinase genotype and phenotype in Enterococcus faecalis are due to shutting off the ability to respond to the gelatinase biosynthesis-activating pheromone (GBAP) quorum-sensing signal”, Microbiology 158(Pt 2), pp.519–528 [152] Tong A., Reich A., Genin O., Pines M., Monsonego-Ornan E (2003), “Expression of chicken 75-kDa gelatinase B-like enzyme in perivascular chondrocytes suggests its role in vascularization of the growth plate”, Journal Bone Miner Res 18(8), pp.1443-1452 142 [153] Tran LH, Nagano H (2002), “Isolation and Characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its Collagenase Production”, Journal of Food Science 67(3), pp.1184- 1187 [154] Tuan L.A., Kevin C Williams (2007), “Optimum dietary protein and lipid specifications for juvenile malabar grouper (Epinephelus malabaricus)”, Aquaculture 267, pp.129–138 [155] Urban A, Ansmant I, Motorin Y (2003), Optimisation of expression and purification of from Saccharomyces the recombinant cerevisiae J Yol066 Chromatogr (Rib2) B protein Biomed Sci Appl 786(1–2):187–195 [156] Brammachary U and Paily K (2014), Gelatinase activity of metabolites of Pseudomonas fluorescens Migula on larvae and pupae of culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae), Int Journal Pharm Bio Sicence 2014 July 5(3): Pp, 234-245 [157] Van den Steen PE, Van Aelst I, Hvidberg V, Piccard H, Fiten P, Jacobsen C, Moestrup SK, Fry S, Royle L, Wormald MR, Wallis R, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G., (2006), “The hemopexin and O-glycosylated domains tune gelatinase B/MMP-9 bioavailability via inhibition and binding to cargo receptors”, Journal Biol Chem 7;281(27), pp.18626-18637 [158] Van den Steen PE., Proost P., Wuyts A., Van Damme J., Opdenakker G (2000), “Neutrophil gelatinase B potentiates interleukin-8 tenfold by aminoterminal processing, whereas it degrades CTAP-III, PF-4, and GRO-alpha and leaves RANTES and MCP-2 intact”, Blood 96, pp.2673–2681 [159] Van den Steen PE., Dubois B., Nelissen I., Rudd PM., Dwek RA, Opdenakker G (2002), Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) Crit Rev Biochem Mol Biol 37(6), pp.375-536 143 [160] Van den Steen P.E., Dubois B., Nelissen I., Rudd P.M., Dwek R and Opdenakker G (2013), "Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)"; Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 37(6): 375–386 [161] Vandooren J., Van den Steen P E., Opdenakker G (2013), Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade Crit Rev Biochem Mol Biol 48, pp.222–272 [162] Verma, R P and Hansch, C (2007), “Matrix metalloproteinases (MMPs): Chemical biological functions and (Q)SARs”, Bioorganic & Medicinal Chemistry 15(6), pp.2223-2268 [163] Veis, A (1964), The Macromolecular Chemistry of Gelatine Academic Press NY, p6-44 [164] Visse R, Nagase H (2003), Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry Circ Res 92(8):827-39 [165] Wachirattanapongmetee K, Thawornchinsombut S, Pitirit T, Yongsawatdigul J, Park JW (2009), “Functional properties of protein hydrolysates prepared from alkali-aided protein extraction of hybrid catfish frame”, Trends Research in Science and Technology 1: p71-81 [166] Williamson RA, Martorell G., Carr MD., Murphy G., Docherty AJP., Freedman RB., Feeney J (1994), “Solution structure of the active domain of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 A new member of the OB fold protein family” Biochemistry 33, pp.11745–11759 [167] Woolley DE., Roberts DR., Evanson JM (1975), “Inhibition of human collagenase activity by a small molecular weight serum protein”, Biochem Biophys Res Commun 66, pp.747–754 144 [168] Xia T., Akers K., Eisen AZ, Seltzer JL (1996), “Comparison of cleavage site specificity of gelatinases A and B using collagenous peptides”, Biochim Biophys Acta 16;1293(2): pp.259-266 [169] Yang, H., Wang, Y., Jiang, M., Oh, J.H., Herring, J & Zhou, P (2007), “2-Step optimization of the extraction and subsequent physical properties of channel catfish (Ictalurus punctatus) skin gelatin”, Journal of Food Science72, pp.C188-C195 [170] Ye Q.Z., Hupe D., &Johnson L., (1996), “Catalytic domains of matrix metalloproteinases: A molecular biology approach to drug discovery”, Current Medicinal Chemistry, 3(6), pp.407-418 [171] Zeng Jing, Teng Fang, Murray Barbara E , (2005), “Gelatinase Is Important for Translocation of Enterococcus faecalis across Polarized Human Enterocyte-Like T84 Cells”, Infect Immun 73(3): pp.1606– 1612 [172] Zhou P., Mulvaney S J., & Regenstein J M., (2006), “Properties of Alaska pollock skin gelatin: a comparison with Tilapia and pork skin gelatins”, Journal of Food Science, 71, C313–C321 [173] Zitka O., J Kukacka, S Krizkova, D Huska, V Adam, M Masarik, R Prusa and R Kizek, (2010), Matrix Metalloproteinases Current Medicinal Chemistry, 17, p3751-3768 [174] http://www.brendaenzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.35&onlyTable=Disease) [175] http://www.usbio.net/molecular-biology/373424) [176] https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.24; [177] https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.24.35; [178] http://www.ncbi.nlm.nih.gov [179] http://www.expasy.ch 145 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Vector pET 22b(+) Phụ lục 2: Vector pJET1.2 146 Phụ lục 3: Vector pJet1.2/Blunt Phụ lục 4: Trình tự nucleotide gen 16S rRNA chủng MD4 TGAAAGGCGC TTTCGGGTGT CGCTGATGGA TGGACCCGCG GTGCATTAGC TAGTTGGTGA 61 GGTAACGGCT CACCAAGGCC ACGATGCATA GCCGACCTGA GAGGGTGATC GGCCACACTG 121 GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT AGGGAATCTT CGGCAATGGA 181 CGAAAGTCTG ACCGAGCAAC GCCGCGTGAG TGAAGAAGGT TTTCGGATCG TAAAACTCTG 241 TTGTTAGAGA AGAACAAGGA CGTTAGTAAC TGAACGTCCC CTGACGGTAT CTAACCAGAA 301 AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGTGGCAAG CGTTGTCCGG 361 ATTTATTGGG CGTAAAGCGA GCGCAGGCGG TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC 421 TCAACCGGGG AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG CAGAAGAGGA GAGTGGAATT 481 CCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGATATA TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGGCTCT 541 CTGGTCTGTA ACTGACGCTG AGGCTCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT 601 GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTGGAG GGTTTCCGCC CTTCAGTGCT 661 GCAGCAAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGACC GCAAGGTTGA AACTCAAAGG 721 AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAGA 781 ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTTTGACCA CTCTAGAGAT AGAGCTTTCC CTTCGGGGAC 841 AAAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC 901 CGCAACGAGC GCAACCCTTA TTGTTAGTTG CCATCATTTA GTTGGGCACT CTAGCGAGAC 961 TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC 1021 TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGGAAGTA CAACGAGTCG CTAGACCGCG AGGTCATGCA 1081 AATCTCTTAA AGCTTCTCTC AGTTCGGATT GCAGGCTGCA ACTCGCCTGC ATGAAGCCGG 1141 AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCACGCCG CGGTGAATAC TTCCCGGGCC TTGT 147 Trình tự gen gelE chủng Enterococus faecalis MD4 CTACAAATAAGGATACGGTGTCAGGCATCTTTGTTGGAAGTTCATGTCTATTTTCTTCAC TTTTTGTAGCAGCAGAAGAACAAGTTTATTCAGAAAGTGAAGTTTCAACAGTTTTATCGA AGTTGGAAAAGGAGGCAATTTCTGAGGCAGCTGCTGAACAATATACGGTTGTAGATCGAA AAGAAGATGCGTGGGGGATGAAGCATCTTAAGTTAGAAAAGCAAACGGAAGGCGTTACTG TTGATTCAGATAATGTGATTATTCATTTAGATAAAAATGGTGCAGTAACAAGTGTTACAG GAAATCCAGTTGATCAAGTAGTGAAAATTCAATCGGTTGATGCAATCGGTGAAGAAGGAG TTAAAAAAATTATTGCTTCTGATAATCTGGAAAATAAAGATCTTGTCTTTTTAGCTATTG ACCAACGTGTAAATAATGAAGGGCAATTATTTTATAAAGTCAGAGTAACTTCTTCACCAA CTGGTGACCCCGTATCATTGGTTTATAAAGTGAACGCTACAGATGGAACAATTATGGAAA AACAAGATTTAACGGAACATGTCGGTAGTGAAGTAACGTTAAAAAACTCTTTTCAAGTAA CGTTTAATGTACCAGTTGAAAAAAGCAATACGGGAATTGCTTTACACGGAACGGATAACA CAGGGGTTTACCATGCAGTAGTTGATGGCAAAAATAATTATTCTATTATTCAAGCGCCAT CACTAGCGACATTAAATCAGAATGCTGTTGACGCCTATACGCATGGAAAATTTGTGAAAA CATATTATGAAGATCATTTCCAACGACACAGTATTGATGATCGAGGGATGCCCATCTTGT CAGTTGTTGATGAACAACATCCAGATGCTTATGACAATGCTTTTTGGGATGGAAAAGCAA TGCGTTATGGTGAAACAAGTACACCAACAGGAAAAACGTATGCTTCCTCTTTAGATGTAG TTGGTCATGAAATGACACATGGTGTGACGGAACATACTGCCGGTTTAGAATATTTAGGAC AATCAGGTGCCTTGAATGAATCTTATTCTGATTTGATGGGTTATATTATTTCGGGTGCAT CTAATCCAGAAATTGGTGCGGATACTCAGAGTGTTGACCGAAAAACAGGTATTCGAAATT TACAAACGCCAAGTAAACACGGACAACCAGAAACCATGGCTCAATACGACGATCGAGCAC GGTATAAAGGAACGCCTTATTATGATCAAGGCGGTGTTCATTATAATAGTGGAATTATTA ATCGGATTGGTTACACCATTATCCAGAACTTAGGCATTGAAAAAGCACAGACTATTTTCT ACAGCTCGTTAGTAAATTACTTAACACCTAAAGCACAATTCAGTGATGCTCGTGATGCGA TGCTTGCTGCTGCAAAAGTTCAATATGGCGATGAAGCAGCTTCAGTGGTGTCAGCAGCCT TTAACTCTGCTGGAATCGGAGCTAAAGAAGACATCAGG Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt tính rGEL Nhiệt độ (ᵒC) 20ᵒC Hoạt tính gelatinase (U/ml) 1,16±0,03 30ᵒC 1,45±0,04 37ᵒC 2,57±0,04 40ᵒC 2,89±0,02 45ᵒC 2,60±0,03 55ᵒC 1,73±0,03 5,0 Hoạt tính rGEL (U/ml) 0,87±0,09 6,0 1,30±0,12 6.5 2,60±0,09 7,0 2,92±0,14 7,5 2,89±0,17 8,0 2,60±0,20 8,5 2,54±0,23 9,0 2,31±0,03 10 1,73±0,06 11 1,45±0,12 12 0,58±0,09 pH 148 Phụ lục Hình ảnh ni sinh khối chủng tái tổ hợp mơi trường LB lỏng Hình ảnh nuôi sinh khối chủng tái tổ hợp môi trường LB lỏng Phụ lục 7: Một số hình ảnh sản xuất bột axit amin thủy phân từ da cá Tra gelatinase Da cá cấp đông đá lấy từ nhà máy chế biến Da cá sau xử lý tiền thủy phân 149 Sản phẩm thủy phân: Bột axit amin Phụ lục 8: Một số hình ảnh thí nghiệm ứng dụng bổ sung bột axit amin thủy phân từ da cá Tra vào thức ăn cho cá Mú giống Hệ thống giai thí nghiệm Đo chiều dài cá thí nghiệm Cá Mú chấm đen thí nghiệm Kiểm tra tăng trưởng cá theo khối lượng 150 Phụ lục Thành phần số phản ứng (1) Thành phần phản ứng cắt enzyme HindIII Thành phần Thể tích Điều kiện xử lý (µl) H2 O 60 Đệm 10X 15 pET 22(b+) /GelE 70 HindIII Tổng thể tích 150 Ủ 370C (2) Thành phần phản ứng cắt enzyme SalI Thành phần Thể tích Điều kiện xử lý (µl) H2 O 33 Đệm 10X 10 pET 22(b+) /GelE 54 SalI Tổng thể tích 100 Ủ 370C (3)Thành phần điều kiện phản ứng nối gen Thành phần Thể tích Điều kiện xử lý (µl) T4 ligase buffer gelE cắt SalI 10 HindIII, pET 22(b+) cắt SalI HindIII, T4 DNA ligase Tổng thể tích 20 Ủ 40C qua đêm 151 Phụ lục 10 Đường chuẩn định lượng Leucine Phương trình Đường chuẩn định lượng Lysine Y= 93,90726x + 89,52055 (R2 = 0,99989) ... cứu tạo gelatinase tái tổ hợp ứng dụng thủy phân gelatin da cá Tra? ?? Mục tiêu luận án Tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis ứng dụng. .. tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu ứng dụng gelatinase thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống Ý nghĩa thực tiễn Đưa khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ. .. khối lượng cá trung bình 7,067 g/con thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An 5.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra với