Báo cáo thực hành sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ Giảng viên hướng dẫn: Thầy Ngô Đức Duy NHÓM 01... Thiết bị Máy votex Máy ly tâm M

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ

Giảng viên hướng dẫn:  Thầy Ngô Đức Duy

NHÓM 01

I THIẾT BỊ - HÓA CHẤT – DỤNG CỤ

1.1 Thiết bị

Máy votex

Máy ly tâm

Máy điện đi

Máy PCR

Tủ lạnh

Tủ sấy

Máy đọc gel

1.2 Hóa chất

CTAB

Lysis solution

Hạt bead

Chloroform/Isomylacid

precipitation solution

Ethanol lạnh

DMSO

MyMix Taq

Reverse

Forward

Nước cất khử ion

1.3 Dụng cụ

Micropipet

Ống eppendorf

Cốc thủy tinh

II QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn LAB

- Bước 1: Chuẩn bị dịch nuôi cấy (đã có vi khuẩn)

- Bước 2: Ly tâm thu tế bào vi khuẩn

+ Tiến hành ly tâm lần thứ nhất để thu tế bào vi khuẩn

+ Lặp lại quy trình ly tâm lần thứ hai để tăng hiệu quả thu tế bào

- Bước 3: Phá vỡ tế bào và thu DNA

3.1 Ly giải tế bào (Lysis)

+ Sử dụng ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 5 phút

+ Mục đích: Phá vỡ thành tế bào vi khuẩn để giải phóng DNA

3.2 Làm sạch và tinh sạch DNA

+ Bổ sung 200 μL PS (chất bảo quản DNA)

+ Thêm 460 μL chloroform/isoamyl alcohol để loại bỏ protein và tạp chất + Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

+ Thu dịch nổi

- Bước 4: Phát hiện sản phẩm PCR

4.1 Kết tủa sản phẩm PCR

+ Thêm 525 μL dung dịch PS

+ Vortex 1 phút để trộn đều

+ Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Thu DNA bỏ dịch

4.2 Làm sạch sản phẩm PCR

+ Thêm 200 μL ethanol để lọc và làm sạch

+ Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút

+ Nạp sản phẩm PCR vào các giếng

+ Tiến hành điện di để phân tích nồng độ DNA

+ Quan sát kết quả dưới ánh sáng UV

Bước 6: Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR

+ Chuẩn bị:

  15µl MyTaq Mix

  3µl DNA

  1µl Forward

  1µl Reverse

  7µl DMS + Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu + Điều chỉnh các thông số chu trình nhiệt phù hợp

- Bước 7: Phát hiện sản phẩm PCR bằng điện di

+ Chuẩn bị gel điện di (gel agarose)

+ Nạp sản phẩm PCR vào các giếng

+ Tiến hành điện di để phân tích kích thước và nồng độ DNA + Quan sát và ghi nhận kết quả dưới ánh sáng UV

III KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH KẾT QUẢ

Kết quả thực hành:

Không phát hiện sản phẩm DNA

Giải thích kết quả:

-Lỗi trong quá trình thu mẫu: Nếu mẫu ban đầu không chứa đủ DNA mục tiêu, thì quá trình PCR sẽ không thể khuếch đại được đoạn DNA cần tìm kiếm

-Lỗi trong quá trình xử lý mẫu: Các lỗi trong quá trình tách chiết, tinh sạch DNA hoặc chuẩn bị mẫu có thể dẫn đến sự mất mát DNA

-Lỗi về lượng DNA: lượng DNA khuếch đại trong PCR thấp, nó có thể không đủ để phát

- Quá trình xử lý mẫu:

+Đảm bảo điều kiện bảo quản: Kiểm tra và đảm bảo các điều kiện bảo quản mẫu như nhiệt độ, thời gian và phương pháp không gây biến đổi hay mất mát DNA

+ Xác định và loại bỏ các chất ức chế PCR: Kiểm tra mẫu để phát hiện bất kỳ chất

ức chế nào có thể ảnh hưởng đến quá trình PCR và thực hiện các bước làm sạch cần thiết

- Về lượng DNA:

+Tăng số lần chu kỳ PCR: Có thể thử tăng số lần chu kỳ trong quá trình PCR để tăng lượng DNA khuếch đại

+ Phân tích định lượng DNA trước khi PCR: Sử dụng các phương pháp như  Nanodrop hoặc qPCR để xác định chính xác nồng độ DNA trong mẫu trước khi thực hiện PCR