Nghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue

NGUYỄN MINH NAMNGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN VÀ GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG CỦA MỘT SỐ LONG NON-CODING RNA LncRNA Ở NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2024... NGUYỄN MINghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết DengueNghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long non-coding RNA (LncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue

NGUYỄN MINH NAM

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN VÀ GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG

CỦA MỘT SỐ LONG NON-CODING RNA (LncRNA)

Ở NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2024

NGUYỄN MINH NAM

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN VÀ GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG

CỦA MỘT SỐ LONG NON-CODING RNA (LncRNA)

Ở NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

Ngành: Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới

tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu xác định một số biomarker ức chế vi rút Dengue để góp phần tiên lượng nặng trên bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue”

mã số NĐT/IL/21/12 Tôi là một thành viên nghiên cứu trong đề tài Tôi đã

được Chủ nhiệm đề tài và các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý chophép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu,kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Minh Nam

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dịch tễ bệnh sốt xuất huyết Dengue 3

1.1.1 Tình hình dịch sốt xuất huyết Dengue trên Thế giới 3

1.1.2 Tình hình dịch sốt xuất huyết Dengue tại Việt Nam 5

1.2 Một số hiểu biết cơ bản về virus Dengue 6

1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus Dengue 6

1.2.2 Phân type virus Dengue 7

1.2.3 Vòng đời virus Dengue 8

1.3 Cơ quan và tế bào có virus xâm nhập trong bệnh sốt xuất huyết Dengue 9

1.4 Cơ chế bệnh sinh và đáp ứng miễn dịch trong bệnh sốt xuất huyết Dengue 11

1.4.1 Vai trò của cơ chế tăng cường miễn dịch phụ thuộc vào kháng thể 11

1.4.2 Vai trò kiểu gen của virus Dengue 12

1.4.3 Vai trò của kháng nguyên protein không cấu trúc NS1 13

1.4.4 Vai trò của kháng thể kháng NS1 và các yếu tố miễn dịch 13

1.4.5 Vai trò của tế bào Lympho T 14

1.4.6 Vai trò các yếu tố di truyền của vật chủ 15

1.4.7 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh sốt xuất huyết Dengue 15

1.4.8 Rối loạn cơ bản trong sốt xuất huyết Dengue 16

1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh sốt xuất huyết Dengue 17

1.6 Tổng quan về lncRNA 19

1.6.1 Khái niệm 19

1.6.2 Phân loại các lncRNA 19

1.6.3 Vai trò của các lncRNA trong nhiễm virus 24

1.7.1 LncRNA trong nghiên cứu 29

1.7.2 Tình hình nghiên cứu về lncRNA ở bệnh sốt xuất huyết Dengue 34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.1 Nhóm bệnh 36

2.1.2 Nhóm chứng 39

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 40

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 40

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 40

2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 40

2.3.3 Phương pháp lựa chọn mẫu 42

2.3.4 Trang thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 42

2.3.5 Các bước tiến hành 44

2.4 Nội dung nghiên cứu 46

2.4.1 Chỉ tiêu về dịch tễ 46

2.4.2 Chỉ tiêu về lâm sàng 46

2.4.3 Chỉ tiêu về cận lâm sàng 48

2.5 Quy trình định lượng nồng độ các lncRNA huyết tương 50

2.5.1 Tạo mẫu cDNA nồng độ chuẩn 50

2.5.2 Xây dựng đường chuẩn 52

2.5.3 Định lượng nồng độ các lncRNA huyết tương 54

2.6 Phân tích thống kê 58

2.7 Đạo đức nghiên cứu 59

3.1.1 Đặc điểm dịch tễ học về tuổi, giới 61

3.1.2 Một số đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm của người bệnh nghiên cứu 62

3.1.3 Đặc điểm chung của nhóm chứng 66

3.2 Biểu hiện của các lncRNA huyết tương ở đối tượng nghiên cứu 67

3.3 Liên quan giữa biểu hiện của các lncRNA huyết tương với một số triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue ở giai đoạn nguy hiểm 70

3.3.1 Mối liên quan giữa các lncRNA với xét nghiệm chẩn đoán DENV 70

3.3.2 Liên quan giữa nồng độ các lncRNA với một số triệu chứng lâm sàng và huyết học ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue 73

3.3.3 Liên quan giữa nồng độ các lncRNA một số xét nghiệm sinh hóa ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue trong giai đoạn nguy hiểm 79

3.3.4 Giá trị chẩn đoán, tiên lượng của các lncRNA trong bệnh sốt xuất huyết Dengue ở giai đoạn nguy hiểm 81

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 92

4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 92

4.1.1 Đặc điểm tuổi, giới 92

4.1.2 Một số đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm của người bệnh nghiên cứu 93

4.2 Biểu hiện của các lncRNA huyết tương ở đối tượng nghiên cứu 97

4.3 Liên quan giữa biểu hiện của các lncRNA huyết tương với một số triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm và mức độ bệnh SXHD ở giai đoạn nguy hiểm 106

4.3.1 Mối liên quan giữa các lncRNA với xét nghiệm chẩn đoán DENV 106

4.3.2 Liên quan giữa nồng độ các lncRNA với một số triệu chứng lâm sàng và huyết học ở người bệnh SXHD 107

4.3.4 Giá trị chẩn đoán, tiên lượng của các lncRNA trong bệnh sốt xuất huyết

Dengue ở giai đoạn nguy hiểm 113

4.4 Một số hạn chế của đề tài 119

KẾT LUẬN 121

KIẾN NGHỊ 123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1 ADE Antibody-Dependent Enhancement (Tăng cường phụ

thuộc kháng thể)

2 AUC Area Under the Curve (diện tích dưới đường cong)

5 DCB Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo

6 DENV Dengue Virus (Virus Dengue)

7 DN Sốt xuất huyết Dengue nặng

8 ER Endoplasmic Reticulum (Màng lưới nội sinh chất)

9 AST Aspartate Aminotransferase

10 ALT Alanine Aminotransferase

11 HBV Hepatitis B Virus (Virus viêm gan B)

13 HCV Hepatitis C Virus (Virus viêm gan C)

14 HLA Human Leukocyte Antigen (Kháng nguyên bạch cầu

người)

15 HTNV Hantaan Orthohantavirus

16 IAV Influenza A virus (Virus cúm A)

17 IFI6 Interferon Alpha Inducible Protein 6 (IFN alpha cảm

ứng protein 6)

20 ILK Integrin Linked Kinase (Kinase liên kết với integrin)

21 IRF Interferon Regulatory Factor (Yếu tố điều hòa

interferon)

23 ITP Idiopathic Thrombocytopenic Purpura (Hội chứng giảm

tiểu cầu không rõ nguyên nhân)

24 LincRNA Intergenic lncRNA

25 LncRNA Long non coding RNA (RNA dài không mã hóa)

26 MDA5 Melanoma Differentiation-Associated Gene 5 (Gen 5

liên quan đến biệt hóa khối u da ác tính)

27 miRNA microRNA (ARN nhỏ không mã hóa)

28 mRNA Messenger RNA (RNA thông tin)

29 NEAT1 Nuclear Enriched Abundant Transcript 1 (Bản phiên mã

làm giàu hạt nhân 1)

30 NF-κB

Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of Activated B cells (Yếu tố tăng cường chuỗi nhẹ kappa của các tế bào B hoạt hóa)

31 NK Natural Killer cell (Tế bào diệt tự nhiên)

32 NS1 Non-structural protein 1 (Protein không cấu trúc 1)

33 p53 Tumor suppressor gene p53 (Protein ức chế khối u p53)

34 PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells (Tế bào đơn nhân

máu ngoại vi)

35 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi)

36 RIG-I Retinoic Acid-Inducible Gene I (Gen cảm ứng acid

retinoic I)

37 RNase L Ribonuclease L

38 RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược)

40 SOCS Suppressor Of Cytokine Signaling (Ức chế tín hiệu

cytokin)

41 STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

(Yếu tố hoạt hóa và truyền tín hiệu phiên mã)

42 SXHD Sốt xuất huyết Dengue

44 TF Transcription Factor (Yếu tố phiên mã)

45 TLR Toll-like Receptor (Thụ thể giống Toll)

46 TNF Tumor Necrosis Factor (Yếu tố hoại tử khối u)

47 WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Vai trò của một số lncRNA tế bào vật chủ trong quá trình nhiễm virus 25

2.1 Trình tự các cặp mồi khuếch đại lncRNA trong nghiên cứu 44

2.2 Thông tin các mẫu plasmid tái tổ hợp tách dòng 51

3.1 Đặc điểm tuổi, giới của người bệnh nghiên cứu 61

3.2 Đặc điểm lâm sàng chung của người bệnh nghiên cứu 62

3.3 Một số đặc điểm lâm sàng của nhóm DCB và DN 63

3.4 Một số đặc điểm cận lâm sàng ở giai đoạn nguy hiểm của người bệnh trong nghiên cứu 64

3.5 Đặc điểm xét nghiệm dấu ấn phát hiện sốt xuất huyết Dengue 65

3.6 Đặc điểm của nhóm chứng 66

3.7 Nồng độ lncRNA EPB41L4A-AS1, IFI6lnc1, IFI6lnc2, HID1-AS1, Lnc-ILK-4 ở các nhóm nghiên cứu trong giai đoạn nguy hiểm 67

3.8 Biểu hiện OAS1-lnc102 ở các nhóm nghiên cứu trong giai đoạn nguy hiểm 68

3.9 Nồng độ các lncRNA ở nhóm NB dương tính và âm tính với kháng nguyên DENV-NS1 70

3.10 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh dương tính và âm tính với kháng thể DENV-IgM 71

3.11 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh dương tính và âm tính với kháng thể DENV-IgG 72

3.12 Tương quan giữa nồng độ các lncRNA với tuổi và một số xét nghiệm ở người bệnh SXHD 73

3.13 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh theo mức độ bạch cầu trong giai đoạn nguy hiểm 74

đoạn nguy hiểm 753.15 Nồng độ các lncRNA theo giới tính 763.16 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh có và không có xuất huyết dưới

da 773.17 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh có và không có xuất huyết niêm

mạc 783.18 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh theo mức độ enzym AST 793.19 Nồng độ các lncRNA ở nhóm người bệnh theo mức độ enzym ALT 803.20 Giá trị phân biệt 2 nhóm SXHD và DCB của các lncRNA 813.21 Giá trị phân biệt 2 nhóm SXHD không nặng và DN của các lncRNA 823.22 Phân tích hồi quy đơn biến các yếu tố liên quan tới mức độ nặng ở người

bệnh SXHD 833.23 Phân tích đa biến, các yếu tố nguy cơ nặng ở người bệnh SXHD 843.24 Giá trị phân biệt 2 nhóm DCB và DN của các lncRNA 853.25 Phân tích hồi quy đơn biến các yếu tố liên quan tới mức độ nặng giữa

nhóm DN và DCB 863.26 Phân tích đa biến, các yếu tố nguy cơ SXHD nặng ở nhóm DCB và DN883.27 Giá trị phân biệt người bệnh sống và tử vong trong nhóm SXHD nặng893.28 Phân tích đơn biến các yếu tố liên quan tới tử vong ở người bệnh SXHD

nặng 903.29 Phân tích đa biến, các yếu tố nguy cơ tử vong ở nhóm SXHD nặng 91

DANH MỤC HÌNH

1.2 Số ca nhập viện và tử vong do SXHD theo tuần trong năm 2022 so với

năm 2023, tính đến tuần 37 năm 2023 tại Việt Nam 6

1.3 Cấu trúc virus Dengue 6

1.4 Phân bố các type huyết thanh virus Dengue tại Việt Nam 7

1.5 Vòng đời của virus Dengue 9

1.6 Một số cơ quan đích tấn công của virus Dengue 11

1.7 Thời gian nhiễm virus Dengue và biểu hiện của các marker chẩn đoán16 1.8 Các giai đoạn của bệnh SXHD 17

1.9 Phân loại lncRNA dựa vào vị trí của lncRNA so với gen mã hóa protein20 1.10 Phân loại theo vị trí tác động trên DNA 21

1.11 Cơ chế điều hòa phiên mã của lncRNA 21

1.12 Cơ chế điều hòa sau phiên mã của lncRNA 22

1.13 Cơ chế tái tạo chất nhiễm sắc của lncRNA 23

1.14 Cơ chế hoạt động khác của lncRNA 23

1.15 Một số lncRNA điều hòa kháng virus 27

2.1 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 43

2.2 Biểu đồ đường chuẩn các lncRNA nghiên cứu 53

2.3 Nguyên lý hoạt động máy tách RNA tự động 55

2.4 Sơ đồ nghiên cứu 60

3.1 Nồng độ các lncRNA ở nhóm theo dõi dọc 69

Hình Tên hình Trang 3.2 Biểu đồ đường cong ROC của các lncRNA trong phân biệt 2 nhóm bệnh SXHD và DCB 81

3.4 Biểu đồ đường cong ROC của các lncRNA trong phân biệt 2 nhóm bệnh

DCB và DN 853.5 Biểu đồ đường cong ROC của các lncRNA trong phân biệt người bệnh tử

vong và sống trong nhóm SXHD nặng 88

Số lượng người bệnh SXHD ghi nhận được đã tăng tám lần trong hai thập

kỷ vừa qua Năm 2019 là năm có số ca mắc SXHD nhiều nhất từng được báocáo trên toàn cầu với trên 56 triệu ca bệnh và 36.000 trường hợp tử vong [1], [2], [3] Hàng năm ghi nhận khoảng 500.000 người bệnh SXHD nặng với tỷ lệ tửvong khoảng 10% Tuy nhiên, tỷ lệ này có thể được giảm xuống dưới 1% nếungười bệnh được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời [3] Tiên lượng sớm diễnbiến bệnh có thể ngăn ngừa tử vong do SXHD, nhưng hiện nay đây vẫn còn làmột thách thức với các bác sĩ lâm sàng [4] Đã có nhiều nghiên cứu trong nước

và trên thế giới đánh giá các chỉ số lâm sàng và xét nghiệm cơ bản, miễn dịchtrong tiên lượng bệnh SXHD nặng

RNA dài không mã hóa (LncRNA) là các phân tử RNA không mã hóaprotein, có độ dài trên 200 nucleotide Nhiều lncRNA không chỉ tham gia vàophản ứng kháng virus, mà còn đóng vai trò trong nhiều tương tác giữa virus vàvật chủ [5] Hơn nữa, sự khác biệt trong biểu hiện của các lncRNA còn có thểđược sử dụng làm dấu ấn sinh học trong tiên lượng, chẩn đoán và điều trị cácbệnh do virus gây ra [6], [7]

Một số lncRNA đã được chứng minh có vai trò trong nhiễm virus như:LncRNA EPB41L4A-AS1 liên quan tới quá trình giải phóng các cytokin và đápứng viêm quá mức trong bệnh COVID 19 [8]; IFI6lnc1 ức chế các phản ứngkháng virus bẩm sinh thông qua cơ chế điều hòa âm tính các gen kích thích bởiinterferon (ISG), dẫn tới tăng cường sao chép virus viêm gan C (HCV) [9], [10]; Tăng biểu hiện của IFI6lnc2 sẽ dẫn tới ức chế sao chép virus cúm A (IAV) [11

] LncRNA HID1-AS1 được chỉ ra có liên quan tới biểu hiện của 493 gen mãhóa protein [12] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy các lncRNA tham giađiều hòa biểu hiện của các gen lân cận [13], [14] Gen ILK mã hóa protein ILK

(Integrin Linked Kinase) [15], [16] Ở chuột khi bị nhiễm DENV, việc ức chếILK sẽ làm giảm tải lượng virus trong não cũng như giảm mức độ nặng và tỷ lệ

tử vong [17] Gen OAS1 có khả năng ức chế sự nhân lên của DENV, đóng vai

trò quan trọng trong diễn biến nặng của SXHD [18]

Khi tiến hành nghiên cứu trên mô hình tế bào, kết quả cho thấy cáclncRNA EPB41L4A-AS1, IFI6lnc1, IFI6lnc2, HID1-AS1, ILK 4, OAS1lnc102 đều tăng biểu hiện hơn ở các tế bào bị nhiễm DENV so với các tế bàokhông bị nhiễm [19] Điều này gợi ý rằng các lncRNA này có thể đóng vai trònào đó trong đáp ứng của cơ thể với nhiễm DENV và cơ chế bệnh sinh củaSXHD Do đó, việc nghiên cứu biểu hiện của các lncRNA trên có thể giúp hiểu

rõ hơn về cơ chế cũng như ứng dụng trong việc tiên lượng sớm nguy cơ tiếntriển nặng ở người bệnh SXHD, từ đó giúp các bác sĩ lâm sàng có những biệnpháp can thiệp thích hợp để giảm thiểu mức độ nghiêm trọng của bệnh Xuấtphát từ những cơ sở lý thuyết và thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu mức độ biểu hiện và giá trị tiên lượng của một số long

non-coding RNA (lncRNA) ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue” với 2 mục tiêu:

1 Xác định mức độ biểu hiện của một số lncRNA huyết tương ở người

bệnh sốt xuất huyết Dengue theo các mức độ bệnh khác nhau.

2 Phân tích mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của một số lncRNA

huyết tương với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và giá trị tiên lượng

ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ bệnh sốt xuất huyết Dengue

1.1.1 Tình hình dịch sốt xuất huyết Dengue trên Thế giới

Sốt xuất huyết Dengue là một bệnh truyền nhiễm do virus gây ra, được

coi là bệnh có khả năng lây truyền sang người nhanh nhất qua trung gian truyền

bệnh là muỗi Aedes aegypti Tỷ lệ mắc và tử vong do SXHD vẫn là một gánh

nặng với hệ thống y tế toàn cầu, trong khi các biện pháp điều trị chủ yếu tậptrung vào điều trị hỗ trợ, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu với mầm bệnh SXHD

là bệnh tự hồi phục với tỷ lệ tử vong thấp (< 1%) nếu được điều trị đúng Một sốngười bệnh tiến triển tới SXHD nặng với tỷ lệ tử vong có thể lên tới 20% nếukhông được điều trị Tuy nhiên, tỷ lệ này có thể giảm xuống khoảng từ 2 đến 5%nếu được điều trị kịp thời [20]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay virus Dengue lưu hành và

gây thành dịch ở trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ, với số ca mắc mới hàngnăm ước tính khoảng 390 triệu ca, chủ yếu tập trung ở khu vực châu Á (chiếmkhoảng 70%) SXHD đang mở rộng sang các khu vực mới bao gồm cả châu Âu

và các đợt bùng phát SXHD cũng đã xảy ra ở những khu vực này Pháp vàCroatia đã báo cáo những ca bệnh SXHD lây nhiễm trong nước đầu tiên vàonăm 2010 [1] SXHD đã xuất hiện ở nhiều khu vực khác nhau trên thế giới nhưchâu Mỹ, châu Phi, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái BìnhDương, trong đó châu Mỹ, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là những nơi

bị ảnh hưởng nặng nề nhất Trải qua hơn 20 năm, số người bệnh SXHD liên tụcđược ghi nhận tăng Theo WHO, năm 2000 ghi nhận 505.430 ca SXHD; 2,4triệu ca vào năm 2010; nhưng con số này đã tăng lên 5,2 triệu ca vào năm 2019

Số ca tử vong được báo cáo cũng tăng từ 960 ca vào năm 2000, 4.032 ca vàonăm 2015 và 36.055 ca vào năm 2019 [21], [20] Năm 2019 cũng là năm số ca

mắc sốt xuất huyết Dengue lớn nhất từng được báo cáo Hầu hết tất cả các khu

vực trên thế giới đều bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh và đây cũng là lần đầu tiênSXHD được ghi nhận tại Afghanistan Hoa Kỳ có 3,1 triệu trường hợp mắcbệnh với hơn 25.000 trường hợp SXHD nặng Số lượng lớn các ca bệnh cũngđược thông báo tại khu vực châu Á: Bangladesh (101.000), Malaysia (131.000)Philippines (420.000) [1] Gần đây, trung tâm Phòng chống và Kiểm soát Dịchbệnh Châu Âu đã ghi nhận dịch SXHD bùng phát sau thời kỳ đại dịch COVID-

19 Theo đó, từ tháng 1 năm 2022 đến ngày 31 tháng 12 năm 2022, có 4.110.465trường hợp nhiễm DENV, 4.099 trường hợp tử vong Phần lớn các ca bệnhSXHD từ Brazil (2.363.490), Việt Nam (367.729), Philippines (220.705),Indonesia (125.888) và Ấn Độ (110.473), các nước có số ca tử vong cao nhấtbao gồm Indonesia (1.082), Brazil (991), Philippines (722), Việt Nam (140) và

Ấn Độ (86) [20] Trong hơn 50 năm qua, tỷ lệ mắc SXHD đã tăng lên gấp 30lần, cùng với sự mở rộng về mặt địa lý đến các nước mới, từ thành thị tới nôngthôn [22]

Hình 1.1 Số ca sốt xuất huyết Dengue năm 2019 trên toàn cầu

*Nguồn:OurWorldInData.org/burden-of-disease [ 23 ]

1.1.2 Tình hình dịch sốt xuất huyết Dengue tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh SXHD xảy ra quanh năm, cao điểm là vào mùa mưa(từ tháng 4 đến tháng 10 ở miền Bắc và tháng 6 đến tháng 12 ở miền Nam).SXHD xảy ra ở cả trẻ em và người lớn Tỷ lệ người trên 15 tuổi mắc SXHD tạicác tỉnh phía Nam đã tăng từ 35% năm 1999 lên đến 60% năm 2017 BệnhSXHD có tỉ lệ mắc/100.000 dân là 56,7 và trung bình tỉ lệ tử vong/mắc là0,029% Bệnh lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố, nhưng tập trung chủ yếutại các tỉnh miền Nam và miền Trung Giai đoạn từ 2000 - 2015, trung bình mỗinăm ghi nhận khoảng 50.000 đến 100.000 trường hợp mắc, gần 100 trường hợp

tử vong [24]

Mặc dù có nhiều biện pháp tích cực trong điều trị và dự phòng SXHD,nhưng diễn biến bệnh tại Việt Nam vẫn còn phức tạp Năm 2019, cả nước có320.702 trường hợp SXHD, 54 ca tử vong, tỷ lệ tử vong/mắc là 0,02% [25].Tính đến tuần thứ 49 năm 2022, cả nước ghi nhận 345.234 ca SXHD với 131 ca

tử vong (tỷ lệ tử vong/mắc là 0,04%) So với cùng kỳ năm 2021 số ca mắc tíchlũy tăng gấp 5 lần (tổng số ca mắc là 6.9140; 26 trường hợp tử vong, tỷ lệ tửvong/mắc là 0,04%) [26] Đến 15 tháng 10 năm 2023, cả nước ghi nhận 113.962

ca mắc SXHD, 31 trường hợp tử vong, so với cùng kỳ năm 2022 thì số ca mắcgiảm 56,8% (264.078 NB trong đó có 128 NB tử vong) [27] Ước tính cókhoảng 2 triệu ca mắc SXHD hàng năm, mặc dù trung bình chỉ có khoảng95.000 trường hợp được báo cáo hàng năm cho Bộ Y tế trong giai đoạn 2002đến 2020 Số ca mắc trên thực tế cao hơn do việc giám sát SXHD ở Việt Namcòn khá thụ động, chủ yếu dựa vào các trường hợp lâm sàng do người bệnh đếnkhám bệnh báo cáo Trong khi đó, có tới 80% trường hợp người bệnh không cótriệu chứng hoặc triệu chứng nhẹ và có thể sẽ không đi khám Thiệt hại kinh tế

do SXHD gây ra ở Việt Nam ước tính khoảng 30 đến 95 triệu đô la Mỹ mỗi năm[28]

Hình 1.2 Số ca nhập viện và tử vong do SXHD theo tuần trong năm 2022 so

với năm 2023, tính đến tuần 37 năm 2023 tại Việt Nam

*Nguồn: Tổ chức y tế Thế giới (2023) [ 29 ].

1.2 Một số hiểu biết cơ bản về virus Dengue

1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus Dengue

Virus Dengue được phân lập lần đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1943

bằng cách tiêm huyết thanh của người bệnh SXHD vào chuột [30] DENV

thuộc giống Flavivirus, họ Flaviviridae [22]

Hình 1.3 Cấu trúc virus Dengue

*Nguồn: Nanaware N và cộng sự (2021) [ 31 ]

Cấu trúc: DENV hình cầu, đối xứng, có đường kính 50 nm [30]

- Nhân chứa một sợi RNA

- Lớp vỏ có bản chất là lipoprotein.

Bộ gen của virus Dengue thuộc hệ gen RNA, với chiều dài 11.000 cặp

base Trình tự các protein được mã hóa trong khung đọc mở là NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ Trong đó, một phần tư đầu 5’của bộ gen mã hóa cho các protein cấu trúc C, prM và E; ba phần tư sau mã hóacho phần còn lại Đầu kết thúc 3’ có những vùng không mã hóa [30]

5’-C-prM-E-1.2.2 Phân type virus Dengue

Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên, virus

Dengue được chia thành 4 type huyết thanh và ký hiệu là DENV1, DENV2,

DENV3 và DENV4 Vào năm 2007, type huyết thanh thứ năm lần đầu tiênđược phát hiện (DENV-5) trong máu của một người bệnh ở bang Sarawak củaMalaysia Tất cả các type huyết thanh đều có một số dưới nhóm dựa trên một sốthay đổi trong bộ gen của virus Không có sự ngưng kết chéo giữa các typehuyết thanh cho nên khi người bệnh mắc SXHD do một type huyết thanh nào đógây ra thì cơ thể chỉ có miễn dịch chắc chắn với type huyết thanh đó và khôngmắc lại Tuy nhiên, không có miễn dịch chéo đối với các type huyết thanh khác,

do đó có thể mắc với các type huyết thanh khác [30]

Hình 1.4 Phân bố các type huyết thanh virus Dengue tại Việt Nam

*Nguồn: Taurel A.F và cộng sự (2023) [ 32 ]

1.2.3 Vòng đời virus Dengue

Vòng đời của virus Dengue bao gồm các bước xâm nhập, sao chép, lắp ráp và giải phóng Sau khi xâm nhập vào cơ thể, protein E của virus Dengue sẽ

liên kết với các thụ thể trên bề mặt tế bào như DC-SIGN/L-SIGN, glycoprotein(như thụ thể heparan sulfate hoặc thụ thể mannose), từ đó xâm nhập vào nộibào Trong tế bào vật chủ, sự thay đổi pH sẽ tạo điều kiện cho việc hợp nhất giữamàng tế bào virus và màng của thể nội bào (endosome) để giải phóngnucleocapsid, sau đó lớp vỏ bị phá vỡ để giải phóng bộ gen của virus Khi bộgen của virus được giải phóng vào tế bào chất, RNA virus mạch dương sẽ đượcdịch mã thành một polyprotein duy nhất Tiếp theo, polyprotein này được phâncắt bởi protease của virus (NS2B, NS3) để tạo ra 3 protein cấu trúc và 7 proteinkhông cấu trúc Sau đó, quá trình tổng hợp trung gian mạch âm diễn ra, quátrình này đóng vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp RNA virus mạch dương mới.Các protein không cấu trúc sao chép bộ gen RNA và thông qua nhiều vòngphiên mã để tạo ra nhiều bộ gen virus và sau đó là protein virus

Quá trình lắp ráp virus diễn ra tại mạng lưới nội chất (endoplasmicreticulum - ER), tại đó các protein vỏ và RNA virus mới tạo ra được bọc bởimàng ER và glycoprotein, tạo thành các hạt virus chưa trưởng thành Những hạtvirus này sau đó sẽ được vận chuyển qua con đường bài tiết và mạng lưới Golgi(trans -Golgi - TGN) nơi có môi trường acid (pH thấp) Trong môi trường acid,protease furin của vật chủ sẽ phân cắt protein tiền thân màng (prM) chưa trưởngthành để tạo thành protein M trưởng thành Khi virus trưởng thành thành công,virus sẽ được giải phóng khỏi tế bào [33], [34]

Hình 1.5 Vòng đời của virus Dengue

Da là rào cản đầu tiên đối với các tác nhân gây bệnh và có vai trò chínhtrong đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Sau khi muỗi đốt, DENV đầu tiên xâm nhậpvào da và lây nhiễm sang các tế bào ở lớp biểu bì và hạ bì Các tế bào là đích tấncông chính của DENV bao gồm tế bào Langerhans (LC), đại thực bào, tế bàotua (dendritic cells), tế bào sừng, nội mô, nguyên bào sợi và tế bào mast Sau khi

các tế bào (tế bào tua, đại thực bào da, tế bào Langerhans) bị nhiễm DENV,chúng sẽ di chuyển theo hệ bạch huyết đến các hạch bạch huyết và lách, lâynhiễm cho các cơ quan này Nhiều loại tế bào trong hạch bạch huyết của người

đã được chứng minh mang DENV và có thể hỗ trợ quá trình nhân lên của virusgồm đại thực bào nguồn gốc bạch mạch, trung tâm mầm phản ứng của hạchbạch huyết, tế bào lympho, tế bào plasma và tế bào đơn nhân DENV nhân lêntrong các tế bào này và lây lan trong hệ thống bạch huyết, cuối cùng lây nhiễmcác tế bào đơn nhân có nguồn gốc từ máu và tế bào tua dòng tủy, từ đó phát tánvirus đến các cơ quan khác trong cơ thể [35]

Jessie K và cộng sự đã phát hiện kháng nguyên của DENV trong tế bàogan, tế bào Kupffer, tế bào nội mô, tế bào lympho và tế bào đơn nhân trong lòngmạch ở mẫu sinh thiết gan [36] RNA của DENV đã được phân lập từ các mẫutủy xương của người bệnh tử vong do SXHD Ngoài ra, nghiên cứu của Jessie

K cũng nhận thấy kháng nguyên DENV chỉ được phát hiện trong các tế bào tủynhưng không có trong các tế bào mẫu tiểu cầu [36] Khi nuôi cấy DENV2 trongtủy xương cho thấy virus có thể nhân lên trong các tế bào mô đệm Hơn nữa,DENV còn có thể lây truyền trong các tế bào dòng tủy và tế bào tạo máu [35]

Biến chứng thần kinh gặp ở khoảng 4-5% người bệnh SXHD Hầu hếtcác trường hợp có biến chứng thần kinh ở người bệnh SXHD đều có thể pháthiện được kháng nguyên (RNA hoặc NS1) trong dịch não tủy bằng phươngpháp RT-PCR hoặc ELISA Bên cạnh đó, các kháng thể đặc hiệu DENV IgGhoặc IgM cũng có thể xuất hiện trong dịch não tủy Các nghiên cứu ở ngườibệnh tử vong do SXHD chỉ ra sự hiện diện của DENV trong các tế bào thần kinhcủa não, một số tế bào lympho trong mạch máu não, tế bào Purkinje trong tiểunão, tế bào thần kinh đệm hình sao Các kháng nguyên của DENV cũng đượcphát hiện trong các sợi cơ tim, tế bào nội mô và tế bào kẽ cơ tim, từ đó chứngminh sự tồn tại và nhân lên của virus trong các tế bào này Ngoài ra, DENV còntấn công vào hệ thống tiêu hóa, tuyến ức, thận [35]

Hình 1.6 Một số cơ quan đích tấn công của virus Dengue

bộ gen của virus, cơ chế tăng cường phụ thuộc kháng thể (ADE), phản ứng của

tế bào lympho T nhớ, kháng thể kháng NS1 và yếu tố tự miễn Các diễn biếnnặng của bệnh SXHD là do tác động tổng hợp của tất cả các yếu tố nêu trên [37]

1.4.1 Vai trò của cơ chế tăng cường miễn dịch phụ thuộc vào kháng thể

Có nhiều bằng chứng để chứng minh rằng bị SXHD thứ phát với các type virus khác có nguy cơ mắc SXHD nặng cao hơn so với nhiễm trùng nguyênphát [37], [38] Hiện tượng này được gọi là sự tăng cường miễn dịch phụ thuộcvào kháng thể (ADE), lần đầu tiên được quan sát thấy vào năm 1973, khi có sựtăng trưởng tương đối nhanh của DENV trong môi trường nuôi cấy tế bào bạch

cầu đa nhân trung tính từ các cá thể có miễn dịch với DENV, trái ngược với các

cá thể không có miễn dịch trước đó Người bệnh nhiễm SXHD thứ phát với type virus khác tiếp theo sau nhiễm tiên phát có thể dẫn đến phản ứng chéo giữa cáckháng thể có sẵn từ lần nhiễm đầu tiên, những kháng thể này liên kết với virusnhưng không thể trung hòa nó, do đó hình thành phức hợp miễn dịch kháng thể -virus Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho hiện tượng thực bào phức hợp miễndịch kháng thể - virus của đại thực bào sau khi nhận biết thụ thể Fcγ, bên cạnh

đó cũng ức chế các gen kháng virus thông qua ức chế IFN type 1 và tăng cườngsản xuất IL10 từ đó dẫn đến khả năng tăng cường nhân lên của virus Gia tăngtải lượng virus gây ra các đáp ứng miễn dịch, cuối cùng dẫn đến thoát mạch và

các biểu hiện của sốt xuất huyết Dengue nặng [37], [39] Hơn nữa, ADE quatrung gian thụ thể Fcγ còn gây tăng giải phóng các cytokin từ các tế bào miễn dịchdẫn đến rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu và tăng tính thấm thành mạch

[37]

1.4.2 Vai trò kiểu gen của virus Dengue

SXHD nặng có thể xảy ra ở cả 4 type huyết thanh DENV Tuy nhiên, do

sự khác biệt về kiểu gen giữa các type DENV khác nhau nên mỗi kiểu gen có sựkhác biệt về độc lực cũng như khả năng gây bệnh [37], [40]

Sự biến đổi trong bộ gen DENV không phải là yếu tố duy nhất góp phầnvào cơ chế bệnh sinh của SXHD nặng Bên cạnh đó, Subgenomic flavivirusRNA (sfRNA) - đoạn RNA của virus cũng có vai trò quan trọng trong việc saochép của DENV cũng như diễn biến của bệnh SfRNA được tạo ra khi bộ genDENV RNA (11 kb) bị phân hủy hoàn toàn thành các RNA nhỏ (kích thước từ0,3 đến 0,5 kb) bởi exoribonuclease của vật chủ, trong quá trình sao chép.SfRNA này tích lũy và ngăn chặn các đáp ứng miễn dịch kháng virus của vậtchủ, đặc biệt là tín hiệu IFN type 1 Bằng cách thay đổi tính ổn định mRNA củavật chủ, các sfRNA góp phần giúp DENV lẩn trốn khỏi hệ thống miễn dịch, từ

đó dẫn đến sốt xuất huyết Dengue nặng [37], [41]

1.4.3 Vai trò của kháng nguyên protein không cấu trúc NS1

Protein NS1 tồn tại dưới 2 dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết(sNS1) [42], [43] Trong giai đoạn cấp tính của bệnh, nồng độ sNS1 đặc biệt cao

và nồng độ này có sự tương quan với mức độ nặng của bệnh [37] Khángnguyên NS1 được chứng minh là một yếu tố chính gây ra mất tính toàn vẹn củalớp tế bào nội mô do nó tác động lên các thụ thể TLR4, từ đó hoạt hóa các tế bàođại thực bào và các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính ngoại vi sản xuất cáccytokin gây viêm [44] Ở người, NS1 cũng gây ra bong heparan sulfateproteoglycan, dẫn đến phá vỡ lớp glycocalyx trong nội mô mạch máu phổi, dẫnđến mất acid sialic của các tế bào bề mặt đường hô hấp [37]

NS1 có thể trực tiếp hoạt hóa bổ thể, từ đó kích thích sản xuất các cytokingây viêm Hậu quả là dẫn tới thoát huyết tương và tích tụ dịch trong khoang gianbào, cuối cùng gây ra hội chứng sốc SXHD [45] Việc hoạt hóa bổ thể của NS1giúp cho quá trình opsonin hóa virus Kết quả của hoạt hóa bổ thể sẽ dẫn tới lygiải các tế bào đích thông qua liên kết với các phức hợp tấn công màng (MAC),trong đó có protein bổ thể C5b-C9 Phức hợp C5b-C9 có thể thúc đẩy biểu hiệncủa các cytokin viêm, điều này dẫn tới các diễn biến nặng của bệnh trên lâmsàng [37]

1.4.4 Vai trò của kháng thể kháng NS1 và các yếu tố miễn dịch

Kháng thể kháng NS1 liên kết với các protein NS1 trên màng tế bào, dẫnđến hoạt hóa con đường dẫn truyền tín hiệu tế bào và quá trình phosphoryltyrosin của các protein tế bào Các kháng thể kháng NS1 có thể kích thích giảiphóng nhiều chất trung gian gây viêm bao gồm MCP-1 (Monocytechemoattractant protein-1), IL-6 và IL-8 [37] Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vaitrò quan trọng của các cytokin này trong việc làm tăng mức độ nặng và nguy cơ

tử vong ở người bệnh SXHD Nồng độ IL-6 và IL-8 ở người bệnh SXHD có dấuhiệu cảnh báo và SXHD nặng cao hơn đáng kể so với NB SXHD Nồng độ IL-8

có liên quan đến tình trạng giảm tiểu cầu và tăng nồng độ enzym ALT [46] Các

kháng thể kháng-DENV NS1 còn có tính chất tự miễn dịch, thúc đẩy quá trìnhchết theo chương trình của tế bào nội mô Có rất nhiều tự kháng nguyên có cấutrúc tương đồng với protein DENV NS1 và các protein DENV prM và E, từ đó gây ra phản ứng chéo của kháng thể kháng lại các kháng nguyên này [47] Cáckháng thể có thể phản ứng chéo với một số tự kháng nguyên, bao gồmplasminogen, integrin và tiểu cầu Kết quả các quá trình trên dẫn đến giảm tiểucầu, rối loạn đông máu và thoát mạch trong bệnh SXHD nặng [37].

1.4.5 Vai trò của tế bào Lympho T

Các nghiên cứu khác nhau đã gợi ý rằng phản ứng của các tế bào lympho

T (hoạt động trong quá trình nhiễm trùng thứ phát với các type virus khác nhau)đóng vai trò trung gian trong cơ chế bệnh sinh của SXHD Số lượng tế bàolympho T trong giai đoạn hồi phục ở những người bệnh mắc sốt xuất huyết

Dengue nặng cao hơn so với những người mắc ở mức độ nhẹ [37], [48] Ởnhững người bệnh mắc bệnh SXH nặng, các tế bào T phản ứng đặc hiệu với viru

s Dengue sẽ sản xuất ra lượng cytokin và chemokin cao hơn Các tế bào lympho

T hỗ trợ type 2 và tế bào T điều hòa CD4+,CD25+ là các tế bào chính sản xuất IL-10 IL-10 ức chế hoạt động của các tế bào NK (tế bào diệt tự nhiên) khángvirus trong đáp ứng miễn dịch đối với nhiễm DENV IL-10 cũng ức chế NF-κB

Mà NF-κB có vai trò rất quan trọng đối với phản ứng kháng virus của IFN thôngqua trung gian TLR, sản xuất IL-2, IL-12, TNF-α, IFN-γ, và biểu hiện khángnguyên MHC lớp II Nồng độ IL-10 tăng cao trong huyết thanh của bệnh nhânsốt xuất huyết Dengue nặng còn thúc đẩy quá trình chết theo chương trình của tếbào T, làm giảm khả năng thanh thải virus T CD8+ sản xuất các cytokine nhưTNF-α, IFN-ϒ và IL-13 Tế bào T CD4+ còn sản xuất ra yếu tố gây độc tế bào(hCF) hCF kích thích đại thực bào sinh ra các gốc tự do, nitrit và phản ứng oxyhóa, điều chỉnh trực tiếp quá trình tăng sản xuất các cytokin tiền viêm IL-1,TNF-α, IL-8 và H2O2, tiêu diệt các tế bào đích thông qua quá trình chết theochương trình dẫn đến các biểu hiện của SXHD nặng [37]

1.4.6 Vai trò các yếu tố di truyền của vật chủ

Bên cạnh các yếu tố của virus còn có vai trò của các yếu tố di truyền củavật chủ liên quan đến cơ chế bệnh sinh của SXHD Một trong những yếu tố ditruyền của vật chủ có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh SXHD

là kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen -HLA) Nhiều

alen HLA lớp I đã được thấy có mối liên quan với bệnh sốt xuất huyết Dengue

nặng ở người bệnh SXHD thứ phát HLA lớp II (đặc biệt là alen DRB1) đãđược chứng minh là có tác dụng bảo vệ khi nhiễm DENV và ngăn ngừa diễnbiến nặng của bệnh [37]

1.4.7 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh sốt xuất huyết Dengue

Trong nhiễm DENV tiên phát, kháng thể IgM là globulin miễn dịch xuấthiện đầu tiên Các kháng thể này có thể được phát hiện ở 50% số người bệnhSXHD vào ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau khởi phát bệnh Nồng độ IgM đạt đỉnhkhoảng 2 tuần sau khởi phát rồi giảm dần tới mức không thể phát hiện sau 2 đến

3 tháng Vào cuối tuần đầu của bệnh, kháng thể IgG được phát hiện với hiệu giáthấp, sau đó tăng dần Kháng thể IgG có thể được phát hiện trong huyết thanhngười bệnh sau nhiều tháng và thậm chí có thể tồn tại suốt đời [22]

Trong nhiễm DENV thứ phát, globulin miễn dịch chiếm ưu thế là IgG,phát hiện ở mức cao, ngay ở giai đoạn cấp và tồn tại kéo dài Trong khi đó, nồng

độ IgM thấp hơn đáng kể so với nhiễm tiên phát và có thể không xác định đượctrong một số trường hợp [22]

Hình 1.7 Thời gian nhiễm virus Dengue và biểu hiện của các marker chẩn đoán

*Nguồn: Muller D A và cộng sự (2017) [ 49 ]

1.4.8 Rối loạn cơ bản trong sốt xuất huyết Dengue

Có hai rối loạn cơ bản trong sốt xuất huyết Dengue

- Tăng tính thấm thành mạch: khi cơ thể nhiễm DENV sẽ kích hoạt đápứng viêm hệ thống, phản ứng kháng nguyên - kháng thể - bổ thể và do virusDengue nhân lên trong bạch cầu đơn nhân dẫn đến: Giải phóng các chất trunggian vận mạch (anaphylatoxin, histamin, kinin, serotonin…); kích hoạt bổ thể,giải phóng thromboplastin tổ chức; tổn thương gan, làm giảm tổng hợp albuminmáu Sự tác động hỗn hợp của các yếu tố đã làm cho thành mạch tăng tính thấm,dịch từ trong lòng mạch thoát ra ngoài gian bào, hậu quả là giảm khối lượngmáu lưu hành, máu cô và dẫn đến sốc Bên cạnh đó, khi albumin máu giảm đãlàm giảm áp lực thủy tĩnh dẫn đến dịch sẽ thoát ra khỏi lòng mạch [50] Khi thểtích tuần hoàn mất từ 15% trở lên sẽ dẫn tới sốc giảm thể tích, giảm tưới máu

mô Nếu không được điều trị kịp thời, thì tình trạng thiếu máu tạng kéo dài sẽdẫn tới suy đa cơ quan [51]

- Rối loạn đông máu trong sốt xuất huyết Dengue là do: Thành mạch bị

tổn thương và tăng tính thấm; Tiểu cầu giảm do tăng kết tập vào các tổn thươngnội mô mao mạch máu, kết hợp với tuổi thọ của tiểu cầu ngắn lại do tác động

của độc tố virus Các yếu tố đông máu giảm do bị tiêu thụ vào quá trình tăngđông; tổn thương gan làm giảm tổng hợp các yếu tố đông máu; tủy xương bị ứcchế dẫn đến giảm sản xuất tiểu cầu [50]

Ở người bệnh SXHD, hai rối loạn trên tác động lẫn nhau dẫn đến các triệuchứng lâm sàng nặng của bệnh là sốc và xuất huyết

1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh sốt xuất huyết Dengue

Bệnh SXHD có biểu hiện lâm sàng đa dạng, diễn biến nhanh từ mức độnhẹ đến nặng Bệnh thường khởi phát đột ngột và diễn biến qua ba giai đoạn baogồm: giai đoạn sốt, giai đoạn nguy hiểm và giai đoạn hồi phục [22], [52]

Giai đoạn sốt

Trong trường hợp điển hình, người bệnh đột ngột sốt cao thường kèm vớicác dấu hiệu như mặt đỏ, ban trên da, đau mỏi toàn thân, đau cơ, đau khớp, đauđầu, nhức hai hốc mắt Xét nghiệm Hematocrit (Hct) bình thường Số lượng tiểucầu bình thường hoặc giảm dần, số lượng bạch cầu thường giảm

Hình 1.8 Các giai đoạn của bệnh SXHD

*Nguồn: Bộ Y tế (2019) [ 52 ]

Giai đoạn nguy hiểm

Giai đoạn này thường xảy ra ở các ngày thứ 3-7 của bệnh, NB có thể cònsốt hoặc đã giảm sốt NB có thể có biểu hiện: đau bụng nhiều, vật vã, lừ đừ, li bì,gan to, nôn ói Biểu hiện thoát huyết tương do tăng tính thấm thành mạch(thường kéo dài 24 - 48 giờ), tràn dịch màng phổi, mô kẽ, màng bụng, phù nề mimắt Nếu thoát huyết tương nhiều sẽ dẫn đến sốc với các biểu hiện vật vã, bứtrứt hoặc li bì, lạnh đầu chi, mạch nhanh nhỏ, huyết áp kẹt Xuất huyết niêm mạcnhư chảy máu chân răng, chảy máu mũi, nôn ra máu, đi ngoài (tiêu) phân đenhoặc máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu Một số trường hợp nặng có thể cóbiểu hiện suy tạng như tổn thương gan nặng/suy gan, thận, tim, phổi, não.Những biểu hiện nặng này có thể xảy ra ở người bệnh có hoặc không có sốc dothoát huyết tương

Cận lâm sàng: biểu hiện cô máu, số lượng tiểu cầu giảm, nồng độ enzymAST, ALT thường tăng, rối loạn đông máu, siêu âm hoặc X-quang có thể pháthiện tràn dịch màng bụng, màng phổi

Giai đoạn hồi phục

Thường vào ngày thứ 7-10 của bệnh Nếu người bệnh được điều trị tốttrong giai đoạn nguy hiểm sau 24-48 giờ thì bệnh sẽ chuyển sang giai đoạn hồiphục, dịch được hấp thu dần vào lòng mạch trong vòng 48-72 giờ Toàn trạngtốt lên, người bệnh thèm ăn, các triệu chứng tiêu hoá giảm xuống, huyết động

ổn định và tiểu được, một số người bệnh có thể ngứa toàn thân Phù phổi cấp,suy tim xung huyết do quá tải dịch có thể xảy ra ở giai đoạn này do hiệntượng tái hấp thu dịch và tiếp tục truyền dịch Cận lâm sàng: hematocrit trở

về bình thường hoặc có thể thấp hơn do hiện tượng pha loãng máu, số lượngtiểu cầu dần trở về bình thường, nồng độ enzym AST, ALT có khuynh hướnggiảm [22 ], [52 ]

1.6 Tổng quan về lncRNA

1.6.1 Khái niệm

Phần lớn bộ gen được phiên mã, nhưng chỉ có khoảng 2% bộ gen đượcphiên mã thành các mRNA sau đó được dịch mã thành protein, còn lại chủ yếuđược phiên mã dưới dạng RNA không mã hóa [53]

Long non coding RNA (lncRNA) là một họ các phân tử RNA không mãhóa protein (non-coding RNA), có chiều dài trên 200 nucleotide, có cấu trúctương tự như các mRNA nhưng không có khung đọc mở LncRNA tập trungchủ yếu trong nhân và tế bào chất của tế bào, chủ yếu được phiên mã bởi RNApolymerase II [53], [54] Sau khi được phiên mã, một số lncRNA tạo thành cấutrúc bậc hai/bậc ba và tương tác với protein, DNA hoặc RNA khác để thực hiệnchức năng điều hòa của mình [53]

1.6.2 Phân loại các lncRNA

1.6.2.1 Phân loại dựa vào vị trí của lncRNA so với gen mã hóa protein

Theo vị trí của gen mã hóa lncRNA, các lncRNA được phân loại thành

- Antisense lncRNA: bổ sung một phần hoặc hoàn toàn cho sản phẩmphiên mã ở mạch đối, được phiên mã từ sợi antisense (sợi DNA chiều 3’ đến5’- sử dụng làm khuôn trong quá trình phiên mã) của gen mã hóa protein [54], [55 ]

- Sense lncRNA: được phiên mã từ sợi sense (là sợi DNA chiều 5’ đến 3’)của các gen mã hóa protein [55]

- Enhancer lncRNA: được tạo ra từ vùng tăng cường của gen mã hóaprotein [54]

- Bidirectional lncRNA: có chung vùng khởi động với các gen mã hóaprotein nhưng hướng phiên mã ngược lại [54]

- Intronic lncRNA: được phiên mã hoàn toàn từ những vùng intron (trình

tự nucleotide không có chức năng mã hóa trong một gen) của gen [55]

- Intergenic lncRNA (lincRNA): được phiên mã độc lập từ các trình tự nằ

m giữa các gen mã hóa protein [54 ] Cho tới nay, nhiều intergenic lncRNA đãđược nghiên cứu, chức năng của chúng được biểu hiện thông qua nhiều cơchế khác nhau như: quy định phiên mã, kiểm soát dịch mã, điều chỉnh quátrình cắt nối, quy định sau phiên mã Trên thực tế, các lincRNA được tìmthấy tham gia các chức năng quan trọng trong nhiều quá trình ở mức độ tếbào, từ tính đa năng của tế bào gốc phôi đến tăng sinh tế bào và tiến triển củabệnh ung thư [55 ]

Hình 1.9 Phân loại lncRNA dựa vào vị trí của lncRNA so với gen mã hóa protein

*Nguồn: Liu Y và cộng sự (2021) [ 56 ].

1.6.2.2 Phân loại theo vị trí tác động trên DNA

Các lncRNA tập trung chủ yếu trong nhân và chất nhiễm sắc, nên cáclncRNA có tác động đáng kể đến trình tự của DNA. Một tỷ lệ lớn các lncRNA(42%) có liên quan đến quá trình phiên mã Do đó, lncRNA còn được phân loại

dựa trên tác động của chúng lên trình tự DNA: cis-lncRNAs (cis -izing lncRNAs) và trans lncRNA (trans -action lncRNAs) [55]

Hình 1.10 Phân loại theo vị trí tác động trên DNA

*Nguồn: Zhao Y và cộng sự [ 57 ]

A : cis-lncRNAs điều chỉnh sự biểu hiện của các trình tự gen nằm gần kề

B: trans lncRNA tác động nhắm đến các mục tiêu locus gen ở xa

1.6.2.3 Phân loại dựa trên cơ chế hoạt động của các lncRNA

Cơ chế hoạt động của các lncRNA được chia thành các nhóm chính baogồm điều hòa phiên mã, điều hòa sau phiên mã, tái cấu trúc chất nhiễm sắc vàmột số cơ chế hoạt động khác

Điều hòa phiên mã

Hình 1.11 Cơ chế điều hòa phiên mã của lncRNA

*Nguồn: Liu W và cộng sự (2017); Ma L và cộng sự (2013) [ 5 ], [ 55 ].

Hình A: lncRNA L1 liên kết với vùng khởi động của gen A từ đó sẽ ngăn chặn sự liên kết của các

yếu tố phiên mã, do đó ảnh hưởng đến sự khởi đầu phiên mã của gen A L2 ảnh hưởng đến quá trình phiên mã gen B từ xa thông qua tương tác với yếu tố phiên mã hoặc RNA polymerase L3 có chức năng biến đổi protein nhiễm sắc trong vùng lân cận của nó thông qua việc tuyển dụng phức hợp PrC2

Hình B: Ở hình trên và dưới cùng, lncRNA có thể đóng vai trò như mồi nhử hoặc như một

chất hướng dẫn để liên kết các yếu tố phiên mã hoặc ribonucleoprotein, thay đổi việc gắn vào các locus gen cụ thể, cuối cùng thúc đẩy quá trình phiên mã của gen Ở hình giữa, lncRNA cũng có thể đóng vai trò là tín hiệu để điều chỉnh biểu hiện gen

Có một số lượng lớn lncRNA điều chỉnh quá trình phiên mã gen thôngqua can thiệp vào quá trình phiên mã và tái cấu trúc nhiễm sắc thể Ngoài ra,lncRNA cũng đóng vai trò như là mồi nhử, tín hiệu hoặc dẫn đường trong quátrình phiên mã [5], [55].

Điều hòa sau phiên mã

Hình 1.12 Cơ chế điều hòa sau phiên mã của lncRNA

*Nguồn: Liu W và cộng sự (2017); Ma L và cộng sự (2013) [ 5 ], [ 55 ].

Hình A: L1, L2 và L3 đều ảnh hưởng đến quá trình cắt ghép gen L4 tương tác với các yếu

tố dịch mã để ức chế dịch mã L5 và L6 liên kết với miRNA, mRNA từ đó ngăn chặn sự liên kết của miRNA với gen mục tiêu L7 thúc đẩy sự thoái hóa của mRNA

Hình B: LncRNA hoạt động như “giá đỡ” miRNA bằng cách chia sẻ các yếu tố phản ứng

miRNA chung (MRE) và ức chế hoạt động đích của miRNA trên mRNA, dẫn đến ức chế phiên mã

Có hai cơ chế điều hòa sau phiên mã phổ biến mà lncRNA tham gia, đó là

cơ chế điều hòa cắt-nối và điều hòa dịch mã Các lncRNA ảnh hưởng đến quátrình cắt nối mRNA có thể hoạt động thông qua điều chỉnh hoặc liên kết với cácyếu tố cắt nối, hoặc kết hợp trực tiếp với trình tự mRNA để ngăn chặn quá trìnhcắt nối LncRNA tham gia điều hòa dịch mã thông qua liên kết với các yếu tốdịch mã, hoặc ribosom [55]

LncRNA còn có thể thúc đẩy sự thoái biến của mRNA Bên cạnh đónhiều lncRNA tương tác trực tiếp hoặc gián tiếp với miRNA để ổn định mRNAđích Một số antisense lncRNA có thể liên kết với mRNA để che đi các vị tríliên kết của miRNA từ đó làm ổn định mRNA [55]

Tái cấu trúc nhiễm sắc thể

Hình 1.13 Cơ chế tái tạo chất nhiễm sắc của lncRNA

*Nguồn: Liu W và cộng sự (2017) [ 5 ].

Methyl hóa DNA và các biến đổi histon có thể làm thay đổi trạng thái củachất nhiễm sắc, dẫn đến hoạt hóa hoặc ức chế quá trình phiên mã Trong quátrình này, lncRNA gắn với các thành phần tái cấu trúc chất nhiễm sắc đi đến cáclocus bộ gen cụ thể, lập trình lại trạng thái của chất nhiễm sắc thể để ức chế hoặchoạt hóa phiên mã. Hơn nữa, lncRNA cũng có thể điều chỉnh sự biểu hiện của cácgen lân cận, đặc biệt là trong quá trình di truyền [5]

Các cơ chế hoạt động khác của lncRNA

Hình 1.14 Cơ chế hoạt động khác của lncRNA

*Nguồn: Ma L và cộng sự (2013) [ 55 ].

Ngoài cơ chế điều hòa phiên mã và điều hòa sau phiên mã, lncRNA cóthể hoạt động thông qua các cơ chế khác như vận chuyển protein, sao chéptelomere, liên kết với Dicer (một loại enzym cắt) để ảnh hưởng đến RNA [55].

1.6.2.4 Phân loại dựa vào độ dài của lncRNA

Dựa vào độ dài, lncRNA có thể được chia thành các nhóm khác nhau:lncRNA nhỏ (chiều dài từ 200 đến 950 nucleotide), lncRNA trung bình (chiều dài

từ 950 đến 4.800 nucleotide), lncRNA lớn (chiều dài trên 4.800 nucleotide) [55]

1.6.3 Vai trò của các lncRNA trong nhiễm virus

Nhiễm virus dẫn đến những thay đổi lớn trong hệ thống phiên mã của cơthể Bên cạnh đó, thông qua nhiều loại protein và các con đường tín hiệu khácnhau sẽ kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch kháng lại sự xâm nhập củavirus Các dữ liệu gần đây đã chứng minh rằng lncRNA đóng vai trò quan trọngtrong tương tác giữa virus và cơ thể thông qua phản ứng kháng virus ở các mức

độ khác nhau hoặc bằng các hiệu ứng ngoại di truyền, phiên mã và sau phiên mã[6]

1.6.3.1 Biến đổi lncRNA tế bào trong nhiễm virus

Nhiễm virus gây ra sự thay đổi toàn diện trong hệ phiên mã của tế bào vậtchủ, bao gồm một số lượng lớn lncRNA Peng X và cộng sự đã xác định được

504 lncRNA ở chuột và nguyên bào sợi phôi chuột được điều chỉnh trong quátrình lây nhiễm virus SARS-CoV 2 Ngoài ra, các tác giả còn phát hiện ra rằngcác lncRNA bị điều hòa có liên quan đến tiên lượng bệnh và xác định rằng đápứng miễn dịch bẩm sinh có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của lncRNA [6], [58] Zhang và cộng sự đã tìm ra 25 lncRNA có liên quan đến ung thư biểu mô tế bàogan (HCC) do virus viêm gan C (HCV) gây ra Tương tự, Hu B và cộng sự đã

mô tả 149 lncRNA được biểu hiện khác nhau trong các tế bào thần kinh củangười khi bị nhiễm virus zika, cho thấy lncRNA có thể liên quan đến các bệnh

cụ thể và có thể đưa ra các liệu pháp điều trị đặc hiệu [6], [59] Gần đây, Meng J

và cộng sự đã nhận thấy có 8.541 lncRNA bị rối loạn điều hòa sau khi nhiễm

enterovirus 71 (EV71) trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi Hơn nữa, 10lncRNA đã được kiểm tra ở người bệnh nhiễm EV71 mức độ nhẹ, nặng vàngười khỏe mạnh cho thấy các lncRNA này có thể được sử dụng làm dấu ấnsinh học để phân biệt mức độ nhẹ và nặng từ đó góp phần hỗ trợ cho chẩn đoánsớm bệnh [6], [60].

Bảng 1.1 Vai trò của một số lncRNA tế bào vật chủ trong quá trình

nhiễm virus

hiện

Gen mã hóa lân cận

bào.

Thúc đẩy sự sao chép và độc lực của virus cúm A (IAV); ức chế quá trình phiên mã ban đầu của nhiều gen quan trọng kích thích bởi IFN (ISG), bao

não nhật bản và virus dại, HIV, cúm, herpes

MIR612

Nhân tế bào.

Thúc đầy sao chép của virus HIV; tạo điều kiện cho sự biểu hiện của các gen kháng virus bao gồm các cytokin như IL-8 thông qua việc kết hợp với NEAT1.

*Nguồn: Liu W và cộng sự (2017) [ 5 ].

1.6.3.2 Vai trò của lncRNA trong đáp ứng miễn dịch kháng virus

LncRNA và đáp ứng miễn dịch

Đáp ứng miễn dịch của cơ thể có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệchống lại các tác nhân virus, hoạt hóa yếu tố tiền viêm và phản ứng kháng virus.Các thụ thể nhận biết mầm bệnh (PRR), như thụ thể giống Toll (TLR) nhận biếtcác phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMP) khi bị nhiễm virus, từ đó khởiđộng các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Dựa trên giải trình tự RNA đã xác địnhđược nhiều lncRNA có liên quan đến đáp ứng miễn dịch kháng virus có liênquan đến TLR như lncRNA EGOT, LncRNA Cox2 [6], [61]

Interferon là cytokin gây viêm và yếu tố điều hòa miễn dịch hàng đầutrong đáp ứng miễn dịch kháng virus Kotzin J J đã chỉ ra rằng lncRNAMorrbid được hoạt hóa bởi thụ thể tế bào T (TCR) và IFN type I ở giai đoạn đầucủa nhiễm virus viêm màng não lympho cấp và mạn tính [6], [62] Một lncRNAkhác là lncRNA ISR (interferon‐stimulated lncRNA – lncRNA được kích thíchbởi interferon), hoạt hóa khi chuột bị nhiễm IAV (virus cúm A) bởi tín hiệuIFN Ức chế vùng khởi động của ISR sẽ thúc đẩy sự nhân lên của virus, từ đócho thấy ISR có vai trò thúc đẩy phản ứng kháng virus Do đó, tín hiệuinterferon rất quan trọng trong việc điều hòa các lncRNA có liên quan đến phảnứng kháng virus [6]

Yếu tố hoại tử khối u (TNF), một chất hoạt hóa NF-κB (nhân tố phiên mã cómặt trong hầu hết các tế bào và đóng vai trò quan trọng trong điều khiển hệ thốngmiễn dịch của cơ thể người [63]), là cytokin gây viêm quan trọng tham gia vào cơchế bảo vệ vật chủ kháng lại nhiễm virus Li Z và cộng sự đã chứng minh rằnglncRNA THRIL (linc1992), cần thiết cho việc biểu hiện TNFα [6], [64]

LncRNA điều chỉnh đáp ứng miễn dịch thông qua điều hòa phiên mã

LncRNA có thể thông qua cơ chế điều hòa phiên mã để điều chỉnh cácđáp ứng miễn dịch với virus và sự nhân lên của virus Đầu tiên, lncRNA có thểtuyển dụng các yếu tố phiên mã (TF- transcription factors) để hoạt hóa hoặc ứcchế quá trình phiên mã của các gen liên quan tới miễn dịch bẩm sinh như IFN và