Nghiên cứu mức độ biểu hiện của biến thể hmor 1a ở tế bào máu ngoại vi trên bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện điều trị mathadone thay thế

Bộ GI ÁO D ỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T É TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGVYẺN THỊ THẢO NGHIÊN cứư -MỨC Độ BIÊU HIỆN CỦA BIÉN THẾ hMOR-lA Ở TẾ BÀO MÁƯ NGOẠI • VI TRÊN BỆNH NHÂN NGHIỆN THUỐC • • CHÁT DẠNG • PHIỆN ĐIÈU TRỊ• METHADONE THAY TH É ♦ KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP cú NHÂN Y KHOA KHÓA 2019-2023 Hà Nội - 2023 -ãc ô4 ugc V Hl B GI O D C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T É TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYÊN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MỨC Độ BIÊU HIỆN CỦA BIÉN THÊ hMOR-lA Ớ TÉ BÀO -MÁU NGOẠI • VI TRÊN BỆNH NHÂN NGHIỆN CHÁT DẠNG THC PHIỆN ĐIÈƯ TRỊ METHADONE THAY THÉ Ngành tạo Kỳ thuật Xét nghiệm Y học 7720601 Mã ngành KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP cư NHẤN Y KHOA KHÓA 2019-2023 Người hưởng dàn khoa học THS TRỊNH THỊ PHƯƠNG DUNG THS NGƯYẺN QUỲNH GIAO Hà Nội - 2023 «4 ugc V Hl LỊI C ÁM ƠN Đẽ hốn thành khỏa luận em xin bãv tõ lông biết ưn tới ThS Nguyễn Quỳnh Giao vá ThS Trịnh Thị Phương Dung giáng viên Khoa Kĩ thuật Y học dà tận tinh chi báo truyền dụt cho em nhùng kiến thúc, kinh nghiệm dộng viên tạo điều kiện tốt cho em suốt trinh thực luận văn Em xm gưi lời cám ơn chân thành đen ThS Dào Xuân Dạt cổ vắn chuyên môn theo đỏi sãt hướng đàu truyền dạt cho em rat nhicu kiến thức, kĩ nảng trinh em lãm khóa luận Em xin dược Cam ơn TS Tạ Văn Thạo cãc anh chị nhân viên Trung tâm xẽt nghiệm Chcmedic dã chi bao nhiệt tinh vã tạo điều kiện giúp dờ em nhiều Em xin bày tó lịng biết cm sâu sắc ten Ban lãnh đạo cân Trung Tâm Kỉịm Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Ilọc - Trường Dại học Y Há Nội dà tạo diều kiện cho cm thục hành tnuig tâm giúp em lãm quen vời môi trường nghiên cữu khoa học trang thiết bị mây móc dại lũn xin gin lời Cam cm chân thành tói thầy cỏ khoa Kỳ thuật Y hục dã tận tình truyền dạt kiến thức vá ln tạo diều kiện cho em quã trinh học tập Khoa vổn kiến thức tiếp thu dược trinh học tập không chi làm tang cho em trinh nghiên cứu khỏa luận mã hành trang quý báu cho công việc Cua cm tương lai Cuối cúng em vò blot ơn bố mẹ người thân dà ung hộ bẽn Cạnh dồng hành em Cám ơn người bạn dã dộng viên, giúp dờ vá chỗ dựa tinh thần vững giúp em vượt qua khó khán suốt trinh học tập vá nghiên cứu Trường Đại hục Y Há NỘI Hả NỘI Tháng nãm 2023 Sinh viờn Nguyen Th Thỏo -ãc ^H ô4 ugc V Hl CỘNG HÒA XẢ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Dộc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Kinh gũi: Phòng Quán lý tạo Dại học - Trường Dại Học Y Hà Nội Hội dồng chẩm khóa luận tốt nghiệp Tỏi lã Nguyen Thị Thao Sinh viên Tơ 30 Lóp Y4XNYH - Khóa 117 Trường Đại học Y Hà Nội Tôi xin cam đoan: Đây lã khóa luận tơi trực tiếp thực hưởng dẫn cua Ths Nguyền Quỳnh Giao vá ThS Trịnh Thị Phương Đung Khoa Kĩ thuật Y Học Trường Đại học Y Hà Nội Cãc số liệu thòng tin nghiên cứu lã chinh xác trung thực khách quan chinh tòi thực vã thu thập Neu có bất ki chép tịi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội Tháng nám 2023 Ngi cam oan Nguyn Th Thỏo -ãc ^H ô4 ugc V Hl MỤC LỤC ĐẬT VẤN ĐÈ CHƯƠNG I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các khái niệm 1.1.1 Chắt dạng thuốc phiện 1.1.2 Nghiện chất dạng thuốc phiện 1.1.3 Methadone 1.2 Các quy định VC diều trị nghiện chất dạng thuốc phiện bang methadone 1.2.1 Các giai đoạn trinh điều trị 1.2.2 Quy định khám lâm sàng xẻt nghiệm 1.3 Tình hình điều trị methadone giới nước 1.3.1 Trẽn thề giới 1.3.2 Tại Việt Nam 1.4 Mửc độ biêu thụ thề p-opioid 1.4.1 Phàn tích mức độ biểu gen 1.4.2 Cấu tnìc thụ thê opioid 1.4.3 Các biến thê ghép nối cua thụ thè p-opioid vai trô 11 1.5 Các phưomg pháp phân tích mức độ biêu gen 13 CHƯƠNG ĐỎI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt’ 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Mầu nghiên cứu 17 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 17 2.1.3 Tiêu chuẩn loịũ trừ 18 2.2 Thời gian, địa diem nghiên cứu 19 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 19 2.2.2 Địa điếm nghiên củu 19 2.3 Phương pháp nghiên cúu 19 -ãc ô4 ugc V Hl 2.3.1 Thit kc nghiên cứu 19 2.3.2 Cờ mầu nghiên cứu 19 2.3.3 Hóa chắt thiết bị sư dụng nghiên cửu .19 2.3.4 Sơ đỗ nghiên cứu 21 2.3.5 Quy trinh nghiên cứu 22 2.4 Xữlý số liệu 29 CHƯƠNG 3: KÉT QƯÁ NGHIÊN cút' 30 3.1 Đặc điểm chung cua dổi tượng nghiên cứu 30 3.2 Kct quà tách chiết ARN 30 3.3 Kết chuẩn hỏa quy trinh Realtime-PCR 32 3.3.1 Kết qua điện di xác định nhiệt độ gẳn mồi 32 3.3.2 Kct qua phân lích melting curve xác định nồng độ 33 3.4 Kết qua realtime PCR đánh giá mức dộ biêu cua thụ thê p 35 CHƯƠNG BÀN LƯẬN 39 4.1 Đánh giá dặc diẽni chung cua đỗi lượng nghiên cứu 39 4.2 Đánh giá kết qua tách chiết /\RN 39 4.3 Bàn luận trinh chuẩn hóa quy trinh kì thuật Realtime-PCR 41 4.3.1 Ưu nhược diem cua Real-time PCR I bước bước 41 4.3.2 Ưu nhược diêm cùa phương pháp real-time PCR sir dụng sybe geen so với taqman prore 42 4.3.3 Lý chọn housekeeping gene beta-actin Lãm tliam chiếu 44 4.3.4 Melting curve 45 4.4 Đánh giá mức độ biêu cùa thụ the u - opioid bệnh nhân nghiện chắt dạng thuốc phiện điều trị methadone thay 46 KÉT LUẬN 48 KI ÉN NGHỊ 49 TÀI LIU THAM KHO PH LC -ãc ^H ô4 ugc V Hl DANH MỤC CHỮ* VIẾT TÁT DNA Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid mARN ARN thông tin MOR Muy opioid receptor PCR Polymerase Chain Reaction Realtime-PCR Phan ứng chuỗi polymerase thin gian thực qRT PCR Quantitative Reverse Transcription PCR CDTP Các chất dạng thuốc phiện CGN Chất gày nghiện CT Cycle Threshold ( Chu ki Ngường ) TNF-a Yếu tố hoại tir khối u IL6 Interleukin IFN-y Interferon gamma -•c «4 ugc V Hl H& DANH MỤC BÁNG Báng 2-1 Trùúi tự mồi thiết kể 22 Bàng 2-2 Thảnh phần phan ủng tồng hợp cDNA 24 Bang 2-3 Thành phần phan ứng PCR gen hMOR-1 A 25 Bàng 2-4 Chu ki nhiệt phan ủng PCR gen hMOR-1 A 25 Bang 2-5 Thành phần phán úng PCR gen nội chuẩn beta-actin 26 Bang 2-6 Chu ki nhiệt phàn úng PCR gen nội chuần beta-actin 26 Bâng 2-7 Thành phần phán úng chạy Melting curve 27 Băng 2-8 Chu trình nhiệt chạy Melling curve 27 Bang 2-9 Thành phần phản úng realtúne-PCR cua gen hMOR-1A 28 Bang 2-10 Thành phần phàn úng realtime-PCR cua gen nội chuẩn beta-actin 28 Bang 3-1 Đặc điềm chung cùa đối tượng nghiên cứu 31 Bâng 3-2 Kết quà tách chiết ARN 31 Bàng 3-3 Kết Ct đánh giá mức độ biểu cua biến the h.MOR-1 A 35 Báng 3-4 Mức độ biêu biến the hMOR-1 A liều điều trị 38 Bàng 4-1 so sánh s YBR Green TaqMan probe 43 Báng 4-2 So sánh nghiên cứu chúng tơi với tãc gia N.Vousooghi 47 -•c ^H «4 ugc V Hl DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1-1 Vị trí thụ thê p-opioid trước synap 10 Hình 1-2 Vị trí gen OPRM1 trẽn NST số .10 Hình 1-3 Sơ đỗ cấu trúc gen OPRM1 cua người vã nỗi thay 12 Hình 1-4 Sơ đổ cẩu trúc gen OPRM1 vã biến thê nỗi MOR-1A từ gen OPRM1 cua người 13 Hĩnh -5 Quá trinh tống họp cDNA 14 Hình 1-6 Nguyên lý cúa phân ứng real time PCR sư dụng SYBR Green 15 Hình 1-7 Biêu đồ đường biêu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát tử phân ửng nhận dược ánh sánh kích thích vào mỏi chu kỳ nhiệt 16 Hình 2*1 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hĩnh 2-2 Chu trinh nhiệt cùa phan úng realtime-PCR 29 Hình 3-6 Kết qua đo nồng độ ARN sau tách chiết cùa màu chửng C5 30 Hình 3-1 Ket qua điện di gen liMOR-lA 32 Hình 3-2 Kết qua diện di gen nội chuẩn beta-Actin 32 Hình 3-3 Kct qua phân tích melting curve cùa I1MOR- 1A ỡ mức nồng độ mồi 33 Hĩnh 3-4 Kết qua phân tích melting curve cua hMOR-lA nồng dụ 8X .33 Hĩnh 3-5 Kct qua phàn tích melting curve cua B-Actin nồng độ IX 10X 34 Hỉnh 3-7 Kct qua realtime-pcr màu bệnh B3 35 Hình 3-8 Kcl qua realtime màu chứng C6 35 Hình 3-9 Biêu dồ đánh giá mức độ biêu cua Ỉ1MOR-1A cua nhóm bệnh so với nhỏm chứng 37 Hình 4-1 Nguyên li cùa PCR I bước PCR bước 42 -ãc ô4 ugc V Hl -ãc ô4 ugc V Hl 40 pH Vi vy vic tách chiết RNA thao tãc RNA tách chiết cần phai hạn chế tối đa hoạt động cùa enzym náy Trong nghiên cứu náy chúng tơi thực tách chiết RN/X từ máu óng máu chống dông EDTA tiến hành thu thập tách chiết vòng giở sau lẩy Nghiên cúu cũa chủng tỏi sứ dụng kít tách chiết RNA từ máu toàn phần huyết tương cũa GeneAll Bộ kit tách chiết hoạt động dựa nguyên tắc hóa tan khác cùa cãc phân tư khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hỏa tan (phenol, chlorbnnnưóc) vã tinh RNA dựa trèn màng silica Tuy nhiên kit có nhược diêm định, Sừ dụng cột Iqc dê tách chiết tinh Sạch, màng silica cột lọc chứa lượng chất có tác dụng bắt giừ RNA định nên lượng RNA thu dược chi nằm khoang nhắt định không thu dược nồng độ cao phương pháp Trizol Tất cá RNA, sau tách chiết xác định nồng độ kiêm tra độ tinh băng cách độ quang trẽn máy Nanodrop 2000c Nguyên tầc cũa phương pháp dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng cùa chắt bước sóng định Nucleic acid hấp thụ mạnh ảnh sáng tứ ngoại bước sõng 260 1U11 nhờ có mặt cua base purine pyrimidine Giã trị mật độ quang bước sóng 260 nm cúa mầu cho phép xác định nồng độ cua RNA mầu Đê kiêm tra độ tinh cua sân phàm, người ta thêm giã trị OD bước sõng 280 nm buớc sóng protein có mức hấp thụ cao Tý lệ OD260/280 biêu thị mức độ protein lại dịch chiểt RNA gọi tinh ty lệ 1.8-2,0 Kết bang kết qua nồng dộ độ tinh cua cãc mầu nghiên cứu cua cho thấy tất Ca mầu RNA có nồng dộ độ tinh tốt -•c ^H «4 ugc V Hl 41 4.3 Bàn luận trinh chuắn hóa quy trinh kĩ thuật Realtime PCR 4.3.1 ưu nhược điểm cùa Real-time PCR / bước vờ bưởc RT-qPCR hước: Trong RT-qPCR bước, trinh tống họp cDNA qPCR thực binh phàn ủng đệm chung Ưu diêm chinh cùa phản ứng tiềt kiệm lượng mầu tnròng hợp mầu it, giam khã nâng xay lỗi pipet nhiễm chéo Điều làm cho bước trớ thành lira chọn đặc biệt hiệu đê định lượng lặp lại (các) gen giống nhau, đặc biệt cãc úng dụng thông lượng cao vả cài đặt chân đoán Chất lượng sổ lượng cua màu RNA nhùng cân nhác quan trọng dối với RTqPCR bước Khi RNA có chắt lưọng thấp chất ức chế diện không nhắt quân giừa mầu thi hiệu phan ứng cỏ the bị anh Inning mức độ khác nhau, lãm giam kha nâng so sánh giũa câc mầu RT-qPCR hai hước: Trong RT-qPCR hai bước, trinh tỏng hợp cDNA diễn trước mói tiến hành qPCR phản ứng khác Điều cho phép kiêm soát tỗt lum lượng mẫu cDNA dược sử dụng dê dịnh lượng qPCR Bởi chi phần cua sán phàm cDNA sử dụng bước qPCR cDNA lại cỏ thê dược lưu trữ de sứ dụng tương lai định lượng biếu cua nhiều gen từ mẫu RNA/cDNA Hạn chể cua RT-qPCR hai bước yêu cầu thèm bước mờ ống nhiều thao tác hút pipet him thởi gian thực lâu lum Điểu có thê dần đến kha nâng biển dơi nguy nhiêm bân cao dồng thời làm cho RT-qPCR hai bước it phù hợp với úng dụng thơng lượng cao.[25] «4 ugc V Hl 42 Hình 4-1 Nguyên li cùa PCR / bước PCR bước Nghiên cúu cua chủng tỏi sư dụng phương pháp RT-qPCR bước đê đề dàng kiềm soát quy trinh diễn cua phân ứng Vi nguy de nlũcni bẩn phai thao tác pipet nhiều nên đê phân ủng chinh xác nliẩt chúng tỏi đảm bao trinh lảm vô khuân vã hạn die tối da nguy anh hương den ket quã nghiên cứu 4.3.2 Ưu nhược điềm cùa phương pháp real-time PCR sư dụng sybe geen so vói taqman prore s YBR Green qPCR: Thuốc nhuộm huỳnh quang xen kỏ vào cãc chuỗi DNA sợi đỏi giai đoạn nhân bân Nõ loại chất đánh dầu chẽn vào cãc sựi dơi DNA có kha nàng phát ánh sáng huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích Việc tin hiệu vào cuối chu kỳ nhiệt sè cho phép ta xác định sỗ lượng DNA sợi kép có mật Nhược diêm cua xét nghiệm SYBR Green thuốc nhuộm liên kết với chuỗi DNA sựi kép Điều có nghía cỏ thê phát huỳnh quang phát từ San phẩm qPCR không dặc hiệu Taqman Probe: I đoạn DNA liên kết bố sung với trinh tự dậc hiệu trẽn gen cẩn kiểm tra Được đánh dấu bơi chắt phát huỳnh quang( quencher* «4 ugc V Hl 43 reporter), hoạt dộng dựa trẽn truyền lưọng cộng hưởng chất phát huỳnh quang khoang cách ngấn Bàng 4-1 so sành SYBR Green TaqMan probe [21] SYBR Green TaqMan Probe SYBR green thuốc lứiuộm liên Taqman mầu dò fluorogen kết DNA sợi dôi đưục sư dụng dế phát đậc hiệu cho gen mục tiêu, lích lùy cãc sản phẩm PCR tich lũy trong trinh PCR phan ứng PCR Phai dược thiết kể tnrớc đê phát Không cần thiết kế trước sán phẩm PCR cụ thè Phai dược tối ưu hóa cho phan ứng Khơng cần tối ưu hóa PCR Phát bắt kỳ sàn phâm PCR Đầu dò Taqman chi phát mã khơng có linh dặc hiệu cua trinh tự sân phẩm PCR theo cách cụ the cua trinh tự Độ đặc hiệu trung binh Dộ đặc hiệu cao Giá thành ré hon Giá thành dat lum Taqnian probe phán ứng real time có độ nhạy, độ đặc hiệu cao thường sứ dụng nghiên cứu đòi hoi độ chinh xác cao xác định kiểu gen SNP phát biến thề sổ lượng ban dột biến, phân tích protein SYBR Green quan trọng dồi với phân tích biêu gcn định lượng DNA phát mầm bệnh Trong nghiên cứu chủng tòi quan tâm den chu ki ngưởng mồi mẫu bệnh phàm, phân ứng real time PCR dược thục với mầu bệnh chứng riêng biệt, trinh tự mồi có độ đặc hiệu cao Vi chùng tịi sư dụng SYBR Green làm chất phát huỳnh quang Bên cạnh dú SYBR Green tit kim -ãc ^H ô4 ugc V Hl 44 VC mật chi phi so với Taqman probe Tuy nhiên độ dậc hiệu cùa phương pháp chưa dược cao vi chúng lỏi đà chuẩn lại nhiệt độ gắn mồi nồng độ song song với việc sứ dụng houseskeeping gcn làm tham chiểu 4.3.3 Lý đo chúng tòi chọn housekeeping gene beta-actin làm tham chiểu Housekeeping gene hay gụi gen tham chiếu, tập họp càc gcn dược biêu cẩu thành tề bào cằn thiết cho chức cua tể bào Những gen mã hóa cho protein tham gia vào trinh ban cùa tế bão chàng hạn diều hòa chu kỳ tế bào chép DNA chuyến hóa Trong cãc thi nghiệm khoa hục dời sống, housekeeping gene thưởng sứ dụng làm yếu tố kicm sốt nội chuẩn hóa dê dãn bao phân tích biêu gen chinh xác Mửc độ biểu ớn định cua chúng trẽn loại tể bào điều kiện thi nghiệm khác khiến chúng ướ thành gen tham chiếu lý lương để so sánh mức độ biêu cua gen quan tâm khác.[22] RT-PCR định lượng phương pháp hiệu qua đế phàn tích biểu gen Tuy nhiên RT- PCR có nhược diem định ánh hường đen việc giái thích kết quá: 1) Lượng RNA không bị phàn huy bang từ mồi mầu 2) hiệu qua cùa enzym phiên mà ngưực quán dần den lượng cDNA bang tất cã cãc mảu 3) Độ đặc hiệu thích hợp cua mồi 4) diện cua chất ức che mẫu Đề khấc phục nhừng nhược điểm kết qua thưởng chuẩn hóa thành biêu cua "gen giừ nhả” không thay dối mức độ biêu cùa chúng nhỏm mầu nhóm điều trị Sự biêu ôn dịnh cua gen giữ nhá phán úng RT-qPCR náo bat buộc vi nơ dóng vai trị ^H «4 ugc V Hl 45 quan trọng việc điền giai kết cuối Vi chùng tòi chọn ịieta- Actin lãm gene tham chiếu Gcn Pcta-Actin mà hóa protein cấu trúc ciia khung tế bào cỏ lè gen dược sư dụng rộng rài đế chuẩn hóa thi nghiệm nghiên cứu biêu gen pcla-Actin cho thấy tinh ón định cao vi protein Beta Actin thường khơng bị ánh hướng bời diều kiện thí nghiệm [23] 4.3.4 Melting curve Vi SYBR Green lã chất màu chẽn vào sợi dôi DNA xuất ồng phản úng sau cãc chu ki nhiệt kè ca sựi đôi DNA không phai khuếch dại dặc hiệu từ DNA đích, xuất dưỡng biêu dien khuếch đại phán úng không đặc hiệu 100% cho Sự cô mặt cua san phẩm khuếch dại từ DNA đích Đỏ chinh lã sán phẩm khuếch dại từ dimer primer, thường xay vào giai đoạn cuối cua chu kỹ nhiệt, má enzyme Taq polymerase hoạt dụng khơng cịn hiệu qua dục hiệu nừa (Dimer primer bắt cặp lần giừa mồi có nhùng vị tri trình tự mồi mang nhùng base bo sung dược vói nhau).[24] San phẩm khuếch dại từ dimer primer khác biệt với san phâm khuếch dại từ DNA đích chinh chiều dài từ dimer primer thi chiều dài sè không vượt 5O-55bp côn từ DNA đích thi chiều dài thường OObp Như dê cõ thê phân biệt dược dường biêu diễn khuếch dại cua phán úng lã cua san phâm khuếch dại đặc hiệu từ ban DNA dich hay từ dimer primer, phái dựa vào tinh chắt đặc trưng giúp phân biệt dược chiều dài cùa loại san phàm khuếch đại vã tinh chất đặc trưng dó chinh nhiệt dộ nóng chay( melting), lã nhiệt dộ làm cho sợi dôi DNA bị biến tinh 50%( tức lã có 50% số sợi dõi bị biến tính hồn toàn) Dê bict dược Tin cua sân phàm khuếch đại cỏ ồng phan ủng ta chạy chương trinh melt-curve Như vói phán tích melt curve phương phỏp real-time PCR s dng SYBR Green -ãc ^H ô4 ugc V Hl 46 ta phân biệt dược sán phẩm khuếch đại có ống phân ứng từ DNA đích hay lã từ dimer primer, mà đà khắc phục nhược diem không dậc hiệu cua chất phát huỳnh quang phát sản phẩm khuếch dại xuất ống phản ứng trinh luân nhiệt Từ dó cỏ the chọn múc nồng độ tối ưu cho phán ứng đê giam thiếu tối đa san phâm phụ đản đen sai số kết quà 4.4 Đánh giá mức dỏ biểu cùa thụ the p opioid bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện diều trị methadone thay the Dựa ket qua real time PCR còng thức Livak bước đầu dà xác định dược mức độ biêu biển thể hMOR-lA Đựa bang đánh giá mức độ biêu cùa hMOR-lA vã biêu dồ dánh giá mức độ biêu cua nhỏm bệnh so VỚI nhóm chứng, chúng tỏi thấy rang mức độ biêu cua biển thê thụ n opioid máu ngoại vi cua bệnh nhàn nghiện chất dạng thuốc phiện dang diều trị methadone cỏ cao hon mẫu máu ngoại vi cua nhóm người khoe mạnh (p