Nghiên cứu Định lượng Đồng thời apigenin, luteolin trong hương nhu tía (ocimum sanctum l ) bằng phương pháp hplc uv

Nghiên cứu Định lượng Đồng thời apigenin, luteolin trong hương nhu tía (ocimum sanctum l ) bằng phương pháp hplc uv

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI APIGENIN VÀ LUTEOLIN TRONG HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-UV

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI APIGENIN VÀ LUTEOLIN TRONG HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-UV

Chuyên ngành: Hoá phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Tài

PGS.TS Tạ Thị Thảo

Hà Nội – 2022

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em xin được cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Tạ Thị Thảo

và TS Nguyễn Văn Tài đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị đang công tác tại khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ nhiệt tình trong quá trình em thực hiện luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, tháng 11 năm 2022

Học viên

Nguyễn Phương Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH 4

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về dược liệu Hương nhu tía 3

1.1.1.Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Phân bố, sinh thái 4

1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.5.Công dụng và tác dụng sinh học của Hương nhu tía 10

1.2 Tổng quan về chất phân tích 10

1.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của Apigenin và Luteolin trong dược liệu 12

1.3.1 Các phương pháp phân tích thành phần hoá học của dược liệu 12

1.3.2 Phân tích thành phần hoá học các flavonoid của hương nhu tía 13

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 20

2.2.1 Chất chuẩn 20

2.2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn 20

2.2.3 Hoá chất 20

2.2.4 Thiết bị, dụng cụ 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 21

2.3.2 Phương pháp phân tích 22

2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích 23

2.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 23

2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích 24

2.5 Phân tích mẫu thực tế 28

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 29

3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu 29

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29

3.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 36

3.2.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 36

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm 38

3.2.3 Khảo sát lựa chọn thời gian và nhiệt độ chiết hồi lưu 39

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 42

3.3.1 Đánh giá độ đặc hiệu (tính chọn lọc) 42

3.3.2 Tính thích hợp hệ thống 43

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 44

3.3.4 Độ lặp lại trong ngày và khác ngày 45

3.3.5 Độ đúng 46

3.4 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ) 49

3.5 Phân tích mẫu thực tế 49

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây hương nhu tía Hình 1.2: Quả hương nhu tía 4

Hình 1.3: Lá hương nhu tía Hình 1.4: Hoa hương nhu tía 4

Hình 1.5 Khung sườn cơ bản của Flavonoid 6

Hình 2.1: Pic giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 25

Hình 3.1 Phổ UV – Vis của các chất 29

Hình 3.2 Pha động MeOH-H3PO4 0,2% (58:42) 31

Hình 3.3 Pha động MeOH-H3PO4 0,2% (55:45) 31

Hình 3.4 Pha động MeOH-H3PO4 0,43% (58:42) 32

Hình 3.5 Pha động MeOH-H3PO4 0,43% (55:45) 32

Hình 3.6 Đường chuẩn xác định Luteolin và Apigenin 36

Hình 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết EtOH/nước 37

Hình 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết MeOH/nước 37

Hình 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm 39

Hình 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 40

Hình 3.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết và số lần chiết 41

Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu đối với Luteolin và Apigenin 42

Hình 3.13 So sánh phổ UV của dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu chuẩn 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu phân tích 19

Sơ đồ 2.1 Quy trình dự kiến xử lý mẫu dược liệu hương nhu tía 22

Bảng 3.1 Các chương trình rửa giải đẳng dòng khảo sát 30

Bảng 3.2 Các thông số sắc ký của 4 hệ khảo sát 32

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột 34

Bảng 3.4 Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất 35

Bảng 3.5 Phương trình đường chuẩn của luteolin và apigenin 36

Bảng 3.6 Tính thích hợp của hệ thống đối với Luteolin và Apigenin 44

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp 45

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với phương pháp định lượng đồng thời Luteolin và Apigenin 45

Bảng 3.9 Các dự kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích 46

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 47

Bảng 3.11: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu dược liệu Hương nhu tía thêm chuẩn 48

Bảng 3.12 Các đại lượng thống kê 48

Bảng 3.13 Độ không đảm bảo đo đối với Luteolin và Apigenin bằng phương pháp HPLC-UV 49

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC

High performance liquid

HPTLC

High performance thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HPLC-MS

High performance liquid chromatography with mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ

HPLC-DAD

High performance liquid chromatography with diode array detector

Sắc ký lỏng ghép nối detector mảng diod

HPLC-UV

High performance liquid chromatography with ultraviolet detector

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector quang phổ tử ngoại

HPLC-ELSD

High performance liquid chromatography with evaporative light scattering detector

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi

MSwithin Standard deviations for winthin Phương sai trong cũng

một mẫu

reproducibility

Đội lệch chuẩn tái lặp tương đối

1

MỞ ĐẦU

Hương nhu tía có tên khoa học là (Ocimum sanctum L.), là một loại dược liệu

quen thuộc trong vườn của rất nhiều gia đình từ xưa đến nay và đã được ông cha ta sử dụng trong Y học cổ truyền từ hàng nghìn năm về trước Dược liệu này đã được sử dụng trong điều trị, phòng chống một số bệnh như: chữa cảm lạnh, đau bụng, đi ngoài, viêm phế quản, ho ở trẻ em, bệnh thận, viêm đường hô hấp, rối loạn kinh nguyệt, làm thuốc hạ sốt, giảm đau[12] Các nghiên cứu khoa học gần đây cũng đã chỉ ra được một

số tác dụng dược lý của Hương nhu tía như: chống ung thư, giảm trầm cảm, cải thiện trí nhớ, kháng khuẩn, điều trị bệnh tiểu đường và có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của virut gây bệnh HIV[43] Ngoài việc sử dụng trực tiếp như các bài thuốc cổ truyền, Hương nhu tía còn được sử dụng trong rất nhiều các sản phẩm thuốc từ dược liệu cũng như trong các thực phẩm chức năng Các nghiên cứu đã cho thấy trong Hương nhu tía chứa nhiều thành phần hoá học ở các bộ phận khác nhau của cây như: eugenol, cardinene, borneol, cubenol, axit linoleic, flavonoid, Trong các thành phần hoá học này, flavoniod là một nhóm hợp chất lớn chiếm thành phần chính trong cây,

có các đặc tính như chống oxy hoá, chống viêm, chống ung thư và chống lo âu, trầm cảm Luteolin và Apigenin là các flavonoid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ Hương nhu tía Một số phương pháp đã được phát triển để xác định Luteolin hoặc Apigenin trong huyết tương động vật hay trong thực phẩm, trong các mẫu sinh học và các loài thực vật khác [26] Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi, chưa có bài báocáo nào về việc xác định đồng thời Luteolin và Apigenin trong Hương nhu tía

Theo Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) xuất bản năm 2017 [4] có chuyên luận

về dược liệu Hương nhu tía Trong chuyên luận có quy định các chỉ tiêu đánh giá về tính đúng và chất lượng của dược liệu bao gồm mô tả, vi phẫu, soi bột, định tính, độ

ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axit hidrocloric, tạp chất, định lượng tinh dầu Tuy nhiên trong DĐVN V chưa có chỉ tiêu về định lượng hàm lượng hoạt chất (bao gồm Apigenin, Luteolin) theo các chất Apigenin và Luteolin Dược điển Mỹ (tập 4) xuất bản năm 2015 có chuyên luận về định tính và định lượng tritecpen, axit oleanolic

và axit ursolic nhưng chưa có chuyên luận về định lượng Apigenin và Luteolin

Để góp phần nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hương nhu tía, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng đồng thời Apigenin, Luteolin

2

trong Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng phương pháp HPLC-UV với các mục

tiêu sau:

- Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid gồm

Apigenin, Luteolin trong dược liệu Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng

phương pháp HPLC-UV

- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng hàm lượng hoạt chất trong các mẫu dược liệu Hương nhu tía thu hái tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu

3

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về dược liệu Hương nhu tía

Tên khoa học : Ocimum sanctum L (Ocimum tenuiflorum L.)

Tên thường gọi: hương nhu tía, é đỏ, é rừng hay é tía ( miền Trung và miền Nam) Tên nước ngoài: Monk’s basil, sacred basil, holy basil, tulsi, rough basil, mosquito

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hương nhu tía là loài cây nhỏ sống hàng năm hoặc lâu năm; có thể cao 1,5-2m Thân và cành hương nhu tía thường có màu đỏ tía, có lông quặp; lá có cuống dài, thuôn hình mác hay hình trứng, dài 1-5cm, mép khía răng cưa, hai mặt màu tím tía, có lông mềm

Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh, lá bắc nhỏ, hoa màu trắng hay tím tía, xếp thành từng vòng 6-8 hoa trên một cụm hoa, đài hoa dài 3-5 mm, thùy trên hình mắt chim, thùy dưới hình dùi dài hơn, những thùy bên rất ngắn; tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép; nhị 4 vượt ngoài tràng

Quả bế tư gần giống hình cầu, hơi dẹt có màu nâu nhạt hoặc đỏ đốm đen nhỏ nằm trong đài tồn tại

4

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Ocimum L có 8 loài, ở Việt Nam có 5 loài đều là cây trồng Hương nhu tía vốn

là cây cổ nhiệt đới Châu Á, được trồng rải rác ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị

Ở Việt Nam Hương nhu tía được trồng trong các vườn gia đình hoặc trong các

cơ sở chữa bệnh theo y học cổ truyền Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, nhiệt độ

hậu cận nhiệt đới và hơi lạnh, không thấy trồng

Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong

hè, đến cuối mùa thu hay đầu đông thì tàn lụi Cây ra hoa quả nhiều Qủa chín tự mở,

5

1.1.4 Thành phần hóa học

Đã có nhiều các nghiên cứu trước đây về phân lập các hợp chất phenolic, tinh dầu, flavonoid, terpenoid trong Hương nhu tía Trong số các thành phần hóa học này, flavonoid là thành phần chính có trong thực vật, có tác dụng chống lo âu, trầm cảm Một số phương pháp đã được phát triển để xác định Luteolin, Apigenin trong thực vật, mẫu sinh học; tuy nhiên chưa có báo cáo về việc xác định đồng thời hai hoạt chất này trong hương nhu tía

Các nghiên cứu trong nước

Theo Đỗ Tất Lợi, trong hương nhu tía có chứa tinh dầu và một số chất khác chưa rõ (Hương nhu trắng và hương nhu tía đều chứa tinh dầu nhưng tỷ lệ tinh dầu trong hương nhu trắng thường cao hơn (0,6-0,8 %) Hương nhu tía được trồng ở Việt Nam chứa α-pinen, sapinen, β-pinen, mycren, 1-8 cineol, linalol, camphor, borneol, lynalyl acetat, terpinen-4-ol, α-terpineol, geraniol, cetral, eugenol, methyl eugenol và β-carophylen, α- humulen, methyl iso eugenol, β- elemen, δ-elemen, sesquiterpen Các thành phần chính là eugenol (trên 70%), methyl eugenol (trên 12%) và β- carophylen Các thành phần này giống như thành phần của tinh dầu trong hương nhu tía được trồng

ở Ấn Độ [3],[5],[35]

Ngoài tinh dầu, hương nhu tía chứa các triterpenoid như acid oleanolic, acid ursolic,…; các acid hữu cơ như acid caffeic (0,81%), acid rosmarinic,…; các flavonoid như apigenin(0,18%), luteolin (0,16%), cirsilineol, crirsimartin, isothymosin, apigenin; apigenin – 7 – glucoside; luteolin; luteolin – 7 – glucoside; orientin, vicenin …[16], [32], [41], [46] Người ta đã xác định được 4 hợp chất

axit ursolic (0,252-0,478%) và axit oleanolic (0,174 và 0,218%) Hạt chứa các loại tính dầu: stearic (3,19%), oleic (13,82%), linoleic (52,23%),… Ngoài ra, sự thay đổi trong thành phần hoá học có thể do thổ nhưỡng và điều kiện địa lý khác nhau

Phần trên mặt đất của hương nhu tía có nhiều tinh dầu, theo quy định phải có

ít nhất 0,5% [4] ở cây khô và 0,2-0,3% ở cây tươi [6] Hàm lượng flavonoid toàn

6

Các nghiên cứu nước ngoài

Các nghiên cứu đã tìm ra một số hợp chất trong hương nhu tía và được thống

kê thành các nhóm chính như sau:

Hình 1.5 Khung sườn cơ bản của Flavonoid

Flavonoid mang một hoặc nhiều nhóm -OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3,4,5 trên nhân B

Một số flavonoid đã được phân lập từ hương nhu tía: [17],[28],[44]

Nhóm các hợp chất lignan: được tạo thành khi hai đơn vị phenylpropanoid được nối lại với nhau bằng một nối cacbon-cacbon

Các hợp chất này do sự β-oxi hóa dẫn đến cắt ngắn mạch nhánh của cinamat

Axit ursolic và axit oleanolic là thành phần chính và quan trọng có hàm

lượng cao trong Hương nhu tía thuộc nhóm saponin triterpenoid Năm 2018, Silva

và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng axit ursolic trong lá của 8 loài thuộc

10

chi Ocimum ở phía Bắc Brazil bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu đã chỉ ra hàm

lượng axit ursolic trong lá của Ocimum sanctum L là cao nhất (2,02%) [30]

CÁC STEROL

1.1.5.Công dụng và tác dụng sinh học của Hương nhu tía

Theo Đông y, hương nhu tía có vị cay, hơi ôn, vào hai kinh phế và vị Có tác dụng làm ra mồ hôi, chữa cảm mạo, giảm sốt, lợi thấp, hành thuỷ, dùng chữa đau đầu, đau bụng, nôn mửa, thuỷ thủng, đi ngoài lỏng, chảy máu cam [8]

Y học hiện đại có rất nhiều công trình nghiên cứu tác dụng sinh học của hương nhu tía và chỉ ra vai trò của hương nhu tía trong phòng chống rất nhiều bệnh như: suy giảm trí nhớ [45], chống oxi hoá [34], chống trầm cảm [39] ,[27], [20], chống ung thư [18], [22], [24], hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [47], kháng khuẩn [33], bảo vệ gan [38], kháng ung thư [23], chống phóng xạ [36], [37]

1.2 Tổng quan về chất phân tích

Luteolin và Apigenin là hai hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, ở dạng rắn có màu vàng đặc trưng

LUTEOLIN [21]

11

- Tên thường gọi: Luteolol, digitoflavone, luteolin, dihydroxy-4-chromenone

- Tên thường gọi: 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-H-1-benzopyran-4-on, 4’,5,7-trihydroxyflavon, 2-(p-hydroxyphenyl)-5,7-dihydroxychromon

- Nhiệt độ nóng chảy: 345℃

- Apigenin hòa tan trong DMSO và dung dịch KOH 1M với độ tan lần lượt là 27 mg/ml và 50 mg/l, không tan trong nước, tan vừa phải trong rượu nóng

12

- LogK = 2,87

- Hấp thụ bước sóng UV tối đa: 340nm

1.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của Apigenin

và Luteolin trong dược liệu

1.3.1 Các phương pháp phân tích thành phần hoá học của dược liệu

Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp Thông thường, trong dược liệu không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau mà thường chứa một nhóm các chất có tính chất tương đối nhau (flavonoid, terpenoid, nhóm các dẫn xuất stilben, ) Các chất trong cùng một nhóm chất đều giống nhau

về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác nhau, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật lý, tính chất hoá học Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ (UV-Vis, IR, ) để phân tích định lượng một thành phần trong dược liệu gặp nhiều khó khăn và hầu như không thể thực hiện được

Sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại Khác với các phép định lượng hoá học, các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích mẫu dược liệu Người ta có thể định lượng một hay đồng thời nhiều chất trong một lần phân tích nếu chọn được điều kiện thích hợp Các phương pháp sắc ký thường sử dụng là: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC), sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2], sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS/MS) Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên phạm vi phân tích rộng hơn nhiều so với phương pháp sắc ký khí (thường sử dụng để phân tích các đối tượng dễ bay hơi, các hoá chất bảo vệ thực vật) Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, Trong lĩnh vực dược liệu, HPLC thường được sử dụng để định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp

1.3.2 Phân tích thành phần hoá học các flavonoid của hương nhu tía

Hiện nay, có khá nhiều kỹ thuật HPLC đã được dùng để phân tích các chất thuộc nhóm flavonoid như: HPLC-ELSD, HPLC-ESI-MS/MS, Các kỹ thuật này đều là kỹ thuật hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể được sử dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất Kỹ thuật HPLC- UV khá tương đồng với HPLC-DAD, được trang bị hầu hết ở các phòng thí nghiệm và các cơ sở sản xuất, kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm trên vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp này để phân tích thành phần hoá học trong hương nhu tía

Dược điển được coi là tài liệu chính thống thường được các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất sử dụng để kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu cũng như nguyên liệu làm thuốc ở Việt Nam cũng như các quốc gia khác trên toàn thế giới

Ở Việt Nam, việc kiểm nghiệm chất lượng hương nhu tía được trình bày trong Dược điển Việt Nam V với các chỉ tiêu như: mô tả, soi bột, vi phẫu, định tính, định lượng tinh dầu, độ ẩm, tạp chất và độ tro Tuy nhiên, các chỉ tiêu này không chỉ

ra được chính xác chất lượng dược liệu và không có chỉ tiêu định lượng hoạt chất để kiểm tra đánh giá chất lượng dược liệu hương nhu tía

14

Một số nghiên cứu đã thực hiện về Hương nhu tía và định lương Apigenin, Luteolin trong dược liệu:

xác định các phenolic

trong hương nhu tía

C18 (250mm×4,6mm, 5µm) + Pha động: Kênh A: Acetonitril;

Kênh B: MeOH Chế độ gradient + Bước sóng phát hiện: 280 nm và

rosmarinic, axit ursolic , axit oleanolic

+ Pha tĩnh: Cột pha đảo

(250mm×4,6mm, 5µm)

(0,1%); Kênh B: ACN Chế độ gradient

+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và

340 nm

+ Tốc độ dòng: 1ml/phút

apigenin trong nước

tiểu người sau khi

uống viên chiết xuất

trong dịch chiết cây

ODS3 (250mm×4,6mm, 5µm)

chuột sau khi uống

siêu âm dựa trên dung

dịch nước chứa ion kết

hợp với định lượng

HPLC

OptimaPak C18 (250mm×4,6mm, 5µm)

v/v) + Bước sóng phát hiện: 345nm

+ Tốc độ dòng: 0,5ml/ phút

18

Đến thời điểm hiện tại, cả dược điển Việt Nam hay dược điển của các nước khác trên thế giới đều chỉ đưa ra phương pháp phân tích định tính, định lượng các hoạt chất trong cây như tritecpten, tinh dầu mà chưa có nghiên cứu nào về định lượng đồng thời hai flavonoid là Luteolin và Apigenin trong hương nhu tía vì vậy chúng tôi đã tìm các điều kiện sắc kí của hai hoạt chất trên ở các đối tượng khác nhau nhằm tìm ra phương pháp tối ưu nhất

Kết luận phần tổng quan

Hương nhu tía là một loại dược liệu phổ biến, được trồng và sử dụng rộng rãi làm cây thuốc do có nhiều tác dụng tốt đối với con người, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hoạt chất chính có trong hương nhu tía có tác dụng hỗ trợ điều trị trầm cảm, ung thư, cải thiện trí nhớ Hiện nay ở Việt Nam vẫn thường đánh giá chất lượng dược liệu hương nhu tía theo DĐVN V, tuy nhiên chuyên luận này mới chỉ đưa ra được một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu như mô tả, soi bột, vi mẫu, định tính, định lượng tinh dầu chứ chưa có chỉ tiêu định lượng hàm lượng các hoạt chất chính để đánh giá chất lượng dược liệu

Đến thời điểm hiện tại cũng chưa có nhiều công bố thực hiện về đánh giá chất lượng dược liệu hương nhu tía được trồng và thu hái tại Việt Nam cụ thể là các hoạt chất chính có trong dược liệu này Vì vậy, để góp phần tiêu chuẩn hóa dược

liệu hương nhu tía, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng

đồng thời Apigenin và Luteolin trong hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng phương pháp HPLC-UV với các nội dung dự kiến thực hiện bao gồm:

+ Khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu và định lượng đồng thời hai hợp chất Luteolin và Apigenin trong hương nhu tía bằng phương pháp HPLC-UV

+ Đánh giá hàm lượng Luteolin và Apigenin trong các mẫu hương nhu tía khác nhau được trồng ở Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu nhằm cung cấp cơ sở, số liệu thực nghiệm cho công tác kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu hương nhu tía

19

CHƯƠNG 2 – THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hầu hết các mẫu Hương nhu tía đều có thành phần Luteolin và Apigenin với hàm lượng khác nhau Trong đó hàm lượng Luteolin nhiều hơn Apigenin Do các mẫu đều có cả hai thành phần Luteolin và Apigenin nhưng với hàm lượng khác nhau nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn mẫu dược liệu Hương nhu tía được lấy hạt ở Bắc Ninh (HNT 01) và được gieo trồng ở Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu để tiến hành khảo sát nhằm xây dựng phương pháp phân tích

Bên cạnh đó, các mẫu thử Hương nhu tía (Ocimum sanctum) được lấy hạt ở các

vùng khác nhau và được gieo trồng ở Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội (TTHN) Mẫu được lấy là bộ phận thân và lá của cây Hương nhu tía đã trồng được 1 năm Mẫu sau khi thu hái được phơi và sấy ở 50℃ đến khô và chỉ giữ lại phần lá rồi bảo quản trong túi zip kín Các mẫu nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn của DĐVN V Mẫu được lưu tại khoa Hoá Thực vật, Viện Dược liệu Mỗi mẫu của một cây được lấy đồng đều một lượng khoảng 30g, xay thành bột mịn dùng cho việc nghiên cứu Mẫu được đo độ ẩm bằng cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA-45)

Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu phân tích

20

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

2.2.1 Chất chuẩn

- Chất chuẩn Luteolin của hãng Biopurify Phytochemicals Ltd - Trung Quốc, độ

- Chất chuẩn Apigenin của hãng Biopurify Phytochemicals Ltd - Trung Quốc, độ

2.2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn

chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn Luteolin, hoà tan và định mức trong 10,00 ml MeOH Các dung dịch chuẩn Luteolin có nồng độ nhỏ hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong methanol

chuẩn bị tương tự dung dịch chuẩn gốc Luteolin

thành dãy dụng dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ mỗi chất từ 5,0 - 250 µg/ml trong dung môi methanol

Nồng độ thực tế của dung dịch chuẩn gốc (tính đến độ tinh khiết P%) sẽ sử dụng trong công thức tính hàm lượng của chất

2.2.3 Hoá chất

- Các dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của hãng Fisher

hai bình định mức 1000ml, bổ sung 700ml nước cất, lắc đều sau đó bổ sung

và số liệu trên máy HPLC

- Cột pha đảo Cosmosil C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ Cosmosil C18 (20 mm x 4,0 mm, 5 µm)

- Cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thuỵ Sĩ), độ chính xác 0,0001g Cân kỹ thuật

- Cân các định độ ẩm (Sartorius, MA-45)

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Power sonic 405

- HPLC điều chế (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: bơm LC-20AP, cột sắc ký HS

xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC

- Bếp cách thủy (Memmert, WB -14 LO)

- Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

- Máy đo pH MP220K của hãng Toledo với điện cực thủy tinh và điện cực calomen bão hòa và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH (Merck)

Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau

đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105℃ trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu

Theo những tính chất đã biết của các flavonoid, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH… Công thức cấu tạo của Luteolin và Apigenin có chứa nhóm OH, vì vậy việc sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ/nước sẽ chiết Luteolin và Apigenin ra khỏi mẫu thực vật tốt hơn Tham khảo các tài liệu ở mục 1.2 và so sánh

Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV-Vis, vì vậy detector UV-Vis thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu Cột

2,0 g mẫu

Phân tích HPLC-UV

Lọc qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm

Lọc mẫu vào bình định mức 50 ml Chiết hồi lưu trong 1 giờ

40ml EtOH/nước 70:30 (v/v)

23

tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình Để chọn được một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm như: độ phân cực của chất phân tích, môi trường pha chất phân tích ra sao thì mới chọn được pha tĩnh phù hợp Chất phân tích được chọn

là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm flavonoid Do các chất phân tích đều là chất ít phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống như chất phân tích

Vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC sử dụng để phân tích định lượng hai flavonoid trong hương nhu tía

Các điều kiện sắc ký được tóm tắt như sau:

2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích

2.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải đẳng dòng với pha động bao gồm: MeOH (kênh B) và nước chứa axit photphoric (kênh A) theo các tỉ lệ và nồng độ axit khác nhau

Thể tích tiêm mẫu vào cột cũng được khảo sát trong khoảng từ 5 µl đến 30 µl Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát sẽ được đánh giá, so sánh về thời

24

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp với dung dịch mẫu thử trên thiết

bị HPLC để khảo sát các điều kiện thích hợp cho phép sắc ký

2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích

2.4.2.1 Độ chọn lọc, tính đặc hiệu của phương pháp

Độ chọn lọc của phương pháp phân tích là đại lượng đặc trưng cho mức độ ảnh hưởng của các thành phần đi cùng trong nền mẫu đến phép phân tích chất đó đó như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Đối với phương pháp HPLC thì độ chọn lọc được thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn; pic của chất phân tích phải tách hoàn toàn với các pic tạp, trên sắc kí đồ của mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn thì phương pháp được kết luận là có độ chọn lọc tốt

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp Luteolin và Apigenin nồng độ 100ppm, dung dịch mẫu thử, mẫu trắng MeOH với chương trình đã lựa chọn sau đó ghi lại thông số thời gian lưu và diện tích pic

Thời gian lưu của pic dung dịch chuẩn hỗn hợp Luteolin và Apigenin, dung dịch mẫu thử phải tương đương nhau, pic trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu Hệ số chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải lớn hơn 0,99

2.4.2.2 Tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của cả hệ thống phân tích bởi các yếu tối như máy móc, thiết bị

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ đã chuẩn

bị ở mục 2.4.2.1 Ghi lại giá trị thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

2.4.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Khoảng tuyển tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích Tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị thuộc tính

25

giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn

Xây dựng phương trình đường chuẩn trên phần mềm minitab 16, tử đó tìm ra

quy không mắc sai số hệ thống [10]

2.4.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3 [13]

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng

so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10

N: Nhiễu đường nền

Hình 2.1: Pic giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký Xác định tỉ lệ S/N

26

2.4.2.5 Độ chụm

- Thông thường, quá trình đánh giá được thực hiện trong khoảng thời gian khác nhau hoặc cho các kĩ thuật viên khác nhau cùng thực hiện một phép thử (đổi tay kỹ thuật viên) Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép, chúng tôi lựa chọn phương pháp đánh giá độ chụm trong khoảng thời gian khác nhau Kết quả phân tích được đánh giá dựa trên kết quả phân tích của cùng 1

kỹ thuật viên trên cùng một phép thử và được thực hiện trong 2 ngày khác nhau

- Cách tiến hành: Thực hiện 12 thí nghiệm trên cùng một mẫu phân tích trong

2 ngày khác nhau với quy trình xử lý mẫu như nhau, trên cùng một thiết bị với điều kiện thực nghiệm Các kết quả thu được dùng làm giá trị đánh giá về

độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (%RSDr) và độ lệch chuẩn tái lặp tương đối

- Phương sai giữa các mẫu (between-sample estimation of variance):

- Phương sai tái lặp :

- Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối:

- Độ thu hồi (hiệu suất thu hồi): được tính bằng tỷ lệ phần trăm lượng chất chuẩn thêm vào mẫu dược liệu và giá trị hàm lượng tìm lại được tính toán từ kết quả đo

Trong đó:

R (%): Độ thu hồi

Theo AOAC, mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích <0,1%, độ thu hồi yêu cầu nằm trong khoảng 90% -107% [13]

2.4.2.7 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ)

ĐKĐBĐ: Thể hiện sự tin cậy của các giá trị phân tích được của các chất phân tích ĐKĐBĐ sẽ được thu thập từ tất cả các nguồn có thể gây sai số cho phép đo( lấy mẫu, xử lí mẫu, quá trình phân tích mẫu, )

Cách tiến hành: Đối với các phép phân tích phức tạp, việc tính toán và ước lượng ĐKĐBĐ dựa trên dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trong phòng thí nghiệm Cụ thể là dựa trên tính toán về độ chụm và độ đúng

U S1 =S 1 /(N) 1/2

28

U S2 =S 2 /(N) 1/2

- Ước lượng ĐKĐBĐ liên quan đến độ đúng:

U R (%)= t α,k xCV R (%); t 0,05;2 =4,303

CV R (%) = (S D /H tb ) x 100%

U R = U R (%) x C tb /100

2.5 Phân tích mẫu thực tế

Mẫu lá Hương nhu tía sau khi được chiết tách thu được dung dịch chạy sắc

ký HPLC Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình Hàm lượng (%) của Luteolin và Apigenin tính theo dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức sau:

Trong đó:

X(%): Hàm lượng của Luteolin và Apigenin tương ứng

C: Nồng độ Luteolin và Apigenin tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml)

V: Thể tích pha mẫu thử trước khi tiêm vào hệ thống HPLC (ml)

P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

m: Khối lượng mẫu thử (mg)

B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

29

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện đo của hệ thống sắc ký

3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu

Để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của Luteolin và Apigenin chúng tôi tiến hành xác định phổ UV-Vis của từng dung dịch chuẩn đơn Luteolin và Apigenin nồng độ 100 ppm trên thiết bị HPLC có detector quét phổ (UV-Vis)

Hình 3.1 biểu diễn phổ UV-Vis của từng chất

Hình 3.1 Phổ UV – Vis của các chất

Kết quả cho thấy, phổ UV-Vis của Luteolin và Apigenin có đỉnh hấp thụ cực đại gần nhau nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn bước sóng 347 nm để định lượng đồng thời Luteolin và Apigenin trong Hương nhu tía

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh

Ở các nghiên cứu trước đây, các tác giả hầu hết lựa chọn cột pha đảo HPLC để tiến hành định lượng các hoạt chất chính trong Hương nhu tía Trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi lựa chọn cột Cosmosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) để định lượng Luteolin và Apigenin trong dược liệu này

RP-3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động

Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả tách chất Pha động có thể ảnh hưởng tới những vấn đề sau trong phép sắc ký:

30

+ Độ chọn lọc của hệ pha + Thời gian lưu trữ của chất phân tích + Hiệu lực cột tách

+ Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh + Độ rộng của pic sắc ký

Để tiến hành khảo sát pha động, khảo sát theo tài liệu [15], sử dụng thành

chuẩn hỗn hợp có nồng độ mỗi chất khoảng 50 µg/ml và dung dịch mẫu thử HNT

01 để đánh giá hiệu quả tách hai chất Apigenin và Luteolin ra khỏi nền mẫu Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị với quy trình như sau:

Cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu Hương nhu tía bằng cân phân tích (độ chính xác 0,0001 gam), chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml có nút nhám, thêm 40,0 ml dung môi EtOH/nước 70:30 (v/v), thấm ẩm dược liệu trong 10 phút Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lưu đã đặt ở nhiệt độ 70℃ Tiến hành chiết hồi lưu trong 1 h Để nguội bình cầu về nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết vào bình định mức 50,0 ml và định mức đến vạch bằng MeOH Lọc dịch chiết qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu được dung dịch tiến hành sắc kí HPLC với điều kiện ở mục 2.3.2 với lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Bảng 3.1 Các chương trình rửa giải đẳng dòng khảo sát

Thời gian

(phút)

MeOH (%, v/v)

H 3 PO 4 0,2%

(%, v/v)

Thời gian (phút)

MeOH (%, v/v)

H 3 PO 4 0,2% (%, v/v)

H 3 PO 4 0,43%

(%, v/v)

Thời gian (phút)

MeOH (%, v/v)

H 3 PO 4 0,43% (%, v/v)

31

Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [27], [15], [49], các tác giả thường

sử dụng hệ pha động MeOH-nước (chứa axit photphoric) để tiến hành định lượng các flavonoid trong Hương nhu tía Khi đưa thêm axit vào pha động thì pic của chất phân tích sẽ thu gọn chân và cân đối hơn Thời gian lưu của từng chất được xác định bằng cách tiêm lần lượt từng chuẩn đơn vào hệ thống HPLC Thứ tự rửa giải từng chất là Luteolin → Apigenin Sau đó tiêm lần lượt dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng

độ 50ppm và dung dịch mẫu thử để xác định khả năng tách của chất khỏi nhau cũng như khỏi tạp chất khác trong nền mẫu Kết quả thu được như hình 3.2-3.5 Sắc ký đồ hẫn hợp thử và dung dịch chuẩn ở các thành phần khác nhau thu được ở hình 3.2-3.5