Nghiên cứu xác Định Đồng thời ketamin và norketamin trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

Nghiên cứu xác Định Đồng thời ketamin và norketamin trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI KETAMIN

VÀ NORKETAMIN TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

- HD 1: TS Phạm Quốc Chinh

- HD 2: PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai

Hà Nội - 2022

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới TS Phạm Quốc Chinh

và PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai Thầy, cô đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị giám định viên tại Khoa Độc chất, Viện Pháp y Quốc gia đã luôn quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

đề tài tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống độc – Bệnh viên Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các học viên lớp cao học hóa K31 của Bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Học viên

Phạm Thị Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chapter 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ketamin 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 4

1.1.2 Dược lực học 5

1.1.3 Dược động học 6

1.2 Tổng quan về Norketamin 8

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu sinh học chứa KET và NK 9

1.3.1 Chiết lỏng – lỏng 9

1.3.2 Chiết pha rắn 10

1.4 Các phương pháp xác định KET và NK trong dịch sinh học 12

1.4.1 Phương pháp điện di mao quản 12

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng 13

1.4.3 Phương pháp sắc ký khí 15

Chapter 2 Chương 2: THỰC NGHIỆM 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 21

2.2.1 Chất chuẩn 21

2.2.2 Hóa chất 22

2.2.3 Thiết bị dụng cụ 22

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Nghiên cứu thiết lập chương trình GC-MS 24

2.3.2 Khảo sát phương pháp chiết mẫu 25

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 26

2.3.4 Phân tích KET và NK trong mẫu máu, nước tiểu của người nghi ngờ sử dụng ma túy 29

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chapter 3 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng KET và NK bằng GC-MS 30

3.1.1 Thiết lập chương trình GC-MS 30

3.1.2 Khảo sát khối phổ của KET, NK và KET-d4 30

3.1.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ sắc ký 32

3.2 Khảo sát phương pháp chiết mẫu 35

3.3 Tổng hợp quy trình chiết xuất, phân tích KET và NK bằng GC-MS 39

3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 41

3.4.1 Độ phù hợp của hệ thống GC-MS 41

3.4.2 Độ đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp GC-MS 42

3.4.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 46

3.4.4 Xây dựng đường chuẩn 47

3.4.5 Độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại) 49

3.4.6 Hiệu suất chiết 51

3.4.7 Độ ổn định hoạt chất trong nền mẫu máu và nước tiểu 52

3.5 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích KET và NK trong mẫu máu, nước tiểu người nghi ngờ sử dụng ma túy 53

Chapter 4 KẾT LUẬN 57

Chapter 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Chapter 7 PHỤ LỤC 65

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu xác định KET và NK trong mẫu dịch sinh học

bằng sắc ký khí 19

Bảng 3.1 Thời gian lưu và mảnh phổ ion của các chất nghiên cứu 31

Bảng 3.2 Khảo sát chương trình nhiệt độ 33

Bảng 3.3 Độ thu hồi của chất phân tích trong máu chiết bằng SPE và LLE 36

Bảng 3.4 Độ thu hồi của chất phân tích trong nước tiểu chiết bằng SPE và LLE 38

Bảng 3.5 Độ phù hợp của hệ thống GC-MS 42

Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của KET, NK trong máu và nước tiểu 46

Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của NK, KET trong máu và nước tiểu 47 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp 50

Bảng 3.9 Hiệu suất chiết của NK và KET trong máu và nước tiểu 52

Bảng 3.10 Độ ổn định của hoạt chất trong máu và nước tiểu 53

Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu thực 54

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Một số hình ảnh của ketamin 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ketamin 5

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa của KET 7

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của norketamin 8

Hình 2.1 Thiết bị sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên cứu tại Khoa Độc chất, Viện Pháp y Quốc gia 23

Hình 3.1 Phổ khối lượng và sắc ký đồ của chuẩn 31

Hình 3.2 Sắc đồ ở chế độ SIM của 3 chất với các mảnh ion định lượng 32

Hình 3.3 Sắc đồ NK, KET và KET-d4 theo 4 chế độ gradient 35

Hình 3.4 Độ thu hồi của KET, NK trong máu khi chiết bằng SPE và LLE 37

Hình 3.5 Sắc đồ khảo sát LLE với dung môi EtOAc trong máu 37

Hình 3.6 Sắc đồ khảo sát LLE với dung môi EtOAc trong nước tiểu 398

Hình 3.7 Độ thu hồi của KET, NK trong nước tiểu khi chiết bằng SPE và LLE 389

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu máu thêm chuẩn và IS phân tích bằng GC-MS 41

Hình 3.9 Sắc đồ mẫu nước tiểu thêm chuẩn và IS phân tích bằng GC-MS 41

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu máu trắng, mẫu chuẩn và mẫu máu thêm chuẩn 44

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu nước tiểu trắng, mẫu chuẩn và nước tiểu thêm chuẩn 45

Hình 3.12 Sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N của KET trong nước tiểu 46

Hình 3.13 Đường chuẩn phân tích NK trong máu 48

Hình 3.14 Đường chuẩn phân tích KET trong máu 48

Hình 3.15 Đường chuẩn phân tích NK trong nước tiểu 49

Hình 3.16 Đường chuẩn phân tích KET trong nước tiểu 49

Hình 3.17 Sắc đồ xác nhận sự có mặt của KET và NK trong mẫu máu M1 55

Hình 3.18 Sắc đồ xác nhận sự có mặt của KET và NK trong mẫu nước tiểu M7 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

DHNK Dehydronorketamine Dehydronorketamin

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent

Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym

FID Flame Ionization Detector Detector ion hóa ngọn lửa

HPLC High Performance Liqid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

LLE Liquid – liquid extraction Chiết lỏng – lỏng

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

R2 Relative Coefficient Hệ số tương quan

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

UNODC United Nations Office on Drugs

and Crime

Cơ quan phòng chống ma túy

và tội phạm của Liên Hợp Quốc

UV-VIS Ultraviolet – Visible Tử ngoại và khả kiến

1

MỞ ĐẦU

Ma túy từ lâu đã là một vấn đề nhức nhối của xã hội Theo thống kê của Cơ

quan Phòng chống ma túy và tội phạm Liên Hợp Quốc – UNODC (United Nations Office on Drugs and Crime), thế giới hiện nay có khoảng 275 triệu người nghiện hoặc

sử dụng ma túy Trong đó có 164 triệu người sử dụng cần sa và 37 triệu người nghiện

ma túy tổng hợp Cũng theo cơ quan này, lượng ma túy sản xuất ra hàng năm ước chừng 3000 tấn, chủ yếu là heroin, cocain, cần sa và ma túy tổng hợp các loại [55] Loại ma túy tổng hợp mới xuất hiện gần đây, ketamin, được xem là một ma túy cao cấp và được liệt vào danh mục thuốc độc bảng A Kể từ khi xuất hiện, ketamin nhanh chóng trở thành một trong 10 loại ma túy được sử dụng nhiều nhất trên thế giới [5] Trong cơ thể người, ketamin được chuyển hóa ở gan và tạo ra hợp chất chuyển hóa là norketamin Xét nghiệm nước tiểu có thể phát hiện ketamin tối đa trong 6 ngày nhưng có thể phát hiện norketamin đến tối đa hai tuần [43]

Việc xác định chính xác nồng độ ketamin nói riêng và các loại ma túy khác nói chung trong dịch sinh học luôn là nhiệm vụ ưu tiên hàng đầu của quá trình giám định pháp y Thông tin về nồng độ ma túy trong mẫu máu, nước tiểu của đối tượng tình nghi sẽ cung cấp các gợi ý quan trọng hỗ trợ lực lượng chức năng điều tra, phá án Bên cạnh đó, trong quá trình điều trị lâm sàng, định lượng nồng độ ma túy cũng góp phần xác định mức độ, tần suất sử dụng ma túy của bệnh nhân, phục vụ cho việc đánh giá, điều trị đạt hiệu quả tốt nhất Vì vậy, cùng với sự tăng nhanh số lượng người sử dụng ketamin việc xác định đồng thời hai chất ketamin và norketamin trong dịch sinh học là vô cùng cần thiết

Trên thế giới, việc nghiên cứu phân tích ketamin và các chất chuyển hóa đang được các nhà khoa học quan tâm chú ý Đã có các nghiên cứu xác định ketamin và norketamin sử dụng nhiều phương pháp khác nhau được triển khai như phương pháp điện di mao quản (CE) [44, 45], phương pháp sắc ký khí (GC) kết hợp với khối phổ (MS) hoặc khối phổ hai lần (MS/MS) [11, 14, 15, 20, 22, 26, 28, 38, 58], phương pháp sắc ký lỏng (LC) với detector UV, MS hoặc MS/MS [8, 13, 24, 41]

2

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về xác định đồng thời ketamin và chất chuyển hóa trong máu và nước tiểu còn rất hạn chế Do vậy, để góp phần hỗ trợ quá trình

giám định pháp y cũng như điều trị bệnh nhân ngộ độc ma túy, đề tài “Nghiên cứu

xác định đồng thời ketamin và norketamin trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời ketamin và norketamin trong máu

và nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích xác định ketamin và

norketamin trong máu và nước tiểu một số trường hợp nghi ngờ sử dụng ma túy loại ketamin

Các thử nghiệm lâm sàng đối với việc truyền KET được tiến hành các năm sau

đó và cho thấy thuốc có nhiều hạn chế như gây ra hiện tượng ảo giác, giấc mơ sống động, tăng cảm giác và mê sảng [17] Sử dụng nhiều KET có thể gây tử vong vì suy

hô hấp và suy tim Cùng với sự ra đời của các loại thuốc khác như Propofol, KET ít được sử dụng như một loại thuốc y tế vào cuối những năm 1970

Tới thập niên 1990, việc sử dụng KET bất hợp pháp nhằm mục đích giải trí bắt đầu xuất hiện và nhanh chóng tăng nhanh trên toàn thế giới Đến năm 1999, KET trở thành chất độc loại III theo Đạo luật về các chất cần kiểm soát của Hoa Kỳ Những người sử dụng gọi KET bằng các tên lóng như K, Ket, Special K, Vitamin K, hoặc Cat Valium Nhiều báo cáo cho thấy việc sử dụng KET với mục đích giải trí thường được kết hợp với các loại ATS khác, đặc biệt với những người sử dụng Metamphetamin và Ecstasy [59]

Xu hướng sử dụng KET đã tăng lên ở các nước Đông và Đông Nam Á kể từ năm 2012 [53] Lượng KET bị bắt giữ trong khu vực tăng từ 6 tấn năm 2012 lên hơn

12 tấn vào năm 2014, chiếm gần như toàn bộ lượng KET bị tịch thu trên toàn thế giới

Cụ thể, lượng KET bị bắt giữ ở Trung Quốc tăng gấp 4 lần, từ 4,7 tấn năm 2009 lên 19,6 tấn vào năm 2015 Gần 200 trường hợp sản xuất KET đã được phát hiện ở Trung Quốc vào năm 2015, tăng 12,4 % so với năm 2014 [52] Ở Việt Nam, KET không

4

phổ biến và không được sử dụng rộng rãi nhưng đang có xu hướng tăng lên cùng với tình trạng sử dụng Ecstasy [4] Vào những năm 2000, KET được sử dụng như một loại ma túy, do đó ngày 06/11/2003, Chính phủ đã ban hành Nghị định số 133/2003/NĐ-CP bổ sung KET vào danh mục các chất được kiểm soát [3] Một số hình ảnh thực tế của ketamin được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1 Một số hình ảnh của ketamin

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

KET thường gặp dưới hai dạng là dạng base và muối hydroclorid

 Ketamin base [1, 19]

Ketamin là một arylcycloamin, có tên khoa học là

(RS)-2-(2-chlorophenyl)-2-(methylamino)cyclohexanone, có công thức phân tử: C13H16ClNO và khối lượng phân tử 237,74 g.mol-1 KET có pKa = 7,5 và điểm chảy là 92 – 93 oC KET là một base yếu, có thể tan trong dầu, chứa một carbon bất đối ở C2 của vòng cyclohexan,

gồm 2 dạng đối hình, (S)-(+)-ketamin và (R)-(-)-ketamin Hình 1.2 thể hiện công thức

cấu tạo hai dạng đối hình của ketamin

5

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ketamin

 Ketamin hydroclorid [1, 19] có công thức phân tử là C13H16ClNOHCl, khối lượng phân tử 274,2 g.mol-1 và điểm chảy là 262 – 263 oC Đây là dạng thuốc của KET Ketamin hydroclorid ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Dung dịch 10 % trong nước có pH từ 3,5 đến 4,1 Dạng muối hydrochlorid tan được trong nước (tỷ lệ 1:4), tan được trong methanol và chloroform, 1:14 trong ethanol, 1:60 trong ethanol tuyệt đối và chloroform, thực tế không tan trong ether

1.1.2 Dược lực học

Ketamin hydrochlorid tiêm tĩnh mạch liều 2,0 mg/kg có tác dụng gây mê để phẫu thuật trong vòng 1 phút sau khi tiêm và tác dụng kéo dài 5 – 15 phút Tiêm bắp liều 10 mg/kg có tác dụng gây mê để phẫu thuật trong 3 – 5 phút sau khi tiêm và tác dụng kéo dài 12 – 25 phút Để kéo dài thời gian gây mê hay giảm đau có thể truyền nhỏ giọt KET Với liều cao, KET có thể gây ra ngộ độc và gây ảo giác

Về tác dụng dược lý, KET gây ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương,

hệ thống tim mạch, hô hấp và có tác dụng chống trầm cảm

KET có tác dụng gây mê phân lập do cắt đứt chọn lọc những con đường hội tụ

ở não Thuốc ức chế thụ thể NMDA và gây dịu thần kinh, làm mất trí nhớ trong đó người bệnh vẫn có vẻ tỉnh nhưng cách biệt với môi trường, bất động và không cảm thấy đau [12] Một tác động của KET lên hệ thần kinh trung ương là làm tăng cường hoạt động của dopamin và làm thay đổi sự cân bằng giữa dopamin và serotonin khi được sử dụng lặp đi lặp lại [18, 31, 49] KET có hai dạng đối hình và các dạng đối

hình khác nhau nhau có tác động dược lý khác nhau (S)-ketamin có ái lực với thụ thể NMDA cao hơn 3-4 lần so với (R)-ketamin và do đó có nhiều tiềm năng gây mê (S)-

6

ketamin là đối hình gây ra những ảnh hưởng loạn tâm thần của KET còn (R)-ketamin

có thể tạo ra một trạng thái thư giãn dưới liều gây mê [56]

KET có khả năng duy trì hoặc tăng cung lượng tim nên thường được sử dụng

để gây mê cho bệnh nhân tim mạch Tuy nhiên, các bệnh nhân cao huyết áp, thiếu máu cục bộ cơ tim hoặc tắc nghẽn mạch máu não phải trách việc sử dụng hợp chất này Các tác dụng trên tim mạch khi sử dụng KET bao gồm: tăng huyết áp và nhịp xoang nhanh, hạ huyết áp, chậm nhịp xoang và một số rối loại nhịp tim khác [51, 57]

Ở liều thấp, KET có thể được sử dụng như một loại thuốc làm dịu hô hấp nhẹ Ngược lại với liều cao, người dùng có thể bị suy hô hấp và ngừng thở Tuy nhiên, chưa có trường hợp suy hô hấp nào được báo cáo sau khi sử dụng KET để giải trí [46, 51]

Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của bệnh nhân trầm cảm kháng trị điều trị bằng KET tiêm tĩnh mạch đều cho kết quả chống trầm cảm nhanh chóng nhưng thoáng qua Trong một số nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng khác, bệnh nhân trầm cảm kháng thuốc nặng cho thấy tỷ lệ đáp ứng lên đến 70 % chỉ sau một liều KET duy nhất [16, 23, 33, 39]

1.1.3 Dược động học

1.1.3.1 Hấp thu

KET hấp thu nhanh sau khi tiêm và phân bố vào các mô được tưới máu tốt, kể

cả não Do bước chuyển hóa qua gan và ruột, sinh khả dụng của đường uống hoặc đặt trực tràng giảm từ 17-25 % so với đường tiêm Sinh khả dụng của đường hít cũng thấp hơn khoảng 50% so với đường tiêm bắp [32]

1.1.3.2 Phân bố

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy KET tập trung nhiều ở mô mỡ, gan và phổi Thể tích phân bố khoảng 3 L/kg Trong khi đó, tại tim và cơ xương, nồng độ KET khá thấp KET có khả năng đi qua được hàng rào nhau thai và nhanh chóng đến máu não Nồng độ KET trong não cao gấp từ 4 – 5 lần so với trong huyết tương [46]

1.1.3.3 Chuyển hóa

Các con đường chuyển hóa của KET trong cơ thể được thể hiện ở hình 1.3

7

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa của KET

KET chuyển hóa chủ yếu ở gan tạo thành chất chuyển hóa có hoạt tính Cụ thể, KET bị khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ bởi enzym microsom cytocrom P450 qua CYP3A4, CYP2B6 và CYP2C9 tạo thành chất chuyển hóa 1 là norketamin [21] Sau đó, NK gắn hydroxy vào vị trí số 5 và số 6 của vòng cyclohexanon tạo thành chất chuyển hóa III và IV Hai chất này có thể thải trừ dưới dạng liên hợp hoặc biến đổi tạo thành chất chuyển hóa II bằng phản ứng loại nước Bản thân KET có thể tự hydroxy hóa vòng cyclohexanon ở vị trí số 5 và 6 tạo thành chất chuyển hóa V và VI,

nó có thể thải trừ tương tự bằng cách liên hợp hoặc biến đổi tạo thành chất chuyển hóa VII bằng phản ứng loại nước Chất chuyển hóa VII có thể chuyển thành chất chuyển hóa số II bởi phản ứng khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ Chỉ 16% liều có thể được tái hấp thu trong nước tiểu dưới dạng hydroxy ketamin hoặc NK

8

Các đường chuyển hóa khác là phản ứng hydroxyl hóa vòng cyclohexan và liên hợp với acid O-glucuronic Các chất chuyển hóa sau khi liên hợp có thể dễ dàng tan trong nước và thải trừ qua thận (> 80 % liều) [27]

1.1.3.4 Thải trừ

KET được thải trừ chủ yếu qua nước tiểu và phân 90 % liều dùng thải trừ qua nước tiểu trong đó có từ 2 – 4 % dưới dạng KET nguyên vẹn và khoảng hơn 5 % thải trừ theo đường phân Sau khi dùng, KET có thể được phát hiện ở nước tiểu từ 5 – 6 ngày Thời gian bán thải của KET là 2 – 3 giờ và độ thanh thải là 1,3 L/phút [41]

Norketamin (NK) có tên khoa học là (RS)-

223,70 g.mol-1 Tương tự như KET, NK cũng có hai dạng đối hình là norketamin và (R)-(-)-norketamin Công thức cấu tạo hai dạng đối hình của NK được

(S)-(+)-thể hiện trong hình 1.4

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của norketamin

NK là chất chuyển hóa chính của KET, được tạo ra khi KET bị khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ bởi enzym microsom cytocrom P450 qua CYP3A4, CYP2B6

và CYP2C9 trong gan [21] Ở hầu hết các trường hợp, NK cuối cùng được hydroxyl hóa thành hydroxynorketamine và bài tiết qua nước tiểu sau khi liên hợp với glucoronate [7] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng NK có khả năng gây độc tế bào biểu mô [30] Khi sử dụng lâu dài hoặc lạm dụng KET, nồng độ NK tìm thấy trong nước tiểu thường cao hơn nhiều so với KET (tỷ lệ KET/NK trung bình là 0,743) [37]

9

Vì vậy ngoài KET, NK cũng là một tác nhân quan trọng gây ra sự chết tế bào và bong

ra của niệu quản

Tương tự KET, NK hoạt động như một chất đối kháng thụ thể aspartate (NMDA) không cạnh tranh (Ki = 1,7 μM và 13 μM cho (S)-(+)-norketamin

N-methyl-D-và (R)-(-)-norketamin, tương ứng) [50] Tác dụng gây mê của NK ít hơn khoảng 3 –

5 lần so với KET [48] NK liên kết với các thụ thể μ –, κ – opioid và có tác dụng như

là chất đối kháng của thụ thể ɑ7 – nicotinic acetylcholine, do đó, NK có tác dụng chống trầm cảm nhanh chóng ở các thí nghiệm trên động vật [42] NK được chuyển hóa thành dehydronorketamin và hydroxynorketamin, có hoạt tính yếu hơn như là chất đối kháng thụ thể NMDA nhưng vẫn giữ được hoạt tính là chất đối kháng mạnh của thụ thể ɑ7 – nicotinic acetylcholine [25, 35]

NK là một chất chuyển hóa có hoạt tính Các nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng NK có khoảng 20 – 60 % hiệu lực của KET và đóng góp tới 30 % vào việc giảm đau khi sử dụng KET [40] Vì vậy, trong các nghiên cứu định lượng KET, NK thường được xác định cùng để có một đánh giá tổng quát về tình trạng bệnh lý của bệnh nhân khi sử dụng KET Do có hoạt tính và tác dụng tương tự KET, NK đang dần được ứng dụng làm thuốc giảm đau, điều trị hoặc ngăn ngừa các triệu chứng của bệnh trầm cảm Việc xác định được nồng độ NK sẽ cung cấp các thông tin về quá trình chuyển hóa và thải trừ của hoạt chất này

Hàm lượng KET và NK trong mẫu sinh học thường nhỏ nên trước khi phân tích thường phải xử lý mẫu bằng phương pháp chiết nhằm mục đích loại bớt tạp chất và làm giàu mẫu Có 2 phương pháp chiết thường dùng là: chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn

1.3.1 Chiết lỏng – lỏng

Chiết lỏng – lỏng là quá trình tách các chất dựa trên sự hòa tan hay phân bố của chất trong 2 dung môi không đồng tan vào nhau Trong thực tế thường dùng cân bằng nước, dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước (ethyl acetate, n-hexan, cloroform,…) để tách và tinh chế chất phân tích Hiệu suất chiết phụ thuộc vào độ

Quy trình thường thấy khi chiết KET và chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học là mẫu nước tiểu hoặc máu sau khi thêm nội chuẩn sẽ được kiềm hóa bằng dung dịch NaOH hoặc natri carbonat để tạo môi trường base Mẫu sau đó được chiết lỏng – lỏng bằng các loại dung môi khác nhau như: EtOAc [28], triethylamin:cyclohexan (3:1, v/v) [15], cyclohexan [59]… Tiếp đó, dung dịch được lắc, ly tâm để lấy lớp dịch chiết phía trên Dịch chiết được cô cạn, tạo dẫn xuất hoặc trực tiếp pha loãng bằng dung môi và tiến hành phân tích

Khác với quy trình phổ biến trên, Kaoqi Lian và cộng sự đã cho KET tác dụng với natri nitrit trong môi trường acid để tạo thành hợp chất nitrosamin dễ bay hơi và

có thể xác định bằng sắc ký khí [26] Đầu tiên, 2,0 mL nước tiểu hoặc huyết tương được cho vào ống thủy tinh 10 mL đặt trên một bể nước đá Thêm 150 μL HCl 1 M, trộn kỹ Thêm từng giọt 200 μL dung dịch natri nitrit bão hòa, trộn và để yên trong 1 phút Thêm tiếp 2,0 mL diclometan, lắc, ly tâm và lấy lớp dịch phía trên cô cạn dưới dòng khí nitơ đến cắn Hòa tan cắn và định lượng bằng GC-MS

Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, phù hợp với hầu hết các phòng thí nghiệm, chất phân tích thu được tương đối sạch, có thể làm giàu và tinh chế mẫu Tuy nhiên không phải chất phân tích nào cũng tìm được dung môi chiết phù hợp [34]

1.3.2 Chiết pha rắn

Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chiết dựa vào sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó, các chất được chiết từ pha lỏng vào pha rắn Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi trong các ống nhỏ Pha lỏng được cho

Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh học trong phân tích KET và NK [9, 22, 24, 29]

Min-Kun Huang và cộng sự đã dùng cột SPE ISOLUTE HCX 130 mg để chiết KET và các chất chuyển hóa trong nước tiểu [22] Cột được hoạt hóa bằng 2 mL metanol, 2 mL nước deion và 2 mL đệm phosphat 0,1 M ở pH 6,0 Sau khi nạp mẫu vào cột với tốc độ 2 mL/phút, cột được rửa bằng 1 mL acid acetic 1 M và làm khô bằng nitơ trong 5 phút Cuối cùng, chất phân tích được rửa giải bằng 2 mL ethyl axetat chứa 2% (v/v) amoni hydroxit đậm đặc ở tốc độ 2,0 mL/phút Dịch rửa giải sau đó được làm khô, tạo dẫn xuất và định lượng bằng GC

Trong nghiên cứu của Huei-Ru Lin và các cộng sự, KET cùng AMP, opiate và các chất chuyển hóa của chúng đã được định lượng trong mẫu nước tiểu [29] Các mẫu nước tiểu được chiết bằng SPE với quy trình như sau: thêm 80 μL IS vào 2 mL nước tiểu, thêm tiếp 2 mL đệm phosphat 20 mM (pH = 7,4) và 80 μL dung dịch amoni hydroxit (29 wt.%) Sau khi hoạt hóa cột bằng 1 mL methanol và 1 mL nước, các mẫu đã chuẩn bị được nạp vào cột Rửa cột bằng 1 mL nước – methanol (95:5, v/v) Rửa giải bằng 1 mL MeOH và dịch rửa giải được làm bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ ở 60 ◦C Cắn được hòa tan lại trong 200 μL nước trước khi bơm vào hệ thống LC-MS/MS

Trong nghiên cứu của mình, T Legrand và cộng sự đã thực hiện khảo sát chiết KET và NK từ huyết tương người trên các loại cột SPE khác nhau, bao gồm: cột C18, cột Bond Elut LMS, cột Oasis HLB, cột Abselut Nexus và cột Oasis MCX [24] Kết quả khảo sát cho thấy, độ thu hồi của KET và NK trong mẫu huyết tương là cao nhất

12

khi sử dụng cột chiết Oasis MCX (H ~ 88 %) Quy trình chiết tối ưu cho cột Oasis MCX như sau: hoạt hóa cột bằng 1 mL MeOH và 1 mL nước deion, nạp mẫu vào cột, rửa cột bằng 1 mL HCl 0,1N và 1 mL methanol, cuối cùng rửa giải chất phân tích bằng 1 mL NH4OH 5 % trong MeOH

Một nghiên cứu khác của Luigino G Apollonio và các cộng sự cũng sử dụng cột Oasis MCX để chiết KET cùng các chất nhóm AMP trong mẫu máu toàn phần [9] Đầu tiên, 2 mL dung dịch đệm natri phosphat 100 mM (pH = 6) được thêm vào

1 mL máu, trộn xoáy và ly tâm Cột được hoạt hóa bằng 3 mL MeOH, 3 mL nước deion và 1 mL đệm phosphat (pH = 6) trước khi nạp mẫu đã chuẩn bị vào Rửa cột bằng 3 mL nước deion, 1 mL acid acetic 0,1 M và 3 mL MeOH Sau đó cột được làm khô trong chân không rồi rửa giải bằng 2 mL amoni hydroxit 10 % trong MeOH (2 lần)

SPE là phương pháp có độ thu hồi cao, độ lặp lại tốt [34], có khả năng lựa chọn đặc hiệu chất phân tích, đồng thời có khả năng làm sạch mẫu tốt Tuy nhiên, chi phí

để tiến hành chiết pha rắn cao hơn rất nhiều chiết lỏng – lỏng, đồng thời thao tác tiến hành cũng phức tạp và tốn nhiều thời gian

1.4.1 Phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly (có chất đệm pH), dưới tác dụng của điện trường (E) nhất định (do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra) Các chất phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector [6]

Trong nghiên cứu của Naidia Porpiglia và cộng sự, điện di mao quản vùng (CZE) đã được sử dụng để tách KET và NK trong các mẫu tóc [44] Sau quá trình xử

lý, các mẫu tóc được chiết lỏng – lỏng bằng 3 mL dung môi hexan : ethyl acetate (50:50, v/v) trước khi được tiêm điện động học và phân tích trong CE Detector sử dụng là UV-DAD với bước sóng phát hiện 200 nm Mao quản silica nung chảy có đường kính trong 50 μm, tổng chiều dài 45 cm và chiều dài hiệu dụng 35 cm Sự phân

13

tách xảy ra ở điện áp 20 kV trong đệm tris phosphat 15 mM (pH = 2,5) chứa

HS-ɣ-CD 0,1 % (w/v) Tất cả các đồng phân đối quang tương ứng của KET và NK đã phân tách hoàn toàn trong vòng chưa đầy 10 phút LOD và LOQ lần lượt là 0,08 và 0,25 ng/mg cho mỗi chất đối quang

Regula Theurillat và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di mao quản (CE) ghép nối detector dãy diod quang (PDA) để xác định các đồng phân lập thể của bốn hợp chất là KET và 3 chất chuyển hóa của nó, bao gồm NK, DHNK, 6-hydroxynorketamin (6HNK), trong mẫu huyết tương và huyết thanh [45] Các mẫu được xử lý bằng cách chiết lỏng – lỏng với dung môi diclometan, acid hóa bằng 10

μL acid phosphoric 1 mM trước khi bay hơi dung môi đến cắn, cắn được hoàn nguyên trong 110 μL nước và tiêm điện động với điện áp 6 kV vào thiết bị CE trong 15 giây Các điều kiện tối ưu cho CE bao gồm: mao quản silica nung chảy có đường kính trong 50 μm, tổng chiều dài 45 cm (chiều dài hiệu dụng 35 cm), điện áp đặt vào hai đầu mao quản 20 kV, nhiệt độ mao quản 25 oC và detector PDA được đặt ở bước sóng 200 nm Dung dịch đệm sử dụng là đệm phosphat 100 mM (pH = 3,0) chứa HS-ɣ-CD 0,66 % Phương pháp này rất thích hợp để xác định nồng độ đồng phân đối quang của KET và các chất chuyển hóa với độ lặp lại tốt (RSD trong ngày và giữa các ngày lần lượt là < 5 % và < 9 %), LOQ thấp đến 10 ng/mL

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng (LC) là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữ pha động và pha tĩnh Do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau

Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Sắc ký lỏng kết nối khối phổ (MS) ngoài việc cung cấp thông tin sắc ký đồ, còn có thể cung cấp các thông tin về phổ khối lượng của từng chất LC-MS là công cụ phân tích phổ biến khi phân tích các chất ma túy nhiều thành phần

Năm 2005, Hassan Y Aboul-Enein và Mohamed M Hefnawy đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV tại bước sóng 220 nm để xác định đồng

Năm 2007, phương pháp LC-MS đã được Chung-Yu Chen và cộng sự sử dụng

để định lượng KET cùng các chất chuyển hóa trong nước tiểu [13] Cột tách sắc ký

là cột Supelcosil LC-18DB (4,6 mm × 250 mm, kích thước hạt 5 μm) Pha động là hỗn hợp amoni acetat 30 mM : acetonitril (50:50, v/v) được điều chỉnh pH thành 7,1, hoạt động ở chế độ đẳng dòng với tốc độ 1,0 mL/phút Nghiên cứu đã đưa ra một phương pháp xử lý mẫu nước tiểu dễ dàng và đơn giản bằng cách đưa nước tiểu qua

bộ lọc PVDF (Millipore, USA) 0,2 μm Ngoài ra, trong nghiên cứu này, các tác giả cũng thực hiện so sánh hiệu suất ion hóa giữa chế độ ion hóa kiểu phun sương điện

tử (ESI) với chế độ ion hóa hóa học (APCI) Kết quả cho thấy chế độ APCI tốt hơn

so với chế độ ESI trong việc xác định các chất phân tích Giới hạn phát hiện là 0,95; 0,48 và 0,33 ng/mL, tương ứng với KET, NK và DHNK

Năm 2008, T Legrand và cộng sự đã định lượng KET và NK trong mẫu huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS) [24] Các mẫu huyết tương được chiết xuất bằng SPE với cột Oasis MCX Thiết bị sắc ký lỏng sử dụng cột tách

là cột C18 và pha động bao gồm acid formic 0,1 % : acetonitril (90:10, v/v) KET và

NK được xác định dựa trên phương pháp nội chuẩn (chuẩn nội là NK-d4) Thiết bị khối phổ sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI) với các điều kiện tối ưu: điện thế phân rã (DP) 24 V, điện thế hội tụ (FP) 200 V, điện thế đầu vào (EP) -5

V, nhiệt độ nguồn 150 oC, tốc độ dòng khí phụ trợ 6 L/phút Chế độ giám sát ion đơn (SIM) được sử dụng để định lượng KET, NK và NK-d4 lần lượt ở m/z 238,2; 224,2

và 228,2 Các đường chuẩn tuyến tính trong khoảng từ 5 đến 500 ng/mL (R2 > 0,999)

1.4.3 Phương pháp sắc ký khí

Sắc ký khí (GC) là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với pha động là chất khí Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký Do các chất phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng được tách ra khỏi nhau Sắc ký khí áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền ở nhiệt độ cao

Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các chất Đây là một detector có độ nhạy và độ chọn lọc cao Do đó, nó rất phù hợp để ứng dụng trong phân tích hàm lượng vết

Sự kết hợp giữa GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký khí khối phổ

GC-MS Phương pháp GC-MS sử dụng kĩ thuật GC để tách các chất và phát hiện chúng

16

với detector MS nhờ đó phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp, phát triển

và mở rộng ứng dụng của hai kĩ thuật này

Một số kỹ thuật MS

Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan): Với một hỗn hợp nhiều chất sau khi

được tách ra qua cột sắc ký khí và đưa vào detector khối phổ, detector sẽ ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất và đưa ra một sắc đồ toàn bộ ion TIC và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (full scan) Full scan cho đầy đủ thông tin về chất phân tích, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM): Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận

diện một hoặc một vài ion và ghi sắc đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tăng tỷ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N)

Phương pháp GC-MS có thể phân tách và định tính hỗn hợp nhiều chất, lượng mẫu cần sử dụng rất ít Tuy nhiên phương pháp GC-MS cho tín hiệu kết quả giống hoặc rất tương tự khi phân tích các đồng phân quang học; Một số chất có phân tử lượng lớn không thích hợp cho phân tích bằng GC-MS Những chất không bền với nhiệt sẽ bị phân hủy bởi nhiệt độ cao của buồng bơm mẫu trước khi ion hóa; Những chất có khả năng bay hơi kém thường phải tạo dẫn xuất trước khi tiêm mẫu

Phương pháp GC-MS có thể phân tách và nhận dạng hầu hết các chất ma túy đang lưu hành Với độ nhạy cao, GC-MS là phương pháp phân tích được sử dụng nhiều nhất hiện nay để xác định các chất ma túy sau khi sàng lọc sơ bộ Việc định tính các thành phần khác nhau của mẫu có thể sử dụng thư viện phổ thương mại trong máy, tuy nhiên vẫn cần so sánh với mẫu chuẩn của chất ma túy cần phân tích

Hiện nay, để phân tích KET cùng các chất chuyển hóa trong mẫu phẩm sinh học, phương pháp sắc ký khí khối phổ được sử dụng rất phổ biến [11, 14, 15, 20, 22,

26, 28, 38, 58]

Năm 2004, Su-Lien Chou và cộng sự [15] đã sử dụng sắc ký khí khối phổ pha loãng đồng vị kết hợp với chiết lỏng – lỏng để xác định KET và NK trong mẫu nước tiểu Trong nghiên cứu này, KET và NK được tạo dẫn xuất với pentafluorobenzoyl

17

clorua (PFBC) trước khi định lượng bằng sắc ký khí khồi phổ GC-MS hoạt động ở chế độ ion hóa ion dương (PCI)

Năm 2005, phương pháp GC-MS đã được Min-Kun Huang và cộng sự sử dụng

để phát hiện đồng thời KET, NK và DHNK trong nước tiểu [22] Các mẫu được chiết trên thiết bị chiết pha rắn tự động và sau đó tạo dẫn xuất bằng N-metyl-bis(trifluoroacetamide) (MBTFA) Điểm đặc biệt của nghiên cứu này là dung dịch dẫn xuất có thể được tiêm trực tiếp vào hệ thống GC-MS mà không cần thêm bước làm khô và hòa tan lại cắn trong dung môi Phương pháp đã được ứng dụng để phân tích trong 20 mẫu nước tiểu nghi ngờ chứa KET

Năm 2006, Huei Ru Lin và Ahai Chang Lua đã xác định đồng thời các ma túy nhóm amphetamin và ketamin (KET, NK, DHNK) trong mẫu nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ [28] Các mẫu nước tiểu được chiết lỏng – lỏng với dung môi EtOAc và tạo dẫn xuất bằng anhydrit trifluoroacetic (TFAA) Các kết quả định lượng từ nghiên cứu cho thấy nồng độ DHNK lớn hơn nồng độ KET hoặc NK ở 19 trong số 35 mẫu nước tiểu dương tính với KET

Năm 2007, một quy trình SPE tự động kết hợp với phương pháp GC-MS đã được Pai-Sheng Cheng và cộng sự phát triển để xác định KET, NK và DHNK trong nước tiểu [14] Đây là phương pháp phân tích đơn giản, nhanh chóng nhưng có độ tin cậy cao, đạt được độ tuyến tính tốt (R2 > 0,999) trong khoảng nồng độ từ 30 đến 1000 ng/mL, độ chính xác (90 – 104 %) và độ chụm (RSD < 8,1 %) cho cả ba chất phân tích Quy trình trên cũng được so sánh với phương pháp Neogen ELISA để đánh giá

độ tương thích giữa hai phương pháp Tổng cộng 260 mẫu nước tiểu đã được xác định và có 22 mẫu dương tính với cả ba chất phân tích Xét nghiệm Neogen ELISA cho thấy khả năng sàng lọc tốt các mẫu dương tính trước khi tiến hành phân tích định lượng bằng GC-MS

Năm 2010, Yalan Di và cộng sự đã xây dựng phương pháp phân tích định tính

và định lượng KET trong mẫu máu sử dụng SPE kết hợp với GC/MS và GC/NPD (Nitrogen phosphor detector – detector nitơ phospho) [58] Phương pháp sử dụng 4-PBA làm chất chuẩn nội và cột SPE là cột Bond-Elut-Certify với dung dịch rửa giải

18

là dichloromethan : isopropanol : amonium hydroxid (78 : 20 : 2 , v/v/v) Đường chuẩn tuyến tính thu được trong khoảng 6,0 – 5000 ng/mL khi phân tích bằng GC/NPD và giới hạn phát hiện 20 ng/mL khi phân tích bằng GC/MS Phương pháp

có độ thu hồi là 96,9 % và RSD < 5%

Năm 2011, phương pháp sắc ký khí khối phổ đã được Hei Hwa Lee và cộng sự [20] phát triển để xác định đồng thời amphetamine (AMP), methamphetamine (MAMP), 3,4 – methylenedioxy amphetamine (MDA), 3,4 – methylenedioxy methamphetamine (MDMA), 3,4 – methylenedioxyethyl amphetamine (MDEA), KET và NK trong nước tiểu Các tác giả đã sử dụng phương pháp SPE kết hợp với quá trình tạo dẫn xuất với heptafluorobutyric anhydrit (HFBA) Giới hạn định lượng của AMP, MAMP, MDA, MDMA, MDEA, KET và NK lần lượt là 25, 15, 60, 60,

70, 25 và 30 ng/mL Độ chụm trong ngày và giữa các ngày có sự sai khác CV ≤ 3,1

% và ≤ 4,95 % Độ chính xác trong ngày từ 96,0 % đến 110,7 % và độ chính xác giữa các ngày từ 96,9 % đến 108,7 % Phương pháp đã được ứng dụng để phân tích 107 mẫu nước tiểu

Năm 2012, Kaoqi Lian và cộng sự đã phát triển một phương pháp xác định KET trong mẫu nước tiểu và huyết tương bằng cách tạo dẫn xuất với natri nitrit và GC-MS [26] Lần đầu tiên KET được tạo dẫn xuất với natri nitri thành N-nitrosamin dễ bay hơi trong môi trường acid và có thể xác định bằng khối phổ So với hầu hết các phương pháp tạo dẫn xuất khác, phương pháp này nhanh, thuận tiện, hiệu quả và có chi phí thấp

Năm 2014, André Valle de Bairros và cộng sự đã xác định KET cùng hai chất chuyển hóa của nó, NK và DHNK trong mẫu nước tiểu sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ kết hợp với chiết pha lỏng vi lượng dây rỗng (HF-LPME) ở chế độ ba pha [11] Đầu tiên, các lỗ xốp chứa đầy tinh dầu bạch đàn và dung dịch HCl 1,0 M được đưa vào lòng sợi (pha nhận) Sợi được ngâm trong nước tiểu đã kiềm hóa chứa

10 % NaCl, lắc trong 30 phút Sau đó, pha nhận được rút ra khỏi sợi, làm khô Cặn được tạo dẫn xuất bằng anhydrit trifluoroacetic (TFAA) trước khi định lượng bằng GC-MS Phương pháp có phạm vi xác định và giới hạn phát hiện thấp hơn giá trị giới

19

hạn (1,0 ng/mL) do UNODC khuyến nghị Bên cạnh đó, phương pháp này sử dụng

kỹ thuật chiết xanh với tinh dầu bạch đàn được sử dụng làm màng chất lỏng trong HF-LPME

Năm 2015, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) đã được Ivo Moreno và các cộng sự sử dụng để xác định KET cùng các chất chuyển hóa trong nước tiểu và huyết tương [38] sử dụng kỹ thuật chiết bằng chất hấp phụ nhồi (microextraction by packed sorbent - MEPS) để chiết xuất trực tiếp KET và NK từ 0,25 mL mẫu Phương pháp có đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 10 – 250 ng/mL đối với nước tiểu và 10 – 500 ng/mL đối với huyết tương (R2 > 0,99) Độ thu hồi dao động từ 63 đến 101 % Độ chính xác và độ chụm có RSD lần lượt nhỏ hơn 14 và 15

% Phương pháp này được xem là nhanh chóng do không cần bước tạo dẫn xuất trước khi xác định bằng sắc ký khí

Một số nghiên cứu xác định KET cùng các chất chuyển hóa trong nền mẫu sinh học bằng phương pháp sắc ký khí được tổng hợp trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu xác định KET và NK trong mẫu dịch sinh học

LOD (ng/

mL)

LOQ (ng/

Cột HP-5MS (30 m x 0,2 mm

x 0,33 μm)

MS

EI PCI

Cột HP-5MS (30 m x 0,2 mm

x 0,25 μm)

MS

0,5 0,5

1,5 1,5 [22]

KET

NK

DHNK

LLE – dẫn xuất TFAA

Cột HP-5MS (12,5 m x 0,20

Cột HP-5MS (30 m x 0,25

mm x 0,1 μm)

MS

EI

0,25 0,1 0,1

0,5 0,5 0,5

Cột HP-5MS (30 m x 0,25

21

Đối tượng nghiên cứu là KET và NK

 Mẫu nghiên cứu

Mẫu máu, nước tiểu không nhiễm KET và NK được sử dụng để khảo sát và xây dựng phương pháp Mẫu trắng máu được lấy từ Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Mẫu trắng nước tiểu lấy từ nhân viên khoa Độc chất, Viện Pháp y Quốc gia Mẫu máu của các bệnh nhân điều trị KET tại Trung tâm Chống độc, Bệnh viên Bạch Mai và nạn nhân nghi ngờ sử dụng KET được gửi đến giám định tại Viện Pháp

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc 10 μg/mL: lấy 1 mL dung dịch chuẩn 1,0 mg/mL của mỗi chất cho vào bình định mức 100 mL và bổ sung methanol đến vạch Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 2 – 4 oC

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 μg/mL: lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất cho vào bình định mức 10 mL và bổ sung methanol đến vạch Dung dịch được bảo quản ở 2 – 4 oC

- Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 10 – 500 ng/mL được pha loãng từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 μg/mL trong dung môi methanol hoặc nền mẫu trắng Các dung dịch chỉ pha khi sử dụng

22

- Dung dịch chuẩn nội gốc 10 μg/mL: lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn nội KET-d4 cho vào bình định mức 10 mL và bổ sung methanol đến vạch Dung dịch được bảo quản ở 2 – 4 oC

2.2.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A), bao gồm:

- Methanol (MeOH) dùng cho HPLC của Merck, Đức

- Acetonitril (ACN) dùng cho HPLC của Merck, Đức

- Cyclohexan (Cy) dùng cho HPLC của Merck, Đức

- Ethyl acetat (EtOAc) dùng cho HPLC của Merck, Đức

- n-hexan của Merck, Đức

- Diethyl ether (Ether) của Merck, Đức

- Kali dihydrophosphat (KH2PO4) của Merck, Đức

- Dikali hydrophosphat (K2HPO4) của Merck, Đức

- Amoniac của Merck, Đức

- Acid hydrochloric của Merck, Đức

- Natri hydroxyt của Merck, Đức

- Nước cất đã loại ion

- Cân phân tích CP 224S, d = 0,0001 g (Thụy Sĩ)

- Bể lắc siêu âm Branton 5200 (Đức)

- Máy ly tâm EBA21 hãng Hettich (Đức)

- Máy lắc xoáy Vortex IKA Genius (Trung Quốc)

- Tủ sấy model 500 của hãng Memmert (Đức)

- Hệ thống làm khô bằng Nitơ Rapidvap Vertex (Đức)

23

- Hệ thống chiết pha rắn của Agilent (Mỹ)

- Các loại cột chiết: Bond Elut Certify (200 mg, 3 ml), C18 (200 mg, 3 ml)

- Ống nghiệm thủy tinh 10 mL, có nắp kín

- Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, dùng cho tiêm mẫu GC

- Các dụng cụ khác: cốc thủy tinh, ống đong, phễu, giấy lọc…

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105 oC trong 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

Hình 2.1 Thiết bị sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên cứu tại Khoa Độc chất,

Viện Pháp y Quốc gia

24

2.3.1 Nghiên cứu thiết lập chương trình GC-MS

2.3.1.1 Điều kiện sắc ký khí khối phổ

Điều kiện cho thiết bị sắc ký khí và khối phổ được tham khảo trong tài liệu “Quy trình giám định pháp y (2014) – Bộ Y Tế” [2]

2.3.1.2 Khảo sát khối phổ của KET, NK và KET-d4

Sử dụng dung dịch chuẩn KET, NK và KET-d4 100 ng/mL tiến hành phân tích

trên GC-MS ở chế độ quét toàn phổ (full scan) để khảo sát lựa chọn mảnh phổ đặc

trưng của từng chất

Dựa trên kết quả khảo sát được, để tăng độ đặc hiệu, độ nhạy và giảm nhiễu đường nền, tiếp tục tiến hành khảo sát các dung dịch chuẩn ở chế độ chọn lọc ion

(selected ion mornitoring – SIM) với mảnh phổ đặc trưng của từng chất Từ đó lựa

chọn các mảnh phổ cho phân tích định lượng

2.3.1.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ sắc ký

Chương trình nhiệt độ sắc ký được khảo sát trong đó thay đổi các điều kiện tăng nhiệt của lò để lựa chọn chương trình tối ưu cho quá trình sắc ký Tham khảo tài liệu

“Quy trình giám định pháp y” [2], tiến hành khảo sát 4 chương trình nhiệt độ sau:

 Chương trình 1: bắt đầu 100 oC giữ 1 phút, tăng 15 oC/phút đến 250 oC giữ 2 phút, tăng 30 oC/phút đến 290 oC giữ 8 phút Tổng thời gian 22,33 phút

 Chương trình 2: bắt đầu 150 oC giữ 3 phút, tăng 40 oC /phút đến 200 oC giữ

1 phút, tăng 10 oC/phút đến 290 oC giữ 6 phút Tổng thời gian 20,25 phút

 Chương trình 3: bắt đầu 40 oC giữ 1 phút, tăng 3 oC/phút đến 60 oC giữ 1 phút, tăng 30 oC /phút đến 250 oC giữ 2 phút, tăng 20 oC /phút đến 290 oC giữ 6 phút Tổng thời gian 25,00 phút

 Chương trình 4: bắt đầu 60 oC giữ 1 phút, tăng 15 oC/phút đến 150 oC giữ 2 phút, tăng 12 oC /phút đến 210 oC giữ 2 phút và tăng 10 oC/phút đến 290 oC giữ 10 phút Tổng thời gian 34,00 phút

25

2.3.2 Khảo sát phương pháp chiết mẫu

Dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa học của các chất phân tích, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết bị phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát chiết bằng phương pháp LLE trong môi trường kiềm với 5 dung môi (ethyl acetat, n-hexan, diethyl ether, acetonitril:ethyl acetat 25:75, cyclohexan:ethyl acetat 7:1) và SPE với ba loại cột chiết khác nhau, bao gồm: cột chiết pha đảo (C18), cột chiết trao đổi cation (SCX) và cột chiết hỗn hợp giữa pha đảo với trao đổi cation (Bond Elut Certify) Đánh giá khả năng thu hồi của hai chất thông qua các quy trình chiết, từ đó lựa chọn quy trình chiết tối ưu cho mẫu

Độ thu hồi của các phương pháp chiết (H, %) được xác định bằng phần trăm tỉ

lệ diện tích pic của chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn được chiết xuất và chuẩn nội thêm vào sau khi chiết trên tỉ lệ diện tích pic của mẫu chuẩn và chuẩn nội không qua chiết xuất

 Chiết pha rắn

1mL máu, nước tiểu được thêm chuẩn và chuẩn nội, thêm 3 mL dung dịch dung dịch đệm phosphat 0,1 M; pH 6,0 và lắc siêu âm 5 phút, ly tâm Phần dịch được sử dụng để tiến hành chiết pha rắn

dung dịch đệm phosphat 0,1 M; pH 6,0 mỗi loại 3 mL tốc độ 2 mL/phút Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2 mL/phút Rửa cột với 10 mL nước cất và 5 mL HCl 0,1 M tốc

độ 5 mL/phút Rửa thêm bằng 5 mL MeOH tốc độ 2 mL/phút Hút khô cột 1 phút Rửa giải bằng 5 mL hỗn hợp EtOAC : MeOH : amoniac (80:18:2) tốc độ 2 mL/phút

đệm phosphat 0,1 M; pH 6,0 mỗi loại 3 mL tốc độ 2 mL/phút Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2 mL/phút Rửa cột bằng 5 mL hỗn hợp MeOH : H2O (1 : 9) tốc độ 3 mL/phút Hút khô cột 1 phút Rửa giải bằng 3 mL MeOH tốc độ 2 mL/phút

nước cất, mỗi loại 3 mL tốc độ 2 mL/phút Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2 mL/phút

1mL máu, nước tiểu được thêm chuẩn và chuẩn nội, thêm 50 μL NaOH 1 M và lắc siêu âm 5 phút, ly tâm Thêm 3 mL dung môi chiết (x 2 lần) lắc xoáy 5 phútl, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, lấy lớp dịch phía trên

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.3.1 Độ phù hợp của hệ thống sắc ký

Độ phù hợp của hệ thống sắc ký được xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký Hệ thống sắc ký có độ phù hợp khi độ lệch chuẩn tương đối (RSD - %) của diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm trong cùng một mẫu không lớn hơn 2,00 %

2.3.3.2 Độ đặc hiệu, chọn lọc

Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp, chuẩn bị mẫu trắng máu, mẫu trắng nước tiểu; mẫu chuẩn cùng với mẫu trắng máu và mẫu trắng nước tiểu thêm chuẩn KET, NK

Tiến hành phân tích và so sánh phổ của KET, NK trên các mẫu Mẫu trắng không được có tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn

2.3.3.3 Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu:

- Lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp với đối tượng thử, trong nghiên cứu này các đường chuẩn trên nền máu và nước tiểu

- Pha dãy chuẩn có nồng độ từ 10 đến 500 ng/mL trên nền mẫu trắng

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền Đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) bằng 3

Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền Thông thường, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ được xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10

Trong nghiên cứu này, LOD, LOQ được xác định bằng cách thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp và xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị

2.3.3.5 Độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)

Đánh giá độ đúng – độ lặp lại ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao Chuẩn

bị đường chuẩn, các mẫu máu, nước tiểu mỗi nồng độ chuẩn bị 5 mẫu Trong cùng một ngày, tiến hành xử lý và phân tích sắc ký các mẫu song song với đường chuẩn Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic

* Độ đúng (%) được tính theo công thức:

Độ đú𝑛𝑔 (%) = 𝑐𝑡𝑡

(𝐶𝑙𝑡)× 100 (2.1) Trong đó: Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu được (tính theo đường

chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm vào

*Độ lặp lại của phương pháp được xác định thông qua độ lệch chuẩn (SD) và

độ lệch chuẩn tương đối (RSD - %) theo các công thức sau:

28

𝑅𝑆𝐷 (%) = 𝑆𝐷

𝑋𝑡𝑏× 100 (2.2); 𝑆𝐷 = √∑ (𝑋𝑖−𝑋𝑡𝑏)2

𝑛 𝑖=1

𝑛−1 (2.3) Trong đó: Xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ ‘i’

Xtb: Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm n: Số lần thử nghiệm

SD: Độ lệch chuẩn

Để xác định độ đúng, độ lặp lại của phương pháp, chuẩn bị các mẫu máu, nước tiểu trắng thêm chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm lặp lại 5 lần, xử lý mẫu, phân tích sắc ký và tính độ thu hồi, độ lặp lại theo các công thức trên

2.3.3.6 Hiệu suất chiết

Khảo sát hiệu suất chiết đối với KET, NK tại 3 mức nồng độ thấp, trung bình

và cao Chuẩn bị mẫu máu và mẫu nước tiểu chứa các chất chuẩn ở nồng độ 10, 100,

500 ng/mL, tiến hành chiết theo quy trình đã xây dựng Hiệu suất chiết được tính bằng tỉ số trung bình của tỉ lệ diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội trong mẫu máu, nước tiểu qua quá trình chiết xuất với tỉ lệ diện tích pic của chất chuẩn và chuẩn nội không qua quá trình chiết xuất

2.3.3.7 Độ ổn định

Xác định độ ổn định của các chất phân tích trong dịch sinh học với thời gian bảo quản 3 ngày Chuẩn bị các mẫu trắng thêm chuẩn ở ba mức nồng độ 10, 100, 500 ng/mL, bảo quản trong tủ lạnh 3 ngày ở nhiệt độ 2 – 4 oC Sau 3 ngày, lấy các mẫu đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành đo sắc ký

Để đánh giá độ ổn định của chất phân tích, tiến hành thêm hỗn hợp chuẩn vào mẫu trắng ở các hàm lượng thấp, trung bình, cao và bảo quản các mẫu trên trong tủ lạnh 3 ngày ở nhiệt độ 2 – 4 oC Tiến hành phân tích các mẫu bảo quản trên theo quy trình đã xây dựng Với lô mẫu ban đầu tiến hành phân tích ngay khi mẫu được chuẩn

bị xong So sánh hàm lượng của KET và NK trong các mẫu được phân tích ngay với các mẫu được bảo quản để đánh giá độ ổn định của chất phân tích qua trình bảo quản

Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu và được phân tích bằng phương pháp GC-MS đã xây dựng Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần (n = 3) và tính kết quả trung bình Phương pháp định lượng là phương pháp đường chuẩn

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả tích phân diện tích và định lượng được xử lý theo phần mềm Mass Hunter của thiết bị GC-MS

Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào các hàm

số trong phần mềm Microsoft Excel 2010

30

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250 oC

- Thể tích tiêm mẫu 1 μL với bộ tiêm mẫu tự động

- Chế độ tiêm mẫu không chia dòng (splitless)

- Khí mang: Heli, tốc độ dòng 1 mL/phút

- Chương trình nhiệt độ: bắt đầu 150 oC giữ 3 phút, tăng 40 oC /phút đến

200 oC giữ 1 phút, tăng 10 oC/phút đến 290 oC giữ 6 phút

- Nhiệt độ đầu cột: 270 oC

 Điều kiện xác định bằng MS:

- Nguồn ion hóa: EI 70 eV

- Nhiệt độ nguồn ion: 230 oC

- Nhiệt độ tứ cực: 150 oC

3.1.2 Khảo sát khối phổ của KET, NK và KET-d4

Khối phổ, thời gian lưu của KET, NK và KET-d4 được khảo sát như sau: Lấy 100 μL dung dịch chuẩn KET, NK và chuẩn nội KET-d4 1 μg/mL vào ống nghiệm Bay hơi dung môi bằng khí nitơ tới cắn ở nhiệt độ phòng Cắn được hòa tan trong 100 μL ethyl acetat rồi tiến hành phân tích bằng thiết bị GC-MS ở chế độ quét phổ “full scan” Điều kiện sắc ký như mục 3.1.1

Sắc ký đồ và phổ khối lượng của các chất phân tích được trình bày ở Hình 3.1

31

a1 Phổ khối lượng của NK a2 Sắc ký đồ của NK

b1 Phổ khối lượng của KET b2 Sắc ký đồ của KET

c1 Phổ khối lượng của KET-d4 c2 Sắc ký đồ của KET-d4

Hình 3.1 Phổ khối lượng và sắc ký đồ của chuẩn

Thời gian lưu, các mảnh phổ chính của NK, KET và KET-d4 được thể hiện trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Thời gian lưu và mảnh phổ ion của các chất nghiên cứu