Xác định hàm lượng chlorate và perchlorate trong mẫu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC MS MS

Nghiên cứu khoa học Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Huỳnh Thị Ngọc Liên*, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy sản vùng 6, Cần Thơ, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 02/08/2022; Ngày chấp nhận đăng: 26/09/2022) Tóm tắt Phương pháp xác định chlorate perchlorate mẫu cá tra dùng kỹ thuật LC-ESIMS/MS phát triển thành công Dư lượng chlorate perchlorate mẫu chiết dung dịch methanol acid hóa với acid formic 1% Sau đó, dịch chiết làm bột C18, sử dụng cột pha thuận để tách chlorate perchlorate định lượng thiết bị LC-ESI-MS/MS Kết xác nhận giá trị sử dụng phương pháp cho thấy độ đặc hiệu tốt, đường chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ 0,0005 - 0,015 mg/L; giới hạn định lượng (LOQ) 0,005 mg/kg; độ thu hồi từ 91 đến 109% độ tái lập khoảng 6,4 đến 9,5% đáp ứng theo yêu cầu SANTE Phương pháp áp dụng để phân tích thực tế, tổng số 427 mẫu cá tra phi lê thu thập từ nhà máy chế biến thủy sản, có 76 mẫu phát chlorate tương đương tỉ lệ 18% Nồng độ chlorate phát khoảng từ 0,43 - 253 mg/kg Từ khóa: Chlorate perchlorate, LC -MS/MS, cá tra ĐẶT VẤN ĐỀ Chlorate perchlorate (Hình 1) anion có cơng thức phẩn tử ClOB ClOC Chlorate hình thành sản phẩm phụ sử dụng chlorine, chlor dioxide hypochlorite để khử trùng nước uống, nước dùng sản xuất thực phẩm bề mặt tiếp xúc với thực phẩm [1] Trong đó, Perchlorate xuất tự nhiên môi trường, dạng trầm tích nitrat kali, hình thành khí kết tủa vào đất nước ngầm Nó xuất chất gây nhiễm môi trường phát sinh từ việc sử dụng phân bón nitrat sản xuất, sử dụng thải bỏ amoni pechlorate sử dụng thuốc phóng tên lửa, chất nổ, pháo hoa, pháo sáng máy bơm túi khí quy trình cơng nghiệp khác Perchlorate hình thành q trình phân hủy natri hypoclorit sử dụng để khử trùng nước gây nhiễm nguồn nước Đất phân bón coi nguồn tiềm ẩn gây ô nhiễm perchlorate thực phẩm [2] * Điện thoại: 0908 619 997 474 Email: ngoclienct@gmail.com Vietnam Journal of Food Control - vol 5, no 2, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cơ Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy Hình Cơng thức cấu tạo chlorate perchlorate Trong báo cáo khoa học “Nguy sức khỏe cộng đồng liên quan dư lượng Chlorate thực phẩm” Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) năm 2015, EFSA phát mức dư lượng Chlorate nước thực phẩm cao gây tác động đến việc hấp thụ Iodine - đặc biệt nhóm trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Việc hấp thụ nhiều chlorate ngày gây độc cho người hạn chế khả hấp thụ oxy máu, dẫn đến suy thận [3, 4] Perchlorate chất tiềm ẩn gây ung thư, chứng minh cản trở hấp thụ iodide tuyến giáp, hạn chế khả sản xuất hormone tuyến giáp Các nghiên cứu gần tác động tăng trưởng phát triển nồng độ thấp, đặc biệt phát triển hệ thần kinh [5, 6] Trong quy định Liên minh Châu Âu Chỉ thị số (EU) 2020/749 ngày 04/6/2020 (sửa đổi Phụ lục III, Chỉ thị số 396/2005 qui định mức dư lượng tối đa (MRL) Chlorate số sản phẩm), dư lượng cho phép thủy sản sản phẩm thủy sản chưa quy định cụ thể Tuy nhiên, mức giới hạn mặc định áp dụng mức MRL 0,01 mg/kg Hiện nay, nhiều phương pháp sử dụng để xác định chlorate perchlorate bao gồm: sắc ký ion (IC) [7], chuẩn độ điện [8] phổ biến sắc ký khối phổ (LCMS) Trong phương pháp sắc ký khối phổ chlorate perchlorate xác định trực tiếp từ dung dịch chiết tách sử dụng thuốc thử ghép cặp ion [9] để chuyển chất phân tích thành hợp chất khác sau phân tích thiết bị khối phổ Đối với phương pháp sắc ký ion, chuẩn độ điện Giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp cao, không đáp ứng giá trị MRL theo yêu cầu, chẳng hạn: theo phương pháp chuẩn độ điện [8] LOQ từ - 50 mg/kg, sắc ký ion [7] LOQ 0,03 mg/kg cao giá trị MRL quy định 0,01 mg/kg Trong phương pháp sắc ký khối phổ có độ nhạy cao nhiều với LOQ từ 0,001 0,01 mg/kg [10, 11] Tháng năm 2019, Phòng Kiểm nghiệm Kiểm chứng Thuốc bảo vệ thực vật Châu Âu Đức cơng bố phương pháp phân tích thuốc bảo vệ thực vật có độ phân cực cao thực phẩm có nguồn gốc từ động vật LC-MS/MS [10] Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng mẫu trứng gà tất loại sữa bò cho chlorate perchlorate với LOQ 0,01 mg/kg cho chất Đến phương pháp chưa công bố liệu xác nhận giá trị sử dụng mẫu cá Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng năm 2022, Việt Nam có 14 lơ hàng cá tra phi lê đông lạnh bị quan thẩm quyền Đức Áo cảnh báo phát dư lượng Chlorate mức cao từ 1,13 mg/kg đến 44,3 mg/kg [12] Do đó, việc phát triển phương pháp xác định chlorate perchlorate có độ nhạy đáp ứng quy định MRL Châu Âu cần thiết, Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 475 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … nhằm đảo bảo chất lượng sản phẩm sức khỏe người tiêu dùng, hạn chế rủi ro hàng thủy sản Việt Nam xuất bị thị trường nhập trả Qua tham khảo tài liệu [10-14] khảo sát từ thực tế, phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ nghiên cứu để phân tích dư lượng chlorate perchlorate tồn dư cá tra Phương pháp xác định chlorate perchlorate trực tiếp từ dung dịch chiết tách sau làm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu báo dư lượng chất chlorate perchlorate tồn dư mẫu cá tra Các mẫu thử dùng nghiên cứu có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản tỉnh An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Tiền Giang Vĩnh Long Mẫu trắng mẫu cá tra phi lê từ mẫu cá tra nguyên lấy từ vùng ni cá tra Cần Thơ Q trình nuôi không sử dụng sản phẩm chứa chlor, chlor dioxide hypochlorite để khử trùng 2.2 Hóa chất, chất chuẩn Các hóa chất, chất chuẩn sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết dùng phân tích phù hợp cho kỹ thuật LC-MS/MS Chất chuẩn chlorate perchlorate có nồng độ 1.000 mg/L (số lơ BCCD9678-73166, BCCD8713-76462) cung cấp từ hãng Sigma (Mỹ) Dung dịch chuẩn trung gian chuẩn làm việc chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc nằm khoảng 0,001 - 0,02 mg/L Dung mơi hóa chất khác sử dụng loại dùng cho kỹ thuật LC-MS/MS cung cấp từ hãng Merck (Đức) gồm: methanol (MeOH), acetonitrile (ACN), acid formic (FA), amoni formate (AF), nước cất Bột C18 loại endcap, kích thước hạt nhỏ 70 µm cung cấp từ hãng Agilent (Mỹ) 2.3 Thiết bị dụng cụ phụ trợ Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS), thiết bị gồm hệ sắc ký lỏng siêu hiệu cao Acquity H-Class Plus kết nối với detector khối phổ Xevo TQ-S micro hãng Waters (Mỹ) Một số thiết bị phụ trợ khác như: máy lắc ống nghiệm Glas-Col (Mỹ), máy ly tâm Rotixa 500 RS Hettich (Đức), bể siêu âm Elma (Đức), cân phân tích Sartorius CPA 225D (độ xác 0,1 mg) thiết bị, dụng cụ thơng thường khác phịng thí nghiệm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Khảo sát điều kiện tối ưu hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Để tối ưu hóa điều kiện phân tích, tiêm trực tiếp hỗn hợp chuẩn chlorate perchlorate nồng độ 0,01 µg/mL vào detector khối phổ (MS/MS) với nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) 476 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy âm Quá trình tối ưu hóa thực phần mềm Masslynx 4.2 Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử (ion mẹ) thành ion con, lựa chọn ion có cường độ tín hiệu cao để định lượng ion có cường độ thấp để định tính Việc tối ưu hóa điều kiện phân mảnh cho thu ion mẹ hai ion Đối với điều kiện sắc ký lỏng (LC), sử dụng cột Torus DEA 100 , 1,7 àm (2,1 mm ì 100 mm) ca hãng Waters, thành phần pha động gồm 0,9% FA ACN 0,9% FA 50 mM AF tiến hành khảo sát chương trình pha động 2.4.2 Khảo sát, đánh giá quy trình xử lý mẫu Sử dụng mẫu trắng, thêm chất chuẩn cần phân tích vào mẫu trắng tiến hành xử lý mẫu theo quy trình khảo sát Sau đánh giá tiêu chí độ thu hồi, độ lặp lại so với quy định SANTE [15] Dựa vào phương pháp tham khảo [10-14] quy trình xử lý mẫu lựa chọn sau: cân g mẫu trắng đồng vào ống ly tâm nhựa 50 mL, thêm 0,5 mL chuẩn hỗn hợp chlorate perchlorate µg/mL, lắc để yên 15 phút Thêm 10 mL 1% FA methanol, lắc mạnh siêu âm 15 phút Ly tâm phút tốc độ 4.500 vòng/phút, hút mL lớp cho vào ống ly tâm nhựa 15 mL chứa 100 mg bột C18 Lắc phút sau ly tâm phút tốc độ 4.500 vòng/phút Lọc dịch chiết qua màng lọc mẫu có đường kính lỗ 0,20 đến 0,22 µm vào lọ đựng mẫu, pha loãng 0,2 mL dịch chiết sau lọc với 0,8 mL nước cất tiến hành xác định thiết bị LC-MS/MS 2.4.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng theo Hướng dẫn số SANTE/11312/2021 [15] Châu Âu phê duyệt phương pháp thuốc bảo vệ thực vật Các thông số đánh giá gồm: độ đặc hiệu; độ tuyến tính đường chuẩn; ảnh hưởng mẫu; giới hạn phát định lượng; độ chụm thông qua độ lặp lại, độ tái lập nội bộ; độ thông qua độ thu hồi tỉ lệ ion 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu thống kê phần mềm Microsoft Excel 2010 Hàm lượng chlorate perchlorate cá tra tính phần mềm Masslynx 4.2 thiết bị sắc ký lỏng khối phổ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích thiết bị LC-MS/MS 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện detector khối phổ Thiết bị khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hóa phun điện tử, chế độ ion âm sử dụng để khảo sát điều kiện tối ưu ion mẹ ion Kết trình bày Bảng Các thơng số phân tích khối phổ tối ưu khác gồm: điện đầu phun mao quản 0,42 kV; nhiệt độ nguồn ion hóa: 150°C; nhiệt độ khí hóa 400°C; tốc độ dịng khí hóa 800 L/h, lượng định hướng ion vào 0,5 V Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 477 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … Bảng Điều kiện phân mảnh ion mẹ ion Ion Ion mẹ Chất phân tích Cone (V) CE (eV) Ghi (m/z) (m/z) Định lượng 66,9 12 Chlorate 82,9 85 Định tính 50,9 16 (13,4%)* 82,9 20 Định lượng Perchlorate 98,9 60 66,9 30 Định tính (6,2%)* * Tỉ lệ tương đối ion định tính so với ion định lượng 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký Sau lựa chọn ion mẹ, ion điều kiện tối ưu, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp chlorate perchlorate có nồng độ 10 ng/mL Trên sở tham khảo phương pháp [10-14] điều kiện thực tế, thành phần pha động gồm Kênh A (70%) dung dịch hỗn hợp 0,9% FA ACN, Kênh B (30%) dung dịch hỗn hợp 0,9% FA 50 mM AF Cột sử dụng cột Torus DEA 100 , (1,7 àm ì 2,1 mm ì 100 mm) Tốc độ dịng 0,32 mL/phút thể tích tiêm 10 µL Thời gian phân tích khoảng phút chuan_Nenca_1ppb F1:MRM of channels,ES82.9 > 66.9 8.992e+003 Chlorate 3.01 5.98e2 8781 100 % 1.84 1.98 6.12 chuan_Nenca_1ppb Chlorate 3.03 7.85e1 1199 100 % 0.03 0.22 1.98 1.86 0.39 2.20 2.25 2.59 2.73 5.91 4.06 4.15 4.52 m in chuan_Nenca_1ppb F2:MRM of channels,ES98.9 > 82.9 2.659e+005 Perchlorate 1.98 1.21e4 252530 100 % m in F1:MRM of channels,ES82.9 > 50.9 1.229e+003 6.12 0.32 m in chuan_Nenca_1ppb F2:MRM of channels,ES98.9 > 66.9 1.856e+004 Perchlorate 1.99 8.17e2 17443 100 % 0.28 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 6.14 4.24 3.35 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 m in Hình Sắc ký đồ chất chuẩn chlorate chuẩn perchlorate 1µg/L pha hỗn hợp methanol nước tỉ lệ 20 : 80 theo thể tích Hình thể sắc ký đồ chuẩn chlorate perchlorate pha hỗn hợp dung môi methanol nước Hình dạng pic sắc ký đồ thu nhọn, đối xứng có độ phân giải tốt Thời gian lưu Perchlorate Chlorate 1,99 3,02 phút Vì vậy, chứng minh điều kiện sắc ký lỏng lựa chọn phù hợp để xác định chất phân tích 478 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy 3.2 Đánh giá quy trình xử lý mẫu Dựa quy trình xử lí mẫu nêu mục 2.4.2, đánh giá độ lặp lại độ thu hồi mẫu trắng thêm chuẩn mức 0,1 mg/kg với hai tiêu chlorat perchlorate Kết thể Bảng Bảng Kết phân tích đánh giá quy trình xử lí mẫu Mẫu Nồng độ mẫu thêm chuẩn (mg/kg) 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 Kết thu (mg/kg) Độ thu hồi (%) Độ lặp lại (%) Chlorate Perchlorate Chlorate Perchlorate Chlorate Perchlorate 0,095 0,099 0,092 0,099 0,095 0,098 0,098 0,093 0,092 0,098 95,15 98,50 92,33 98,94 95,15 97,60 98,38 93,07 92,03 97,60 3,25 3,07 Kết Bảng cho thấy độ thu hồi chlorate perchlorate lớn hoăc 92 %; độ lặp lại 3,25 3,07% đáp ứng yêu cầu SANTE [15] EU/2021/808 [16] Kết chứng minh quy trình phân tích mẫu phù hợp để xác định Perchlorate Chlorate mẫu cá tra 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 3.3.1 Độ đặc hiệu Đánh giá độ đặc hiệu phương pháp thơng qua tiêu chí sau: - Theo thiết bị phân tích: tính số điểm nhận diện IP (IP - Identification point) Mỗi ion mẹ điểm, ion 1,5 điểm Kết thu tiến hành phân tích chuẩn, mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn cho thấy chlorate perchlorate có ion mẹ (1 điểm), ion (3 điểm), kỹ thuật LC-MS/MS tính điểm nên tổng số điểm IP điểm, thỏa mãn yêu cầu đối với phương pháp LC-MS/MS theo quy định [15-16] - Theo quy trình xử lý mẫu: phân tích mẫu trắng thêm chuẩn nồng 0,005 mg/kg theo phương pháp xây dựng Kết sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn (Hình 4) cho thấy thời gian lưu perchlorate chlorate 1,99 3,02 phút với thời gian lưu mẫu chuẩn Hình Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 479 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … blank_ca % F1:MRM of channels ,ES82.9 > 66.9 1.267e+002 1.82 100 1.94 1.02 1.05 1.56 1.50 0.73 0.17 0.39 2.13 2.86 2.17 2.91 3.26 3.31 3.38 3.20 4.41 3.84 6.09 4.86 5.25 4.60 4.15 4.21 6.03 5.61 6.24 6.44 m in blank_ca 0.34 100 F1:MRM of channels ,ES82.9 > 50.9 1.824e+001 5.42 3.27 % 0.02 1.89 1.22 1.83 0.55 3.70 2.63 5.62 4.28 6.37 m in blank_ca 0.78 100 % 5.80 1.98 1.11 1.28 0.11 F2:MRM of channels ,ES98.9 > 82.9 5.382e+003 0.34 0.40 1.73 2.15 2.34 2.48 2.83 3.12 3.47 3.53 3.83 4.15 4.55 4.72 5.78 5.17 5.24 5.43 6.02 6.19 6.38 m in blank_ca 0.79 100 1.08 0.28 0.58 1.97 1.18 1.41 3.42 1.79 2.78 2.24 % 2.86 3.14 3.83 3.64 4.07 4.31 F2:MRM of channels ,ES98.9 > 66.9 3.381e+002 5.99 6.09 5.48 5.61 6.31 4.65 4.85 5.00 5.04 5.84 6.45 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 m in 6.00 Hình Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng s pike_Ca_5ppb % 1.86 0.05 1.98 0.92 F1:MRM of channels ,ES82.9 > 66.9 5.848e+003 Chlorate 3.02 3.79e2 5719 100 m in s pike_Ca_5ppb F1:MRM of channels ,ES82.9 > 50.9 7.120e+002 Chlorate 3.01 4.56e1 703 100 % 0.08 1.98 1.86 2.20 2.43 0.34 2.74 6.14 5.72 3.31 3.19 4.41 3.30 4.58 4.67 5.13 5.34 5.53 5.94 6.10 6.43 m in s pike_Ca_5ppb F2:MRM of channels ,ES98.9 > 82.9 1.404e+005 Perchlorate 1.98 6.53e3 129384 100 % 0.32 6.13 4.76 1.80 m in s pike_Ca_5ppb F2:MRM of channels ,ES98.9 > 66.9 1.031e+004 Perchlorate 1.99 5.47e2 9938 100 % 0.09 0.32 0.46 0.62 0.50 1.00 2.42 1.80 1.05 1.50 2.00 2.50 3.11 3.32 3.00 3.49 3.50 4.17 4.37 4.00 4.62 4.50 5.16 5.00 5.45 5.50 5.86 6.12 6.00 m in Hình Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ 0,0005 mg/kg với yếu tố pha loãng (f = 10) Hơn nữa, sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3, thời điểm 3,02 phút trùng với thời gian lưu chlorate không xuất pic có mảnh phổ khối m/z = 82,9>66,9 (mảnh đặc trưng chlorate) thời điểm 1,98 phút có xuất pic có mảnh phổ khối m/z = 98,9 > 82,9 (mảnh đặc trưng perchlorate) cường độ nhỏ 10 % Mức cho phép theo yêu cầu SANTE nhỏ 30% [15] Do đó, phương pháp phân tích chlorate perchlorate có độ đặc hiệu cao, phù hợp theo quy định phương pháp sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS [15-16] 3.3.2 Độ tuyến tính đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng theo phương pháp thêm chuẩn Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng với mức nồng độ khoảng từ 0,0005 - 0,015 mg/L Đường chuẩn xây dựng theo phụ thuộc độ đáp ứng (tổng diện tích ion định lượng định tính) chất ứng với nồng độ Việc xây dựng đường chuẩn thực theo phần mềm 480 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy thiết bị theo phương trình hồi quy tuyến tính Các kết cho thấy, khoảng khảo sát có tuyến tính độ đáp ứng nồng độ, phương trình hồi quy thu chlorate y = 1035x + 24,71 với hệ số tương quan r2 > 0,999, perchlorate y = 18903x + 157 với r2 > 0,999 độ chệch cho mức nồng độ nhỏ ± 10 % (Hình 5) Hình Đường chuẩn chlorate perchlorate mẫu trắng cá 3.3.3 Đánh giá ảnh hưởng mẫu Ảnh hưởng phương pháp đánh giá thông qua so sánh đường chuẩn pha pha động mẫu khoảng nồng độ 0,0005 - 0,015 mg/L Kết đường biểu diễn độ tuyến tính phương trình đường chuẩn thể Hình Hệ số góc đường chuẩn lệch tương ứng 47,90 52,94 % chlorate perchlorate vượt mức cho phép 20% theo quy định SANTE [15] Như kết luận mẫu có ảnh hưởng đáng kể đến kết phân tích Do đó, phân tích chlorate perchlorate mẫu thực đường chuẩn phải xây dựng kết hợp với mẫu 3.3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát xác định sở phân tích lặp lại 20 mẫu trắng, tính tín hiệu nhiễu trung bình mẫu trắng Giới hạn phát tín hiệu trung bình cộng với lần độ lệch chuẩn 20 mẫu trắng Sau đó, thẩm tra giá trị LOD cách thêm chuẩn vào mẫu trắng nồng độ tính tốn được, LOQ xác định khoảng từ đến lần LOD Kết cho thấy nồng độ thẩm tra LOD = 0,0025 mg/kg, LOQ = 0,005 mg/kg; tỉ lệ S/N ion LOD > 3, LOQ > 10 tỉ lệ ion tương đối so với chuẩn nhỏ ± 30%, Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 481 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … kết thu đáp ứng yêu cầu SANTE [15] Vì vậy, LOD LOQ phương pháp 0,0025 mg/kg 0,005 mg/kg cho chất chlorate perchlorate Perchlorate Chlorate 300000 250000 200000 150000 100000 50000 20000 y = 1035.4x + 17.647 R² = 0.9999 15000 10000 y = 700.09x + 25.545 R² = 0.9999 5000 0 10 15 20 y = 18907x + 112.11 R² = 0.9999 y = 12362x + 634.61 R² = 0.9999 10 15 Linear (Pha thuốc thử) Linear (Pha thuốc thử) Linear (Pha cá) Linear (Pha cá) 20 Hình Đường chuẩn chlorate perchlorate pha pha động mẫu cá Hình Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn LOQ = 0,005 µg/kg 3.3.5 Độ chụm độ Độ chụm phương pháp đánh giá thông qua độ lặp lại độ tái lập nội (thực hai kiểm nghiệm viên khác nhau) Tiến hành thực đánh giá cách thêm chuẩn vào mẫu trắng ba mức nồng độ 0,005, 0,01 0,05 mg/kg, nồng độ phân tích lần lặp lại theo quy trình xây dựng Kết tổng hợp đánh giá độ chụm độ trình bày Bảng Các kết cho thấy: độ lặp lại khoảng 3,90 đến 6,70% từ 3,92 đến 6,19% cho chlorate perchlorate; độ tái lập khoảng từ 6,37 đến 9,50% từ 5,62 đến 7,23% cho chlorate perchlorate Độ đánh giá thông qua độ thu hồi Độ thu hồi xác định cách thêm chuẩn vào mẫu trắng ba mức nồng độ 0,005, 0,01 0,05 mg/kg, nồng độ phân tích lần lặp lại theo quy trình xây dựng Kết độ thu hồi chlorate đạt từ 91,35 đến 109,05% perchlorate từ 94,16 đến 103,52% (Bảng 3) 482 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy Bảng Dữ liệu độ chụm độ phương pháp Chlorate Perchlorate Nồng độ 0,005 0,01 0,05 0,005 0,01 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Độ lặp lại (RSDr), % 6,70 5,44 3,90 6,19 4,71 Độ tái lập (RSDR), % 9,50 6,80 6,37 7,23 6,52 Độ thu hồi, % 91,35 96,33 109,05 94,16 97,33 0,05 mg/kg 3,92 5,62 103,52 3.3.6 Độ lệch tỉ lệ ion tương đối Từ mẫu phân tích đánh giá độ chụm độ đúng, tính tỉ lệ ion tương đối (phần trăm diện tích ion định tính chia cho diện tích ion định lượng) Kết cho thấy, độ lệch tỉ lệ ion tương đối chorate nằm khoảng từ -9,70 đến 7,46% perchlorate từ -12,12 đến 6,06% (Bảng 4), nằm khoảng cho phép ± 30% theo SANTE [15] Bảng Kết độ lệch tỉ lệ ion tương đối so với chất chuẩn Độ lệch tỉ lệ ion tương đối (%) Nồng độ (mg/kg) Chlorate Perchlorate 0,005 - 9,70 ÷ 2,24 - 12,12 ÷ 1,52 0,01 - 8,96 ÷ 7,46 - 6,06 ÷ 6,06 0,05 - 2,24 ÷ 6,72 - 7,58 ÷ 1,52 3.3.7 Tổng hợp kết xác nhận giá trị sử dụng phương pháp bàn luận Kết đánh giá thông số độ đặc hiệu; độ tuyến tính đường chuẩn; ảnh hưởng mẫu; giới hạn phát giới hạn định lượng; độ chụm thông qua độ lặp lại, độ tái lập nội bộ; độ thông qua độ thu hồi tỉ lệ ion tổng hợp Bảng 2 Bảng Tổng hợp kết xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Theo quy Kết TT định Đánh giá kết SANTE/ Thông số Chlorate Perchlorate 11312/2021 Độ đặc hiệu < 10 % ≤ 30 % Đáp ứng yêu cầu LOQ Độ tuyến tính < 10 % < 10 % ≤ ± 20 % Đáp ứng yêu cầu đường chuẩn - Độ chệch nồng độ tính ngược cho mức nồng độ 47,90 % 52,94 % Ảnh hưởng ≤ ± 20 % Có ảnh hưởng mẫu mẫu đến q trình phân tích Nên Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 483 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … TT Thông số Giới hạn định lượng - LOQ 5.1 Độ chụm Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (RSDr) (%) Độ lệch chuẩn tái lập tương đối (RSDR) (%) Độ thu hồi (%) Tỉ lệ ion Số ion Độ lệch tỉ lệ ion tương đối (%) 5.2 7.1 7.2 Kết Chlorate Perchlorate Theo quy định SANTE/ 11312/2021 Đánh giá kết phân tích chlorate perchlorate đường chuẩn phải xây dựng kết hợp với mẫu Đáp ứng yêu cầu 0,005 mg/kg 0,005 mg/kg ≤ MRL (0,01 mg/kg) 3,90 - 6,70 3,92 - 6,19 ≤ ± 20 Đáp ứng yêu cầu 6,37 - 9,50 5,62 - 7,23 ≤ ± 20 Đáp ứng yêu cầu 91,4 - 109 94,2 - 104 70 - 120 Đáp ứng yêu cầu -9,70 ÷ 7,46 -12,12 ÷ 6,06 ± 30 Đáp ứng yêu cầu Kết đánh giá thông số phương pháp đáp ứng yêu cầu SANTE [15] giá trị LOQ phương pháp nhỏ mức MRL theo quy định Liên minh EU Chỉ thị số (EU) 2020/749 ngày 04/6/2020 Điều khẳng định phương pháp thích hợp để sử dụng phân tích chlorate perchlorate mẫu cá tra 3.4 Kết phân tích mẫu thực tế Trên sở phương pháp xác nhận giá trị sử dụng đạt theo yêu cầu SANTE, nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích mẫu từ nhà máy chế biến thủy sản để xác định dư lượng chlorate perchlorate tồn dư sản phẩm cá tra phi lê Tổng số mẫu phân tích 427 mẫu phân bố sau: An Giang 281 mẫu, Bến Tre mẫu, Cần Thơ 32 mẫu, Đồng Tháp 82 mẫu, Hậu Giang mẫu, Tiền Giang 13 mẫu Vĩnh Long mẫu Kết phân tích cho thấy (Hình 8) có 76 mẫu phát chlorate tổng số 427, chiếm tỉ lệ 18 % Nồng độ chlorate phát khoảng từ 0,43 mg/kg đến 253 mg/kg hàm lượng mẫu nhiễm chlorate vượt ngưỡng MRL cho phép thị số (EU) 2020/749 484 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Số lượng mẫu Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy 450 400 350 300 250 200 150 100 50 Tổng số mẫu 427 Mẫu nhiễm 76 (18%) Tổng số mẫu Mẫu nhiễm Hình Kết phân tích mẫu thực tế KẾT LUẬN Nhóm nghiên cứu thành công việc xây dựng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) để phân tích dư lượng chlorate perchlorate tồn dư cá tra mức giới hạn định lượng đáp ứng yêu cầu kiểm soát theo ngưỡng quy định MRL Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu/độ chọn lọc cao, độ tuyến tính đường chuẩn, độ chụm độ đáp ứng yêu cầu SANTE [15] Phương pháp áp dụng phân tích chlorate perchlorate mẫu cá tra phi lê tỉnh An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Tiền Giang Vĩnh Long Kết phân tích phát 18% mẫu bị nhiễm vượt ngưỡng MRL cho phép thị số (EU) 2020/749 LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, phịng ban Trung tâm Chất lượng nơng lâm thủy sản vùng tạo điều kiện hỗ trợ nhóm thực đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] European Commission, https://ec.europa.eu/food/ [Accessed 15/06/2022] "Chlorate," 2015 [Online] Available: plants/pesticides/maximum-residue-levels/chlorate_en [2] European Commission, " Perchlorate," 2015 [Online] Available: https://ec.europa.eu/food/ safety/chemical-safety/contaminants/catalogue/perchlorate_en [Accessed 15/06/2022] [3] Chain ESFA Panel on Contaminants in the Food, "Risks for public health related to the presence of chlorate in food," EFSA Journal., vol 13, no 6, p 4135, 2015 [4] National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department, Report on results of investigation, monitoring to determine the cause and remedy of chorate contamination in frozen pangasius processing, Hanoi, 2020 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 485 Xác định hàm lượng chlorate perchlorate mẫu cá tra … [5] Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), 2014, "Public health statement perchlorate," 2014 [Online] Available: https://atsdr.cdc.gov/ToxProfiles/ tp162-c1-b.pdf [Accessed 27/06/2022] [6] European Food Safety Authority (EFSA), "Scientific Opinion on the risk to public health related to the presence of perchlorate in food, in particular fruits and vegetables," EFSA Journal., vol 12, no 10, p 3869, 2014 [7] TCVN 6494-4:2000, Water quality - Determination of dissolved anions by liquid chromatography of ions Part 4: Determination of chlorate, chloride and chlorite in water with low contamination, Directorate for standards, metrology and quality, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Ministry of Science and Technology, 2000 [8] D V Girenko, A A Girenko, and N V Nikolenko, "Potentiometric determination of Chlorate Impurities in Hypochlorite Solutions," International Journal of Analytical Chemistry., vol 2019, pp 1-7 [9] W Tiyapongpattana, T Chaida, and N Youngvises, "Ion-Interaction Chromatography with Ion-Trap Mass Spectrometry Detection for the Analysis of Perchlorate in Drinking and Natural Waters," Science & Technology Asia, vol 23, no 3, pp 35-43, 2018 [10] M Anastassiades, D I Kolberg, A Benkenstein, E Eichhorn, S Zechmann, D Mack, C Wildgrube, I Sigalov, D Dörk, A Barth, S Gorrlich, and G Cerchia, "Quick Method for the Analysis of Numerous Highly Polar Pesticides in Foods Involving Extraction with Acidified Methanol and LC-MS/MS Measurement, Food of Animal Origin (QuPPe-AO-Method), EU Reference Laboratory for Single Residue Methods," 2017 [Online] Available: https://www.eurl-pesticides.eu/userfiles/file/meth_QuPPe _AO_V3_2.pdf [Accessed Jun 2022] [11] J De-Alwis, E Ross, and S Adams, "Determination of Chlorate and Perchlorate in Infant Milk Using a Waters BEH DEA Column and UPLC-MS/MS," Waters Corporation, September 2019 [Online] Available: https://gcms.cz/labrulez-bucke [Accessed 15/06/2022] [12] European Commission, "RASFF Window," 20 June 2022 [Online] Available: https://webgate.ec.europa.eu/raff-window/screen/search [Accessed 01/07/2022] [13] P Constantinou, D Louca-Christodoulou, and A Agapiou, "LC-ESI-MS/MS determination of oxyhalides (chlorate, perchlorate and bromate) in food and water samples, and chlorate on household water treatment devices along with perchlorate in plants," Elsevier, Chemosphere, vol 235, pp 757-766, 2019 [14] B Wuyts, and E Ross, "Overcoming the challenges of Anionic Polar Pesticides Analysis in Food," 2018 [Online] Available: https://www.waters.com/webassets/ cms/events/EHQ_ Polar_PesticidesIII_Webinar_Slides_2018 [Accessed 23/08/2022] 486 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - tập 5, số 3, 2022 Huỳnh Thị Ngọc Liên, Cô Hồng Sơn, Nguyễn Văn Luy [15] European Commission, Guidance Document on Analytical Quality Control and Method Validation Procedures for Pesticides Residues Analysis in Food and Feed, SANTE/11312/2021, 2021 [16] European Commission 2021 Commission implementating regalation (EU) 2021/808 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food-producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC Official Journal of the European Union L180/84 Determination of chlorate and perchlorate in pangasius samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) Huynh Thi Ngoc Lien, Co Hong Son, Nguyen Van Luy National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department-Branch 6, Can Tho, Vietnam Abstract The LC-ESI-MS/MS method has been successfully developed for determination of chlorate and perchlorate in pangasius samples Residues of chlorate and perchlorate in the sample were extracted with a methanolic solution acidified with 1% formic acid Then, the extract was cleaned with C18 powder, used a normal phase column to separate chlorate and perchlorate, and quantified on an LC-ESI-MS/MS instrument The method was validated for good specificity, linear calibration curve in the range of 0.0005 - 0.015 mg/L; the limit of quantification (LOQ) was 0.005 mg/kg; the recovery and relative standard deviation was from 91 to 109% and from 6.4 to 9.5% respectively and all met the requirements of SANTE The method was applied to the real analysis, a total of 427 pangasius fillet samples collected from seafood processing companies There were 76 samples were detected chlorate equivalent to 18% The concentration of chlorate ranged from 0.43 to 253 mg/kg Keywords: Chlorate and Perchlorate, LC-MS/MS, pangasius Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - tập 5, số 2, 2022 487 ... nhiều phương pháp sử dụng để xác định chlorate perchlorate bao gồm: sắc ký ion (IC) [7], chuẩn độ điện [8] phổ biến sắc ký khối phổ (LCMS) Trong phương pháp sắc ký khối phổ chlorate perchlorate xác. .. khảo sát từ thực tế, phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ nghiên cứu để phân tích dư lượng chlorate perchlorate tồn dư cá tra Phương pháp xác định chlorate perchlorate trực tiếp từ dung... dựng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC- MS/ MS) để phân tích dư lượng chlorate perchlorate tồn dư cá tra mức giới hạn định lượng đáp ứng yêu cầu kiểm soát theo ngưỡng quy định MRL