Nghiên cứu định lượng đồng thời aspirin và natri salicylat trong dung dịch A.S.A bằng phương pháp HPLC

Dung dịch A.S.A là một trong những loại thuốc bôitại chỗ được dùng để chữa bệnh lang ben và một sốbệnh về da do nấm gây ra với các thành phần chính gồmaspirin, natri salicylat. Khi điều trị tại chỗ, natri salicylatlàm dịu và giảm viêm ở vùng da kích ứng, aspirin cótác dụng sát trùng, bong tế bào sừng và giảm ngứa nhẹ.Để kiểm soát hàm lượng các hoạt chất trong chếphẩm, cần đưa ra một qui trình phân tích nhằm đánhgiá chất lượng sản phẩm. Hiện tại trong các Dược điểnViệt Nam 1, Dược điển Anh 3, Dược điển Mỹ 4chưa có phương pháp định lượng đồng thời hai thànhphần aspirin và natri salicylat. Trước đây trong tài liệutiêu chuẩn ngành 2 đã đưa ra phương pháp định lượngtừng hoạt chất bằng chuẩn độ thể tích. Trong đó, địnhlượng aspirin bằng phương pháp chuẩn độ thể tích trongnền mẫu có ether, định lượng natri salicylat cũng bằngphương pháp chuẩn độ thể tích phải qua bước bốc hơiđến cạn trên nền mẫu có nước. Cách xử lý mẫu như vậyphức tạp, mất thời gian

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ASPIRIN VÀ NATRI SALICYLAT TRONG DUNG DỊCH A.S.A BẰng phương pháp HPLC PHẠM THỊ HÀ, TRẦN THÚY HẠNH Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Từ khóa: Định lượng đồng thời, HPLC, aspirin, natri salicylat Đặt vấn đề Dung dịch A.S.A loại thuốc bôi chỗ dùng để chữa bệnh lang ben số bệnh da nấm gây với thành phần gồm aspirin, natri salicylat Khi điều trị chỗ, natri salicylat làm dịu giảm viêm vùng da kích ứng, aspirin có tác dụng sát trùng, bong tế bào sừng giảm ngứa nhẹ Để kiểm soát hàm lượng hoạt chất chế phẩm, cần đưa qui trình phân tích nhằm đánh giá chất lượng sản phẩm Hiện Dược điển Việt Nam [1], Dược điển Anh [3], Dược điển Mỹ [4] chưa có phương pháp định lượng đồng thời hai thành phần aspirin natri salicylat Trước tài liệu tiêu chuẩn ngành [2] đưa phương pháp định lượng hoạt chất chuẩn độ thể tích Trong đó, định lượng aspirin phương pháp chuẩn độ thể tích mẫu có ether, định lượng natri salicylat phương pháp chuẩn độ thể tích phải qua bước bốc đến cạn mẫu có nước Cách xử lý mẫu phức tạp, thời gian Với mong muốn đưa phương pháp định lượng đồng thời hai thành phần dung dịch A.S.A tiến hành đơn giản nhanh chóng đảm bảo độ xác, tin cậy, chúng tơi giới thiệu kết nghiên cứu thẩm định quy trình định lượng đồng thời hai thành phần aspirin natri salicylat dung dịch A.S.A phương pháp HPLC Thực nghiệm 2.1 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất chất chuẩn 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ: Đã hiệu chuẩn theo yêu cầu ISO/IEC 17025 GLP - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu với detector DAD; - Cột Apollo - C18 (250 x 4,6 mm; µm); - Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 độ xác 0,01 mg; - Bộ lọc dùng cho sắc ký với màng lọc 0,45 mm; - Các dụng cụ thuỷ tinh xác: bình định mức, pipet 2.1.2 Chất chuẩn - Aspirin Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh; Số lơ: QT078100718; Hàm lượng: 99,5% (ngun trạng) - Acid salicylic Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương; Số lơ: 0118281.01; Hàm lượng: 99,93% (ngun trạng) 2.1.3 Hóa chất thuốc thử - Nước RO (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương); - Acetonitril loại dùng cho HPLC (Merck - Đức); - Acid formic loại PA (Scharlau – Tây Ban Nha); - Natri 1-heptansulfonat loại PA (Fischer – Bỉ) 2.2 Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu thử: Dung dịch A.S.A (Lô: NC001; NSX: 26/8/2019); Nhà sản xuất: Công ty TNHH Dược phẩm Nam Việt Công thức pha chế cho 18 ml thành phẩm: Aspirin 1,800 g; natri salicylat 1,584 g; ethanol 70% vừa đủ 18 ml 2.2.2 Nội dung - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng aspirin natri salicylat phương pháp HPLC - Ứng dụng để định lượng aspirin natri salicylat dung dịch A.S.A 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu - Dựa tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký để lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu - Xây dựng quy trình xử lý mẫu dựa đặc tính chất phân tích - Sử dụng phần mềm Microsoft excel để xử lý kết thẩm định Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) Kết bàn luận 3.1 Xây dựng qui trình phân tích định lượng aspirin natri salicylat phương pháp HPLC Chúng khảo sát cột sắc ký, tỉ lệ pha động, tốc độ dịng, bước sóng phát hiện, nồng độ chất phân tích lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu sau 3.1.1 Điều kiện HPLC - Cột Apollo C18 (250 x 4,6 mm; µm) - Detector UV: 230 nm - Tốc độ dòng: 1,5 ml/min - Thể tích tiêm: 10 µl - Pha động: Hịa tan g natri heptansulfonat hỗn hợp gồm 850 ml nước 150 ml acetonitril, sau điều chỉnh đến pH 3,4 acid acetic - Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp acetonitril acid acetic (99 : 1) 3.1.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 50 mg acid salicylic chuẩn khoảng 60 mg aspirin chuẩn vào bình định mức 100 ml, hịa tan thêm dung môi pha mẫu tới vừa đủ, lắc Hút xác 5,0 ml dung dịch vừa thu vào bình định mức 25 ml, pha lỗng dung môi pha mẫu tới vừa đủ, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký - Dung dịch thử: Hút xác 1,0 ml dung dịch A.S.A vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu đến vừa đủ, lắc Hút xác 3,0 ml dung dịch vừa thu vào bình định mức 50 ml, pha lỗng dung mơi pha mẫu đến vừa đủ, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký 3.1.3 Cách tiến hành Kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: Tiêm lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic acid salicylic aspirin khơng lớn 2,0% độ phân giải hai pic phải khơng nhỏ 1,5 Hình Sắc ký đồ dung mơi pha mẫu 3.1.4 Tính kết Tính hàm lượng natri salicylat aspirin chế phẩm dựa vào lượng cân acid salicylic aspirin chuẩn, hàm lượng chất chuẩn, diện tích pic acid salicylic aspirin dung dịch chuẩn dung dịch thử, hệ số pha loãng dung dịch chuẩn dung dịch thử (Hệ số chuyển đổi từ acid salicylic sang natri salicylat 1,1593) 3.2 Thẩm định phương pháp 3.2.1 Tính đặc hiệu - Dung dịch placebo natri salicylat (tự tạo dung dịch có thành phần cơng thức bào chế khơng có natri salicylat): Pha theo qui trình phân tích dung dịch thử mục 3.1.2 - Dung dịch placebo aspirin (tự tạo dung dịch có thành phần cơng thức bào chế khơng có aspirin): Pha theo qui trình phân tích dung dịch thử mục 3.1.2 - Dung dịch chuẩn: Cân xác 49,50 mg chất chuẩn acid salicylic 60,18 mg chất chuẩn aspirin vào bình định mức 100 ml, hịa tan thêm dung mơi pha mẫu tới vừa đủ, lắc (dung dịch chuẩn gốc) Hút xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc vừa thu vào bình định mức 25 ml, pha lỗng dung môi pha mẫu tới vừa đủ, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký - Dung dịch thử: Pha theo qui trình phân tích Tiêm dung mơi pha mẫu, dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký Kết cho thấy, sắc ký đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu phổ UV tương ứng với pic acid salicylic aspirin sắc ký đồ dung dịch chuẩn (thời gian lưu acid salicylic khoảng 14 phút; aspirin khoảng 17 phút) Độ tinh khiết pic acid salicylic aspirin sắc ký đồ dung dịch chuẩn thử 0,9999 (~ 100%) Sắc ký đồ dung môi pha mẫu dung dịch placebo khơng xuất chất phân tích (Hình 1, Hình 2, Hình 3, Hình 4, Hình Hình 6) Hình Sắc ký đồ dung dịch placebo aspirin Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) Hình Sắc ký đồ dung dịch placebo natri salicylat Hình Sắc ký đồ dung dịch chuẩn aspirin Hình Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Hình Sắc ký đồ dung dịch thử Sắc ký đồ Hình 1, 2, 3, 4, cho thấy phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu phù hợp cho định lượng đồng thời natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký Tính thích hợp hệ thống sắc ký xác định cách tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn mục 3.2.1 Ghi lại giá trị thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết hệ số đối xứng pic acid salicylic aspirin Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký thể Bảng Bảng Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký STT Acid salicylic Aspirin Thời gian Diện tích pic Hệ số Số đĩa Thời gian Diện tích pic Hệ số Số đĩa lưu (phút) (mAU.s) (T) lí thuyết (N) lưu (phút) (mAU.s) (T) lí thuyết (N) 13,968 2054716 0,819 10379 17,275 2002923 1,034 10755 13,971 2054274 0,824 10406 17,278 2005609 1,043 10817 13,971 2053140 0,824 10443 17,277 2000887 1,048 10865 13,974 2053523 0,824 10476 17,281 2004285 1,052 10845 13,968 2050301 0,826 10538 17,272 1996919 1,051 10880 13,959 2042802 0,825 10595 17,254 1991480 1,052 10927 TB 13,969 2051459 17,273 2000351 RSD (%) 0,04 0,22 0,06 0,26 Độ phân giải pic ⁓ 5,4 Các số liệu thu Bảng cho thấy hệ thống sắc ký phù hợp cho việc phân tích định tính định lượng acid salicylic aspirin Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 3.2.3 Độ tuyến tính Khảo sát dung dịch chuẩn với nồng độ tương ứng 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc mục 3.2.1 Kết thu được trình bày Bảng 2, Hình 7, Hình Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp Nồng độ % so Thể tích dung dịch STT với định lượng chuẩn gốc (ml) Hệ số pha loãng Acid salicylic Aspirin Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 50 20 49,47 1022300 59,88 994768 80 25 79,14 1636083 95,81 1590928 100 25 98,93 2054716 119,76 2002923 120 25 118,72 2445978 143,71 2384331 150 10 148,40 3057381 179,64 2979265 Phương trình hồi qui: Hệ số tương quan: %Y: y = 20556 x + 9653,8 r = 1,0000 0,47% (< 2%) Hình Đường hồi qui tuyến tính acid salicylic y =16570 x + 6059,6 r = 1,0000 0,30% (< 2%) Hình Đường hồi qui tuyến tính aspirin Từ kết Bảng Hình 7, cho thấy với điều kiện sắc ký lựa chọn, khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ acid salicylic, aspirin diện tích pic đáp ứng với hệ số tương quan r = 1,0000 3.2.4 Độ - Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân xác 49,63 mg acid salicylic chuẩn 60,48 mg aspirin chuẩn vào bình định mức 100 ml, hịa tan thêm dung môi pha mẫu tới vừa đủ, lắc - Chuẩn bị dung dịch placebo gốc: Hút ml ethanol 70% vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu đến vừa đủ, lắc - Chuẩn bị dung dịch tự tạo: Thêm xác 6,0 ml; 10,0 ml; 14,0 ml dung dịch chuẩn gốc vừa pha vào bình định mức 50 ml chứa sẵn ml dung dịch placebo gốc, thêm dung môi pha mẫu đến vừa đủ, lắc thu dung dịch tự tạo có nồng độ 60%, 100%, 140% so với nồng độ định lượng Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký Tính lượng acid salicylic aspirin tìm lại được, sử dụng dung dịch chuẩn mục 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký Kết khảo sát độ thể qua Bảng Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) Bảng Kết khảo sát độ phương pháp Acid salicylic Lượng Lượng thêm vào Lượng thực Diện tích pic acid % Thu so với tế thêm vào (mAU.s) salicylic hồi (µg) Stt nhãn tìm lại (µg) 60% 60% 60% 100% 100% 100% 140% 140% 140% 2975,72 1222149 2946,88 99,03 2975,72 1233602 2974,49 99,96 2975,72 1225538 2955,05 99,31 Trung bình = 99,43%; RSD = 0,48% 4959,53 2043564 4927,50 99,35 4959,53 2026603 4886,60 98,53 4959,53 2029046 4892,49 98,65 Trung bình = 98,84%; RSD = 0,45% 6943,34 2857556 6890,22 99,23 6943,34 2857366 6889,76 99,23 6943,34 2860243 6896,70 99,33 Trung bình = 99,26%; RSD = 0,06% Kết thu Bảng cho thấy phương pháp có độ tốt (phần trăm tìm lại từ 98,53% đến 100,43%) và giá trị RSD đều nhỏ 2,0% 3.2.5 Khoảng xác định Từ phần đánh giá độ tuyến tính, độ suy khoảng xác định acid salicylic 58,94 μg/ml – 137,93 μg/ml aspirin 71,96 μg/ml – 168,37 μg/ml Aspirin Lượng Lượng % Thu thực tế Diện tích pic aspirin hồi thêm vào (mAU.s) tìm lại (µg) (µg) 3610,66 1201891 3597,78 99,64 3610,66 1211385 3626,20 100,43 3610,66 1209015 3619,10 100,23 Trung bình = 100,1%; RSD = 0,41% 6017,76 2005956 6004,69 99,78 6017,76 1990240 5957,64 99,00 6017,76 1990158 5957,40 99,00 Trung bình = 99,26%; RSD = 0,45% 8424,86 2810541 8413,16 99,86 8424,86 2806637 8401,47 99,72 8424,86 2812245 8418,26 99,92 Trung bình = 99,83%; RSD = 0,10% (60% - 140% so với nồng độ định lượng) 3.2.6 Độ xác 3.2.6.1 Độ lặp lại Khảo sát định lượng natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A với điều kiện sắc ký cách chuẩn bị mẫu mục 3.1.1 3.1.2 Lặp lại thí nghiệm lần, kết trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát độ xác phương pháp Stt Kiểm nghiệm viên 1- Kết phần 3.2.5.1 Kiểm nghiệm viên (Kết độ lặp lại) Thiết bị: Máy HPLC Shimadzu LC-20AD XR Thiết bị: Máy HPLC Shimadzu LC-20AD Nồng độ dd chuẩn acid salicylic: 98,93 µg/ml Nồng độ dd chuẩn acid salicylic: 98,13 µg/ml Nồng độ dd chuẩn aspirin: 119,76 µg/ml Nồng độ dd chuẩn aspirin: 121,35 µg/ml DT pic chuẩn acid salicylic = 2051459 mAU.s DT pic chuẩn acid salicylic = 2096231 mAU.s DT pic chuẩn aspirin = 2000351 mAU.s DT pic chuẩn aspirin = 2045471 mAU.s Natri salicylat Aspirin Natri salicylat Aspirin Diện tích pic HL (%) Diện tích pic HL (%) Diện tích pic HL (%) Diện tích pic HL (%) (mAU.s) natri salicylat (mAU.s) aspirin (mAU.s) natri salicylat (mAU.s) aspirin 2073935 109,80 2032689 101,41 2124421 109,18 2054931 101,59 2068324 109,50 2030791 101,32 2125110 109,21 2034384 100,58 2066516 109,41 2027385 101,15 2139395 109,95 2053747 101,53 2066216 109,39 2030504 101,30 2108826 108,38 2036030 100,66 2067915 109,48 2030403 101,30 2082124 107,01 2003772 99,06 2066858 109,42 2030541 101,30 2100599 107,96 2023122 100,02 Trung bình = 109,50%; Trung bình = 101,30%; Trung bình = 108,62%; Trung bình = 100,57%; n = 6; RSD = 0,14% n = 6; RSD = 0,08% n = 6; RSD = 0,97% n = 6; RSD = 0,95% Hàm lượng natri salicylat trung bình = 109,06%; n = 12; RSD = 0,78% < 2,0%; Hàm lượng aspirin trung bình = 100,94%; n = 12; RSD = 0,74% < 2,0% Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) Kết Bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với RSD = 0,78% < 2,0% (natri salicylat) RSD = 0,74% < 2,0% (aspirin) 3.2.6.2 Độ xác trung gian Độ xác trung gian hai kiểm nghiệm viên khác nhau, tiến hành khác ngày hai thiết bị khác Kết thể Bảng Kết Bảng cho thấy phương pháp có độ xác trung gian đạt yêu cầu Kết luận Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo thiết lập để định lượng natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A Phương pháp xây dựng sử dụng cột Apollo - C18 (250 x 4,6 mm; µm) q trình phân tích Pha động: Hòa tan g natri heptansulfonat hỗn hợp gồm 850 ml nước 150 ml acetonitril, sau điều chỉnh đến pH 3,4 acid acetic, tốc độ dịng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 ml; detector DAD bước sóng 230 nm; dung mơi pha mẫu: Hỗn hợp acetonitril acid acetic (99:1) Phương pháp thẩm định tính đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, khoảng xác định, độ lặp lại độ xác trung gian Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng hồn tồn phù hợp để kiểm sốt hàm lượng natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A Tài liệu tham khảo Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam, Lần xuất thứ năm, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (1990), Tiêu chuẩn ngành, Nhóm R, 52TCN 367-89 The British Pharmacopoeia Commission (2019), British Pharmacopoeia The United States Pharmacopoeial Convention (2018), United States Pharmacopoeia 41 SUMMARY A reversed-phase liquid chromatography method was developed to assay Sodium salicylate and Aspirin in A.S.A solution product The method was carried by using a Apollo - C18 (250 x 4.6 mm; µm) column and mobile phase is prepared follow, dissolve g of Sodium 1-heptanesulfonate in a mixture of 850 ml of Water and 150 ml of Acetonitrile, and adjust with Glacial acetic acid to a pH of 3.4 The flow rate of mobile phase is maintained at 1.5 ml per minute, injection volume: 10 ml, analyte was detected by a DAD detector set at 230 nm The method was validated in specificity, linearity, range, accuracy and precision Validation results proved that the developed method was suitable for assay of Sodium salicylate and Aspirin in A.S.A solution product (Ngày nhận bài: 26/11/2020 ; Ngày phản biện: 16/03/2021 ; Ngày duyệt đăng: 10/06/2021 THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG RABEPRAZOL CỦA VIÊN NÉN BAO TAN TRONG RUỘT ĐÃ HỊA TAN TRONG MƠI TRƯỜNG ACID VÀ MƠI TRƯỜNG ĐỆM LỤC THỊ VÂN, NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH, NGUYỄN VĂN BÌNH, TRẦN THỊ HỒNG ANH Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Từ khóa: Rabeprazol, viên bao tan ruột, độ hịa tan, môi trường acid, môi trường đệm Đặt vấn đề Rabeprazol dẫn chất benzidamol, có tác dụng ức chế bơm proton, ức chế tiết dịch vị tình trạng kích thích Hoạt chất rabeprazol khơng có tính chất kháng acetylcholin đối kháng thụ thể Histamin H2 cách ức chế enzym H+/K+-ATPase tế bào thành niêm mạc dày Enzym bơm acid, hydrogen proton tế bào thành niêm mạc dày nên rabeprazol coi thuốc ức chế bơm proton Thuốc Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) ... dịch chuẩn dung dịch thử, hệ số pha loãng dung dịch chuẩn dung dịch thử (Hệ số chuyển đổi từ acid salicylic sang natri salicylat 1,1593) 3.2 Thẩm định phương pháp 3.2.1 Tính đặc hiệu - Dung dịch. .. chuẩn Hình Sắc ký đồ dung dịch thử Sắc ký đồ Hình 1, 2, 3, 4, cho thấy phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu phù hợp cho định lượng đồng thời natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A 3.2.2 Tính... Kết Bảng cho thấy phương pháp có độ xác trung gian đạt u cầu Kết luận Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo thiết lập để định lượng natri salicylat aspirin dung dịch A.S.A Phương pháp xây dựng sử dụng