Đánh giá mối tương quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng phôi người

Tuy nhiên, thời gian kiêng xuất tinh như nào và giá trị thực tiễn để đem lại tỉ lệ thụ tinh cao hơn hay chất lượng phôi tối ưu vẫn còn gây nhiều tranh cãi... Quá trình

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA THỜI GIAN KIÊNG XUẤT TINH NGẮN

VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI NGƯỜI

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Ký và ghi rõ họ tên

Vũ Thu Hằng

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được bài luận văn thạc sĩ này, tôi xin bày tỏ sự cảm kích đặc biệt tới cố vấn của tôi, Tiến sĩ Đào Thị Hồng Vân - Người đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt và cố vấn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn những bài giảng của cô đã giúp cho tôi mở mang thêm nhiều kiến thức hữu ích về sinh lý người nói chung và phôi người nói riêng Đồng thời, cô cũng là người luôn cho tôi những lời khuyên vô cùng quý giá về cả kiến thức chuyên môn cũng như định hướng phát triển sự nghiệp Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô bằng tất cả tấm lòng và sự biết ơn của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Bác sĩ chuyên khoa II Đỗ Duy Long – Khoa Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Quảng Ninh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về y học hiếm muộn, kỹ năng mềm cho nhà nghiên cứu bằng các hội thảo thực sự bổ ích và ý nghĩa

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự nhiệt tình của Thạc sĩ Sinh học Ngô Kim Ngân

đã dành thời gian quý báu để hỗ trợ tối đa cho tôi trong quá trình nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn về di truyền học Giúp cho quá trình hoàn thành luận văn được nhanh chóng và hiệu quả nhất

Sau cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong thời gian hoàn thành luận văn thạc sĩ

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Hà Nội, ngày 31 tháng 12 năm 2023

Học viên

Vũ Thu Hằng

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vô sinh và vô sinh nam 3

1.1.1 Khái niệm về vô sinh và vô sinh nam giới 3

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên th ế giới 3

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam 4

1.2 Tổng quan về tinh trùng 4

1.2.1 Định nghĩa về tinh trùng 4

1.2.2 Quá trình sinh tinh trùng 5

1.2.3 Xét nghiệm chẩn đoán chất lượng tinh trùng 7

1.2.4 Các xét nghiệm đánh giá chức năng tinh trùng 8

1.3 Thời gian kiêng xuất tinh 9

1.3.1 Thời gian kiêng xuất tinh ngắn 10

1.3.2 Mối liên hệ giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng tinh trùng 10

1.4 Thụ tinh trong ống nghiệm 12

1.5 Quá trình phát triển phôi người 14

1.5.1 Giai đoạn hợp tử 15

1.5.2 Giai đoạn phôi phân chia 16

1.5.3 Giai đoạn phôi nang 17

1.6 Chất lượng di truyền của phôi và xét nghiệm di truyền phôi giai đoạn tiền làm tổ .18

Trang 6

1.7 Tình hình nghiên cứu về mối liên quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và

chất lượng phôi người 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 222

2.3.1 Nghiên cứu thuần tập 22

2.3.2 Chọn cỡ mẫu 23

2.3.3 Các bước tiến hành 24

2.3.4 Các tham số nghiên cứu 29

2.4 Xử lý số liệu 30

2.5 Đạo đức nghiên cứu 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Đặc điểm chính của đối tượng nghiên cứu 32

3.2 Đánh giá chất lượng tinh dịch giữa hai nhóm kiêng xuất tinh 33

3.3 Đánh giá chất lượng phôi giữa hai hai nhóm kiêng xuất tinh 34

3.3.1 Kết quả thụ tinh 34

3.3.2 Kết quả hình thái phôi phân chia 37

3.3.3 Kết quả hình thái phôi nang và khả năng tạo phôi nang 39

3.4 Đánh giá chất lượng di truyền của phôi được tạo thành giữa hai nhóm kiêng xuất tinh 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

trùng vào bào tương của noãn

bội tiền làm tổ

Trang 8

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 2.1 Bảng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng hình thái phôi phân chia

Bảng 3.1 Đặc điểm chính của đối tượng nghiên cứu 32

Bảng 3.2 So sánh chất lượng mẫu tinh dịch giữa hai lần xuất tinh 33

Bảng 3.3 So sánh tỉ lệ thụ tinh sau ICSI giữa hai lần xuất tinh 35

Bảng 3.4 So sánh chất lượng hình thái phôi phân chia giữa hai lần xuất

tinh

37

Bảng 3.5 So sánh chất lượng hình thái phôi nang giữa hai lần xuất tinh 39

Bảng 3.6 So sánh tỉ lệ tạo phôi nang và phôi nang tốt từ noãn thụ tinh

bình thường giữa hai lần xuất tinh

41

Bảng 3.7 So sánh tỉ lệ phôi chỉnh bội, phôi lệch bội và phôi khảm giữa

hai lần xuất tinh

42

Trang 9

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Cấu tạo của tinh trùng 5

Hình 1.2 Quá trình sinh tinh trùng 6

Hình 1.3 Hình ảnh tinh trùng phân mảnh DNA 8

Hình 1.4 Hình ảnh kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn trong TTTON

13 Hình 1.5 Hình ảnh các giai đoạn phát triển của phôi người 14

Hình 1.6 Hình ảnh hợp tử điển hình ở người 15

Hình 1.7 Hình ảnh phôi phân chia điển hình ở người 16

Hình 1.8 Hình ảnh phôi nang điển hình ở người 17

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thực hiện trong nghiên cứu 24

Hình 3.1 Hình ảnh hợp tử thụ tinh một ngày tuổi của cùng một bệnh nhân

36 Hình 3.2 Hình ảnh phôi phân chia 3 ngày tuổi của cùng một bệnh nhân 38

Hình 3.3 Hình ảnh phôi nang 5 ngày tuổi của cùng một bệnh nhân 40

Hình 3.4 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người không phát hiện lệch bội 24 NST

43 Hình 3.5 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người không phát hiện lệch bội 24 NST

43 Hình 3.6 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người phát hiện bất thường lệch bội NST -13

43 Hình 3.7 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người phát hiện bất thường lệch bội NST +13 (Hội chứng Patau)

44 Hình 3.8 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người phát hiện bất thường lệch bội NST –X (Hội chứng Turner)

44

Trang 10

Hình 3.9 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền của phôi người phát hiện

đa bất thường lệch bội NST +2, +5, +9, -16

44

Hình 3.10 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền phôi người của cùng một

bệnh nhân

45

Hình 3.11 Hình ảnh kết quả chẩn đoán di truyền phôi người của cùng một

bệnh nhân (tiếp theo)

46

Trang 11

MỞ ĐẦU

Em bé đầu tiên trên thế giới được sinh ra bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) vào năm 1978 tại Anh, kể từ đó đến nay, phương pháp điều trị vô sinh hiếm muộn này đã và đang được áp dụng rộng rãi Mỗi năm, riêng tại Việt Nam

có khoảng 35000 trường hợp TTTON được thực thiện [7] Nhu cầu phát triển chuyên môn và nâng cao hiệu quả điều trị, dịch vụ ngày càng được chú trọng trong ngành hỗ trợ sinh sản

Các nghiên cứu về phôi học lâm sàng liên tục được thực hiện, giúp thu thập số lượng dữ liệu lớn nhằm tìm ra các phương pháp mới, kĩ thuật mới đem lại kết quả cao trong tỉ lệ phôi có chất lượng hình thái tốt, tỉ lệ hình thành phôi nang, tỉ lệ phôi chỉnh bội, tỉ lệ thai lâm sàng, … và sau cùng là mang đến nhiều hơn những em bé khỏe mạnh, đem lại niềm vui niềm hạnh phúc làm cha mẹ cho các cặp vợ chồng hiếm muộn

Để nâng cao chất lượng phôi về mặt hình thái hay di truyền, các chuyên gia lâm sàng và phôi học đang tìm kiếm và cải thiện những nhân tố ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp đến chất lượng phôi Một trong số những nhân tố quan trọng là chất lượng tinh trùng của người chồng [15] Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy thời gian kiêng xuất tinh là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng [12, 13, 20,

22, 23] Tuy nhiên, thời gian kiêng xuất tinh như nào và giá trị thực tiễn để đem lại tỉ lệ thụ tinh cao hơn hay chất lượng phôi tối ưu vẫn còn gây nhiều tranh cãi

Việc so sánh đặc điểm tinh trùng và chất lượng phôi được tạo ra từ tinh trùng

có thời gian kiêng xuất tinh vài ngày với thời gian kiêng xuất tinh 1 giờ được đặt ra và nghiên cứu Theo Scarselli và cộng sự, 2019 [26], nhóm tinh trùng được lấy từ lần xuất tinh thứ hai (ngay sau 1 giờ của lần xuất tinh thứ nhất) có tỉ lệ tinh trùng đã trưởng thành nhiễm sắc thể cao hơn (58,3% vs 35,6%), cho kết quả khả quan hơn ở

tỉ lệ tạo phôi nang ngày 5 (47,3% vs 43,1%), đặc biệt tỉ lệ phôi chỉnh bội cao hơn có

ý nghĩa thống kê (43,6% vs 27,5%, p<0,05) so với nhóm kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày

Trong quá trình tiến hành TTTON tại bệnh viện Sản Nhi tỉnh Quảng Ninh, có một số trường hợp bệnh nhân nam cần lấy thêm mẫu tinh trùng lần hai để bổ sung

Trang 12

thêm số lượng tinh trùng cho kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI) Quá trình lấy mẫu lần thứ hai diễn ra khoảng 1 đến 3 giờ ngay sau lần xuất tinh thứ nhất Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, để đi sâu và làm rõ thêm vấn đề, tôi đã tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá mối tương quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng phôi người”

- Mục tiêu nghiên cứu:

Đánh giá mối tương quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng phôi người

- Nội dung nghiên cứu:

+ Đánh giá chất lượng tinh trùng của hai lần xuất tinh (kiêng xuất tinh bình thường và kiêng xuất tinh ngắn) từ cùng một nhóm đối tượng bệnh nhân

+ Tạo phôi từ hai loại tinh trùng và đánh giá chất lượng hình thái phôi người được tạo từ hai nhóm tinh trùng vào các giai đoạn: hợp tử, phôi phân chia, phôi nang + Thống kê và đánh giá chất lượng di truyền tiền làm tổ của phôi người được tạo từ hai nhóm tinh trùng

Trang 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vô sinh và vô sinh nam

1.1.1 Khái niệm về vô sinh và vô sinh nam giới

Theo Tổ chức Y tế thế giới, vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ, mong muốn có con nhưng không thể có thai sau 12 tháng có quan hệ tình dục mà không dùng biện pháp tránh thai nào Ở Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cập nhật về hỗ trợ sinh sản” (2013) tại Hà Nội cho thấy kết quả điều tra ở Việt Nam thì tỷ lệ vô sinh là 7,7% Trong đó, nguyên nhân do nam giới chiếm 25 - 40%, do nữ 40 - 55%, còn lại do cả hai vợ chồng và không rõ nguyên nhân [4]

Trong vô sinh do nam giới, nguyên nhân do bất thường số lượng tinh trùng là rất thường gặp, đó là những trường hợp vô sinh nam do vô tinh và thiểu tinh

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới

Theo Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ, khoảng 6,1 triệu người Mỹ bị vô sinh, một phần ba là do nữ, một phần ba là do nam giới, phần còn lại là do cả hai hoặc KRNN [42] Một nghiên cứu khác tại Hoa Kỳ cho thấy, có khoảng 10% số cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh

Ở Châu Âu, vô sinh nam chiếm 20% Tại Pháp, tỷ lệ vô sinh chiếm 13,5% các cặp vợ chồng Theo Thonneau (1991), có khoảng 15% các cặp vợ chồng không thể

có con sau một năm, trong đó do nam giới chiếm 20% [44] Ali Hellani cũng cho rằng khoảng 10%-15% cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân do nam chiếm 50% và khoảng 30%-40% vô sinh nam không rõ nguyên nhân [43]

Ở các nước Châu Á: Takahashi và cs (1990) nghiên cứu trên 173 mẫu tinh dịch của các bệnh nhân vô sinh nam giới tại Nhật Bản cho thấy có 35,8% VT, 19,6%

có số lượng tinh trùng giảm nghiêm trọng, 9,8% giảm vừa và 34,7% có tinh dịch đồ bình thường [45]

Trang 14

Nhìn chung, tỷ lệ vô sinh thay đổi từ 10% - 20%, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam và nữ tương đương nhau, tỷ lệ này có xu hướng ngày càng tăng, tỷ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân còn nhiều

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỷ lệ vô sinh

có xu hướng tăng Theo kết quả điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này là 7% - 10%, đến năm 1982, tỷ lệ vô sinh chung ở Việt Nam lên đến 13%, trong đó vô sinh nữ 54%, vô sinh nam 36%, vô sinh không rõ nguyên nhân 10% [2]

Theo Trần Quán Anh và Nguyễn Bửu Triều, cứ 100 cặp vợ chồng thì có khoảng 15 cặp vợ chồng không thể có con, trong đó trên 50% nguyên nhân là do nam giới và tỷ lệ này đang có chiều hướng gia tăng mạnh [1]

Nguyên nhân chủ yếu của vô sinh nam là do rối loạn sinh tinh Ngoài ra, vô sinh nam còn do một số nguyên nhân khác như: rối loạn về tình dục và xuất tinh, rối loạn nội tiết, tắc ống dẫn tinh… Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44% có tinh trùng bất thường [3]

Trang 15

trùng được hình thành ở giai đoạn tinh tử kéo dài, chứa tất cả các thành phần cần thiết cho sự di dộng, dài 40 - 50 µm [7]

Hình 1.1 Cấu tạo của tinh trùng [7]

1.2.2 Quá trình sinh tinh trùng

Sự sinh tinh là một quá trình phức tạp và kéo dài, trong đó các tế bào mầm vừa phân chia làm mới vừa sản xuất các tế bào để biến đổi thành tinh trùng có chức năng Quá trình này bao gồm nguyên phân, giảm phân và sửa chữa tế bào, được chia làm 4 giai đoạn (Hình 1.1): Các tế bào mầm lưỡng bội (tinh nguyên bào) nguyên phân tăng sinh và biệt hoá thành các tinh bào (sinh tinh bào); Các tế bào mầm phân chia giảm phân thành những tế bào mầm đơn bội (tinh tử); Tinh tử phát triển thành tinh trùng trong ống sinh tinh; Giải phóng tinh trùng tử biểu mô mầm đến lòng ống sinh tinh [7]

Trang 16

Hình 1.2 Quá trình sinh tinh trùng [39]

Tinh trùng được hình thành từ quá trình biệt hoá của các tinh tử Ở người, quá trình trưởng thành tinh tử trải qua 12 bước biến đổi và chia làm sáu giai đoạn được xác định bởi sự thay đổi về hình thái Giai đoạn I, khu vực phức hợp Golgi và

ti thể được biệt hoá và phát triển mạnh, các túi acrosome được hình thành, có sự phát triển của nhiễm sắc chất và xuất hiện sợi trục Trong giai đoạn III, IV, cấu hình acrosome được hoàn chỉnh, các phần trung gian được hình thành và đuôi phát triển Trong hai giai đoạn cuối, nhân được nén chặt và bất hoạt gene, các histone được chuyển đổi thành các protein chuyển tiếp và được thay thế bởi các protamine Khi mới được hình thành, các tinh tử kết nối với nhau qua cầu nối liên bào Các tế bào Sertoli tích cực tham gia quá trình sinh tinh nói chung và hỗ trợ các tinh tử di chuyển

về phía lòng ống sinh tinh Các tinh tử trưởng thành sẽ đóng hết các cầu nối nội bào, ngắt kết nối với biểu mô mầm, được phóng thích khỏi tế bào Sertoli và trở thành một tế bào tự do - được gọi là tinh trùng - đi vào lòng ống Một phần tế bào chất của tế bào Sertoli thường được loại bỏ hoàn toàn, đôi khi có thể giữ lại ở tinh trùng chưa trưởng thành trong quá trình sinh tinh [7]

Trang 17

1.2.3 Xét nghiệm chẩn đoán chất lượng tinh trùng

Chẩn đoán khả năng sinh sản của nam giới là một trong những bước quan trọng của điều trị vô sinh khi nó có vai trò trong việc giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra các phương pháp hỗ trợ sinh sản phù hợp Khả năng này được khảo sát thông qua một xét nghiệm gọi là tinh dịch đồ - hiện nay là xét nghiệm thường qui, trong khám và chẩn đoán một cặp vợ chồng hiếm muộn, đây là một xét nghiệm cơ bản, đầu tiên để đánh giá bước đầu khả năng sinh sản của người chồng [6]

Bảng 1.1 Một số giá trị bình thường của tinh dịch đồ (WHO 2010) [5]

Tinh trùng di động tiến tới+ tinh trùng

Một tinh dịch đồ gọi là bình thường khi tất cả các giá trị đều nằm trong giới hạn bình thường (Bảng 1.1) Nếu tinh dịch đồ bất thường nên làm lại lần 2 để có kết luận chính xác Hầu hết các giá trị của tinh dịch đồ được tính bằng cách ước lượng và có giá trị chính xác tương đối Tuy vậy các sai số của phép ước lượng thường ít ảnh hưởng đến tiên lượng điều trị [6]

Tinh dịch đồ bất thường với một vài chỉ số thấp dưới mức bình thường không

có nghĩa là người chồng hoàn toàn không có khả năng sinh con Tinh dịch đồ dưới mức bình thường cho thấy người chồng có thể giảm khả năng sinh sản Bất thường mức độ càng nặng, khả năng sinh sản càng giảm nhiều Trong đa số các trường hợp,

Trang 18

nhiều bất thường đi kèm với nhau Tinh dịch đồ của một người thử hai lần khác nhau đôi khi có kết quả hoàn toàn khác nhau do sự thay đổi của quá trình sinh tinh

1.2.4 Các xét nghiệm đánh giá chức năng tinh trùng

1.2.4.1 Sự nguyên vẹn DNA của tinh trùng

DNA tinh trùng gắn với protamine và cấu trúc nhỏ gọn này giúp bảo vệ DNA khỏi bị hư hại trong quá trình di chuyển của tinh trùng Tuy nhiên, một số sai hỏng

có thể xảy ra và ở một mức độ nhất định, có thể được sửa chữa bởi tế bào chất của noãn Nhưng khi sai hỏng vượt quá ngưỡng sửa chữa của noãn, sự sai hỏng này có thể ảnh hưởng đến chức năng của tinh trùng Tinh trùng với tổn thương DNA có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và làm tổ của phôi (Wdowiak và cộng sự, 2015; Tomsu

và cộng sự, 2002) [30, 32] Đồng thời, một số nghiên cứu cho thấy mức độ phân mảnh DNA cao có liên quan đến hiện tượng sẩy thai hoặc sinh con với dị tật bẩm sinh (Bradley và cộng sự, 2016) [14]

Hình 1.3 Hình ảnh tinh trùng phân mảnh DNA (dấu *).

Phân mảnh DNA tinh trùng hiện được đánh giá bằng hai phương pháp trực tiếp (sự tương tác của đầu dò-probes hoặc thuốc nhuộm) và gián tiếp (gây biến tính

Trang 19

DNA để xác định tỉ lệ phân mảnh) Hiện nay có bốn phương pháp phổ biến để xác định phân mảnh DNA tinh trùng gồm: khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (Sperm Chromatin Structure Assay - SCSA), phương pháp đánh dấu sự đứt gãy DNA bằng các dUT được xúc tác bởi men terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), điện

di cá thể tế bào đơn (COMET), khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion - SCD)

1.2.4.2 Nồng độ các gốc oxy hóa tự do

ROS (Reactive oxygen species) là thuật ngữ được sử dụng để mô tả một số phân tử và các gốc tự do có nguồn gốc từ oxy Tinh trùng sản sinh ra ROS ở nồng độ sinh lý cần thiết cho các chức năng bình thường như trong phản ứng cực đầu, sự khả năng hoá và sự dung hợp của noãn và tinh trùng Tuy nhiên, khi nồng độ ROS vượt quá khả năng kháng oxy hoá của cơ thể thì ROS dư thừa có thể tương tác với các đại phân tử dẫn đến stress oxy hoá (oxidative stress) Nồng độ ROS cao làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tinh trùng, giảm khả năng di động, gây tổn thương DNA nhiều mức

độ khác nhau và thúc đẩy hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis) Chính các tác động này gây bất lợi đến sự thụ tinh và phát triển của phôi, dẫn đến làm giảm tỉ lệ thai, tăng tỉ lệ sẩy thai và dị tật thai, đồng thời làm giảm khả năng sinh sản của thế hệ sau (Agarwal và cộng sự, 2012) [10]

1.3 Thời gian kiêng xuất tinh

yếu tố này là thời gian kiêng xuất tinh Trong hỗ trợ sinh sản, thời gian kiêng xuất tinh được hiểu là khoảng thời gian giữa hai lần xuất tinh, mà trong đó tinh dịch của lần xuất tinh sau sẽ được sử dụng cho xét nghiệm chẩn đoán hoặc điều trị vô sinh bằng phương pháp TTTON

cáo rằng nên lấy tinh dịch để phân tích sau tối thiểu 2 ngày và tối đa là 7 ngày kiêng xuất tinh; tuy nhiên, Hiệp hội Phôi thai và Sinh sản Châu Âu (European Society of Human Reproduction and Embryology - ESHRE) khuyên thời gian kiêng chỉ từ 3–4 ngày [5] Cơ sở cho những khuyến nghị này là không rõ ràng và các chỉ dẫn hiện tại

Trang 20

về thời gian kiêng xuất tinh nên được xem xét lại Nhiều nghiên cứu đã tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian kiêng xuất tinh đến các chỉ số của tinh trùng, mặc dù kết quả còn nhiều tranh cãi

1.3.1 Thời gian kiêng xuất tinh ngắn

Một số nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các khoảng thời gian kiêng xuất tinh không như nhau sẽ thu nhận được các thông số tinh trùng bao gồm mật độ tinh trùng, độ di động tiến tới và hình dạng khác nhau Đồng thời các nghiên cứu này cho thấy sự cải thiện các thông số tinh dịch, phát triển của phôi và tỷ lệ thai lâm sàng với các khoảng thời gian kiêng xuất tinh khác nhau Từ đó, định nghĩa về thời gian kiêng xuất tinh ngắn được ra đời và được hiểu là khoảng thời gian kiêng xuất tinh rút gọn hơn thời gian khuyến cáo theo tổ chức Y tế thế giới – WHO với nhiều mức khác nhau như: nhỏ hơn hai ngày, vài giờ, …

1.3.2 Mối liên hệ giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng tinh trùng

Trong suốt 40 năm phát triển của các phương pháp hỗ trợ sinh sản và điều trị vô sinh, các hướng dẫn từ Cẩm nang của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho xét nghiệm chẩn đoán và xử lý tinh dịch người luôn được coi là tiêu chuẩn của các xét nghiệm tinh dịch đồ cũng như để xác định nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới Trong đó, thời gian kiêng xuất tinh dựa trên tiêu chuẩn của WHO (2010) là kiêng xuất tinh từ 2 đến 7 ngày trước khi thực hiện tinh dịch đồ, nhưng chưa có gợi ý hay cân nhắc cụ thể nào về thời gian kiêng xuất tinh của nam giới trước khi thực hiện các phương pháp

hỗ trợ sinh sản (Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, ICSI) Thời gian kiêng xuất tinh là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng tinh trùng, cũng như kết cục của hỗ trợ sinh sản Theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2010) thời gian kiêng xuất tinh trước khi thực hiện tinh dịch đồ hay tiến hành hỗ trợ sinh sản là 2-7 ngày [5], còn theo Hiệp hội Bắc Âu về Nam học (NAFA) và Hiệp hội sinh sản và phôi học người châu Âu (ESHRE), thời gian này là từ 3-4 ngày Trên thực tế, tiêu chuẩn trong thời gian kiêng xuất tinh còn nhiều tranh cãi và nhiều nghiên cứu mới

Trang 21

được thực hiện cho ta cái nhìn khác về khoảng thời gian kiêng xuất tinh phù hợp nhất với phương pháp điều trị

Từ khoảng năm 2011 đến nay, nhiều nghiên cứu đã đưa ra gợi ý về các khoảng thời gian khác nhau cho việc kiêng xuất tinh này Hướng đi mới của những nghiên cứu này tập trung so sánh chất lượng tinh trùng của các nhóm nam giới có khoảng thời gian kiêng xuất tinh dài (4 ngày, 3 đến 7 ngày,…) và nhóm kiêng xuất tinh ngắn (3 giờ, 4 giờ, 1 đến 3 giờ,…) [24] Do tính chất hợp lí cùa việc so sánh hai nhóm kiêng xuất tinh trên về việc sử dụng mẫu tinh dịch sao cho tránh khả năng bệnh nhân không có mẫu sử dụng trong kĩ thuật ICSI vào ngày thực hiện thủ thuật cũng như tiêu chí thời gian ICSI tối ưu trong khoảng 39-41 giờ sau thời điểm tiêm thuốc rụng noãn [23]

Các nghiên cứu hiện có xu hướng so sánh sự khác biệt của các chỉ số tinh dịch

đồ như thể tích, mật độ tinh trùng, độ di động, … của ít nhất hai nhóm tinh trùng có thời gian xuất tinh cách nhau từ 1 đến 4 giờ Theo Bashir và cộng sự, 2017 [13], nhóm tinh trùng thời gian kiêng xuất tinh ngắn (4 giờ) có thể tích tinh dịch, mật độ tinh trùng, tổng số tinh trùng di động thấp hơn so với nhóm kiêng xuất tinh 4 ngày; hình dạng tinh trùng bình thường không có sự khác biệt giữa hai nhóm Ngược lại, nhóm kiêng xuất tinh sau 4 giờ cho tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới cao hơn nhóm thời gian kiêng xuất tinh dài, tương tự ở các thông số động học như vận tốc cong, vận tốc đường thẳng, vận tốc trung bình Ngoài ra, Bahadur và cộng sự, 2016 [12], cũng cho kết quả việc kiêng xuất tinh từ 2- 7 ngày có tác động xấu đến chất lượng tinh trùng so với kiêng xuất tinh ngắn (ngay sau xuất tinh lần thứ nhất khoảng 30 phút) có ý nghĩa (p<0,001) trong cả tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường và tỷ lệ tinh trùng tiến tới nhanh Riêng thể tích tinh dịch từ lần xuất tinh thứ hai ít hơn rõ ràng so với lần xuất tinh đầu (1,1±1 ml và 2,7±1,8 ml, p<0,001) [12]; điều này ảnh hưởng trực tiếp đến tổng số tinh trùng

Một chỉ số đang được lưu ý hiện nay là độ phân mảnh của DNA nhân tinh trùng, đặc điểm phản ánh tính toàn vẹn về khả năng di truyền của tinh trùng, thứ dễ

bị tổn thương bởi việc tiếp xúc với các gốc oxy hóa tự do khi được vận chuyển qua các tuyến ống của cơ quan sinh sản Thông qua kỹ thuật SCD (sperm chromatin

Trang 22

dispersion) và sử dụng bộ kit Halosperm, năm 2020, Michael và cộng sự [24] cho ra kết quả nghiên cứu rằng độ phân mảnh DNA tinh trùng có cải thiện tích cực hơn đối với mẫu kiêng xuất tinh ngắn (3 giờ) so với mẫu kiêng xuất tinh dài (3 ngày) ở cả nhóm có chỉ số tinh dịch đồ bình thường và bất thường, cũng như trong nhóm đối tượng bệnh nhân có độ tuổi khác nhau Cụ thể, độ phân mảnh tinh trùng ở nhóm kiêng xuất tinh 3 ngày là 34,4% ± 18,7%, cao hơn so với nhóm kiêng xuất tinh ngắn (sau lần xuất tinh thứ nhất 3 giờ) là 24,0 ± 16,8% (p<0,0001)

Bên cạnh đó, một nghiên cứu của Manna và cộng sự năm 2020 [22] cũng cho kết quả như trên, với đối tượng bệnh nhân mang chẩn đoán tinh dịch đồ ít - yếu - dị dạng (OAT), mẫu kiêng xuất tinh ngắn (sau lần xuất tinh thứ nhất 1 giờ) có tỷ lệ tinh trùng tiến tới cao hơn (27,5% và 16,9%, p<0,001), tỷ lệ tinh trùng hình dạng bình thường nhiều hơn (15,6% và 13%, p<0,0001) mẫu xuất tinh lần thứ nhất (kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày) Trong đối tượng bệnh nhân có tinh dịch đồ bình thường, nhóm xuất tinh lần thứ hai cũng có tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường cao hơn (22,4% và 20,4%, p <0,01) và tỷ lệ phân mảnh DNA thấp hơn (13,6% và 14,8%; p<0,01), kết quả tương tự ở cả trước sau và sau quá trình xử lý tinh trùng bằng kỹ thuật swim-up

Tóm lại, ta có thể thấy kết quả của nhiều nghiên cứu về thời gian kiêng xuất tinh là khá tương đồng và khẳng định điểm tích cực của thời gian kiêng xuất tinh ngắn là tăng độ di động của tinh trùng, tăng số lượng tinh trùng có hình dạng bình thường, giảm độ phân mảnh DNA tinh trùng, kể cả giảm mức độ các loại phản ứng oxy hóa- ROS trong tinh dịch [33]; tuy nhiên, kiêng xuất tinh ngắn thường làm giảm thể tích tinh dịch và mật độ thu được từ đó làm giảm tổng số tinh trùng

1.4 Thụ tinh trong ống nghiệm

Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện để điều trị hiếm muộn cho các cặp vợ chồng có các chỉ định sau: tắc vòi trứng, bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng, lạc nội mạc tử cung, hiếm muộn không rõ nguyên nhân Ngoài ra, IVF còn được chỉ định cho các trường hợp xin noãn, chẩn đoán di truyền tiền làm tổ Kĩ thuật IVF bao gồm nhiều công đoạn Đầu tiên là kích thích buồng trứng để có nhiều noãn phát triển giúp tăng hiệu quả điều trị Sau đó, thực hiện chọc hút noãn dưới hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo Noãn người sau khi chọc hút được sẽ được nuôi cấy

Trang 23

với tinh trùng để thụ tinh tạo phôi Các chuyên gia phôi học sẽ tiếp tục theo dõi nuôi phôi trong điều kiện bên ngoài cơ thể Sau thời gian nuôi cấy phôi từ 2-5 ngày, phôi

sẽ được chuyển vào buồng tử cung Tùy theo giai đoạn phát triển của phôi, chất lượng phôi và tiên lượng thành công của bệnh nhân, bác sĩ thường quyết định cấy từ 1-3 phôi vào buồng tử cung, trong một số trường hợp đặc biệt, tối đa 5 phôi sẽ được đặt vào buồng tử cung Các phôi chất lượng tốt còn dư lại sẽ được đông lạnh để có thể sử dụng sau đó Phôi sau khi đặt vào buồng tử cung sẽ có thể làm tổ và phát triển thành thai nhi Khoảng 14 ngày sau cấy phôi, bệnh nhân có thể thử thai để biết kết quả Việc theo dõi thai kì và sinh đẻ của thai từ IVF hoàn toàn như một thai bình thường Tuy nhiên, tỉ lệ đa thai (hơn một thai) thường cao hơn đối với những trường hợp có thai từ IVF so với thai tự nhiên [27]

Hình 1.4 Hình ảnh kỹ thuật ICSI trong TTTON

Trang 24

Thụ tinh trong ống nghiệm IVF (In Vitro Fertilization) là một phương pháp đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản Cùng với sự tiến bộ của khoa học, IVF đang ngày càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới Năm

1978, em bé IVF - Louise Brown đầu tiên trên thế giới đã được ra đời [28] Đó cũng là mốc lịch sự đánh dấu sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật IVF Tuy nhiên, kỹ thuật IVF cổ điển chưa thực sự mang lại hiệu quả điều trị vô sinh cho các trường hợp thiểu năng tinh trùng Vì vậy, kỹ thuật vi thao tác (Micromanipulation) đã được nghiên cứu và ứng dụng nhằm cải thiện tỉ lệ thụ tinh giữa noãn và tinh trùng Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) là một trong những kỹ thuật vi thao tác, được thực hiện thành công đầu tiên trên thế giới vào năm

1992 Tỉ lệ có thai lâm sàng của kỹ thuật ICSI luôn cao hơn kỹ thuật IVF cổ điển Sự thành công này là một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam [31]

1.5 Quá trình phát triển phôi người

Sự phát triển phôi người là một quá trình phức tạp, bao gồm sự phân chia và biệt hóa của phôi ở gian đoạn sớm, sự hoạt hóa bộ gene của hợp tử, sự di chuyển và phát triển của phôi trong đường sinh dục nữ, sự tương tác giữa phôi với niêm mạc tử cung, cuối cùng là sự làm tổ của phôi trong buồng tử cung Để hình thành nên cá thể mới, quá trình này đòi hỏi sự phối hợp đồng bộ của nhiều yếu tố đến từ phôi và cơ thể người mẹ Còn trong TTTON, các chuyên viên phôi học đã quan sát và ghi nhận được những biến đổi cụ thể về hình thái của phôi người thông qua sự hỗ trợ của những trang thiết bị y tế hiện đại vào các thời điểm nhất định của quá trình nuôi cấy phôi nhân tạo Từ đó, chất lượng hình thái phôi người được đánh giá ở các thời điểm khác nhau theo thứ tự các giai đoạn phát triển của phôi: hợp tử, phôi phân chia, phôi nang

Hình 1.5 Hình ảnh các giai đoạn phát triển của phôi người

Trang 25

1.5.1 Giai đoạn hợp tử

Trong TTTON, sự thụ tinh được hỗ trợ nhân tạo bằng phương pháp IVF cổ điển hoặc ICSI Sau quá trình này, sự thụ tinh được đánh giá là thành công khi xuất hiện hai tiền nhân (PN) (Hình 1.5), một PN có nguồn gốc từ tinh trùng và một có nguồn gốc từ noãn Thời gian cả hai tiền nhân xuất hiện cùng lúc trong khoảng từ 16 đến 20 giờ sau khi có can thiệp thụ tinh nhân tạo Hai tiền nhân thường có kích thước xấp xỉ nhau Sự thụ tinh xảy ra khi các sợi vi ống trong thể sao kéo tiền nhân cái tới gần tiền nhân đực; tiền nhân đực di chuyển đến vị trí trung tâm của noãn, do đó tiền nhân thường nằm ở trung tâm noãn hoặc chỉ ở trong phần bán cầu có chứa thể cực thứ hai [7]

Hình 1.6 Hình ảnh hợp tử điển hình ở người

Tỉ lệ thụ tinh trong TTTON thường dao động từ 70-80%, và tồn tại các chu kì thất bại thụ tinh hoàn toàn, hay 100% noãn không thụ tinh [7] Có nhiều nguyên nhân quyết định tỉ lệ thụ tinh của một chu kỳ TTTON như: sự trưởng thành của noãn, khả năng hoạt hóa của noãn, đặc điểm thoi vô sắc, khả năng hoạt hóa noãn của tinh trùng, bất thưởng thể sao, sự cô đặc nhân tinh trùng, kĩ thuật ICSI của chuyên viên phôi học,

… Ngoài ra, các bất thường ở hợp tử cũng cần được ghi nhận như noãn sau thụ tinh chỉ có một hay đa tiền nhân (đa thụ tinh) Có nhiều cơ chế giải thích về đa thụ tinh như bất thường trong phân ly nhiễm sắc thể ở quá trình sinh giao tử, sự kết hợp nhiều tinh trùng trong một noãn, …, thông thường những hợp tử có >2 tiền nhân sẽ bị loại

bỏ để tránh các nguy cơ sẩy thai (Ma và cộng sự, 1995) [21]

Trang 26

1.5.2 Giai đoạn phôi phân chia

Số lượng tế bào

Phôi có tốc độ phân chia chậm hơn tốc độ mong đợi thường có khả năng làm

tổ thấp, những phôi có tốc độ phân chia nhanh hơn mong đợi thường có bất thường

về di truyền và cũng có khả năng làm tổ thấp Quan điểm đồng thuận về một phôi ngày 2 tốt (44±1 giờ sau cấy thụ tinh), thường có 4 phôi bào có kích thước bằng nhau, sắp xếp theo hình khối tứ diện trong cấu trúc không gian 3 chiều, với <10% phân mảnh bào tương; phôi ngày 3 tốt (68±1 giờ sau cấy thụ tinh) thường có 8 phôi bào có kích thước đều nhau, với <10% phân mảnh bào tương (Hình 1.7) [9] Tuy nhiên, tất cả chuyên gia đều đồng ý rằng, quan điểm này có thể thay đổi trong tương lai, phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy được thay đổi

có kích thước hợp lý với giai đoạn phát triển hay không

Mảnh vỡ bào tương (fragmentation)

Mảnh vỡ bào tương là một khối bào tương có màng bao, nằm ngoài tế bào, có kích thước <45μm đối với phôi ngày 2 và <40μm đối với phôi ngày 3 Các mức độ của mảnh vỡ bào tương bao gồm: nhẹ (<10%), vừa phải (10 – 25%) và nặng (>25%)

Trang 27

Giá trị % được tính dựa trên thể tích của phôi bào, ví dụ ở phôi 4 tế bào, 25% mảnh

vỡ bào tương sẽ tương đương với 1 phôi bào [9]

Đa nhân (multinucleation)

Đa nhân được ghi nhận khi trong phôi bào xuất hiện nhiều hơn 1 nhân Đồng thuận về đa nhân là sẽ làm giảm khả năng làm tổ, và những phôi có phôi bào đa nhân thường có tỉ lệ bất thường về nhiễm sắc thể cao và kết quả là nguy cơ sẩy thai tự phát tăng nếu những phôi này được chọn để chuyển Các chuyên gia đồng ý rằng việc đánh giá đa nhân nên được thực hiện vào ngày 2 (44±1 giờ sau cấy thụ tinh) và khi một phôi bào có từ hai nhân trở lên thì phôi đó được xem là phôi đa nhân [9]

Thông qua đồng thuận chung về đánh giá chất lượng phôi người năm 2011 [11] ta có các giai đoạn đánh giá phôi với xếp loại cụ thể

1.5.3 Giai đoạn phôi nang

Phôi nang được định nghĩa là phôi phát triển đến giai đoạn bao gồm 2 thành phần tế bào khác nhau (lớp tế bào lá nuôi-TE và khối tế bào nụ phôi-ICM) và một khoang phôi chứa dịch (Hình 1.8) Phôi người được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo, hoặc phát triển tự nhiên trong cơ thể, thường đạt đến giai đoạn phôi nang sau khi thụ tinh 5 ngày, điều này được áp dụng trong việc lựa chọn thời điểm đánh giá phôi nang là khoảng 116±1 giờ sau IVF cổ điển/ICSI [9]

Hình 1.8 Hình ảnh phôi nang điển hình ở người

Trang 28

Trong những năm gần đây, sự phát triển của điều kiện và môi trường nuôi cấy,

đã giúp cho việc nuôi cấy phôi nang tốt hơn, có thể đạt đến 66% phôi phát triển đến giai đoạn ngày 5 (phôi nang) cũng như tỉ lệ làm tổ cao hơn, đạt trên 50% (Gardner, 1998; Jones, 1998) [17, 19] Ưu điểm của chuyển phôi nang là phôi nang có khả năng làm tổ cao hơn, lựa chọn số lượng phôi chuyển ít hơn giúp giảm khả năng đa thai và các biến chứng đa thai so với phôi phân chia Điểm hạn chế của việc nuôi cấy phôi ngày 5 là nguy cơ không có phôi phát triển, bệnh nhân không có phôi hữu dụng để chuyển hay lưu trữ

1.6 Chất lượng di truyền của phôi và xét nghiệm di truyền phôi giai đoạn tiền làm tổ

Thành công trong quy trình hỗ trợ sinh sản phụ thuộc vào sự lựa chọn phôi chuyển Trong những thập niên trước, việc chọn lọc phôi, chuyển vào tử cung chủ yếu dựa vào tiêu chuẩn hình thái (các đặc tính biểu hiện và tốc độ phát triển của phôi) Tuy vậy, vẫn có nhiều trường hợp sảy thai dù những phôi chọn lọc có tiêu chuẩn hình thái tốt Nhiều nghiên cứu cho thấy khoảng 50% phôi từ IVF có bất thường lệch bội nhiễm sắc thể (NST) chính là nguyên nhân dẫn đến thất bại làm tổ và sảy thai sớm trong IVF Hầu hết các thể lệch bội do các sai hỏng trong quá trình giảm phân NST là một trong những nguyên nhân chính được ghi nhận gây thất bại làm tổ, sảy thai sớm, thai chết khi sinh, thậm chí không được lưu ý, làm ảnh hưởng đến kết cục tỉ lệ trẻ sinh sống trong hỗ trợ sinh sản

Thể dị bội là phổ biến và có thể được xem là bình thường ở giai đoạn phôi sớm vì bản thân mỗi tế bào đều có cơ chế sửa sai của nó; trong những lần phân cắt đầu tiên của phôi, tuỳ mức độ và loại dị bội sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển về sau Hơn 35% sảy thai tự nhiên và khoảng 4% thai chết khi sinh là do các sai hỏng về số lượng NST; chỉ có khoảng 0.3% là trẻ sinh sống [18] Ngoài ra, thể lệch bội có nguồn gốc từ mẹ và xu hướng tăng khi người mẹ càng lớn tuối Tuy nhiên, ngay cả ở những bệnh nhân trẻ tuổi hơn thì tỉ lệ lệch bội vẫn có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự thành công của chu kỳ IVF Điều này có thể ảnh hưởng đến thời gian, kinh tế, tinh thần và cảm xúc của bệnh nhân Phụ nữ < 35 hay ≥ 35 tuổi sảy thai chủ yếu vẫn là do phôi bị bất thường NST và cho dù sảy thai sau có thai tự nhiên hay sau TTTON thì nguyên nhân

Trang 29

sảy thai chủ yếu vẫn là do bất thường NST Phụ nữ ≥ 35 tuổi sảy thai có tỉ lệ bất thường NST cao hơn phụ nữ < 35 tuổi, do càng lớn tuổi thì tỉ lệ noãn bất thường càng tăng [29] Sảy thai sau TTTON có tỉ lệ bất thường NST thấp hơn, có thể do việc chọn lựa phôi để cấy vào tử cung đã giúp loại bớt phôi bất thường Ở những trường hợp sảy thai liên tiếp, tần suất xuất hiện bất thường NST khoảng 5% với hai hoặc nhiều hơn hai lần sảy thai; 1-2% với ba hoặc nhiều hơn ba lần sảy thai [25] Gần 30% phôi của phụ nữ trên 40 tuổi mang thể lệch bội, tăng lên gần 50% ở tuổi trên 43 và gần như 100% sau 45 tuổi

Với kỹ thuật xét nghiệm di truyền phôi giai đoạn tiền làm tổ, việc sàng lọc để loại bỏ phôi mang thể lệch bội là rất cần thiết cho các nhóm đối tượng bệnh nhân trên, nhằm tầm soát để đảm bảo chỉ có phôi nguyên bội được chuyển vào lại tử cung trong điều trị IVF Kỹ thuật xét nghiệm di truyền phôi giai đoạn tiền làm tổ “không” tạo ra phôi khoẻ mạnh và tăng chất lượng phôi Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định chính xác phôi có bộ NST bình thường để chuyển vào buồng tử cung, giảm thời gian điều trị, giảm rủi ro sảy thai [16] Bên cạnh đó, việc sảng lọc di truyền tiền làm tổ trong IVF còn góp phần không nhỏ vào việc nâng cao tỉ lệ làm tổ của phôi

1.7 Tình hình nghiên cứu về mối liên quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng phôi người

Từ các nghiên cứu về mối liên quan giữa thời gian kiêng xuất tinh và chất lượng tinh trùng, câu hỏi tiếp tục được đặt ra là ảnh hưởng của thời gian kiêng xuất tinh ngắn có ảnh hưởng như nào tới chất lượng phôi trong TTTON Chất lượng phôi được quan tâm ở đây là chất lượng hình thái, tỉ lệ tạo phôi nang, và đặc biệt là tỷ lệ phôi chỉnh bội được tạo thành từ thời gian kiêng xuất tinh ngắn

Hiện trên thế giới có bốn nghiên cứu được ghi nhận về việc so sánh tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng kiêng xuất tinh ngắn và kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày, theo đó tỉ lệ thụ tinh được tính là tỉ lệ giữa số lượng tế bào trứng thụ tinh chia cho số lượng tế bào trứng tham gia tạo phôi Phân tích thống kê tổng hợp của Barbagallo và cộng sự (2023) trên bốn nghiên cứu đã cho thấy không có thay đổi đáng kể nào về tỉ lệ thụ tinh ở nhóm kiêng xuất tinh ngắn (OR 1,05; 0,67- 1,64; p = 0,03) và do đó, mô hình

Trang 30

ngẫu nhiên đã được sử dụng Kết quả cho thấy, không có bằng chứng nào về sai lệch

xuất bản, được tính toán qua thử nghiệm của Egger (p = 0,11) [38]

Một nghiên cứu khác của Barbagallo và cộng sự vào năm 2021 [37] thực hiện trên nhóm 90 bệnh nhân nam giới có kết quả tinh dịch đồ thiểu tinh nặng đã kết luận rằng tỉ lệ thụ tinh giữa hai nhóm kiêng xuất tinh là tương tự nhau, do khác biệt không

có ý nghĩa thống kê (90% và 92%; p= 0,3) Tuy nhiên nhóm kiêng xuất tinh ngắn có

tỉ lệ tạo phôi chất lượng tốt cao hơn đáng kể so với nhóm kiêng xuất tinh truyền thống (72,5% và 54,3%, p = 0,003) Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy tỉ lệ có thai lâm sàng của nhóm kiêng xuất tinh ngắn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm còn lại lần lượt là 31% và 20%, p = 0,001 Từ đó, tác giả đã kết luận rằng lần xuất tinh thứ hai sau một thời gian rất ngắn (khoảng một giờ) so với lần xuất tinh đầu tiên

có thể là một chiến lược đơn giản và hữu ích để thu tinh trùng có thông số tốt hơn và cải thiện kết quả điều trị hỗ trợ sinh sản ở những bệnh nhân có thông số tinh dịch đồ bất thường, yếu, kém

Năm 2019, nghiên cứu của Scarselli và cộng sự [26] cho thấy tinh trùng thu được từ lần xuất tinh thứ hai (ngay sau 1 giờ của lần xuất tinh thứ nhất) có tỉ lệ tinh trùng đã trưởng thành nhiễm sắc thể cao hơn (58,3% và 35,6%), và cho kết quả khả quan hơn ở tỉ lệ tạo phôi nang ngày 5 (47,3% và 43,1%), đặc biệt tỉ lệ phôi chỉnh bội cao hơn có ý nghĩa thống kê (43,6% và 27,5%, p = 0,043) so với lần xuất tinh thứ nhất (có thời gian kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày) Tuy nhiên, khi đánh giá về tỉ lệ thụ tinh thì kết quả là chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm kiêng xuất tinh này

Kết quả tương tự được thể hiện ở bài báo cáo poster của Nguyễn Phan Cẩm Trang và cộng sự tại hội nghị IVF experts 2020 [8] khi tỷ lệ phôi chỉnh bội có xu hướng cao hơn ở mẫu kiêng xuất tinh ngắn (xuất tinh sau lần thứ nhất ít nhất 1 giờ), cũng như tỷ lệ phôi nang tốt cao hơn so với nhóm kiêng xuất tinh dài ngày (2-7 ngày) Với cỡ mẫu lớn hơn, kết quả của nghiên cứu có thể được áp dụng nhằm nâng cao chất lượng phôi về hình thái cũng như chất lượng di truyền trong hỗ trợ sinh sản

Trang 31

Bên cạnh đó, các chỉ số khác đánh giá tiềm năng khác về chất lượng phôi là tỉ lệ làm tổ của phôi (được tính bằng số lượng túi phôi được xác định trên siêu âm chia cho số lượng phôi được chuyển) và tỉ lệ thai lâm sàng (là bằng chứng số ca siêu âm

có nhịp tim thai nhi trong tử cung ở tuần thứ 7 chia cho số chu kỳ chuyển phôi) Các nghiên cứu của Ciotti, Shen và cộng sự đã báo cáo phân tích cho thấy sự cải thiện đáng kể về mặt thống kê về các tỉ lệ trên ở nhóm bệnh nhân sử dụng tinh trùng kiêng

xuất tinh ngắn (OR 1,70 (1,26- 2,21); p = 0,0006) [35, 41]

Những nghiên cứu về tác động của thời gian kiêng xuất tinh ngắn chưa nhiều với số lượng phôi nghiên cứu còn ít, nên cần có nhiều hướng tiếp cận và nghiên cứu sâu để đi đến các khẳng định rõ ràng hơn về vấn đề này, từ đó chúng ta có thể hi vọng phát triển những phương pháp điều trị vô sinh mới hiệu quả hơn

Trang 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

112 mẫu tinh trùng tươi từ 56 bệnh nhân nam hiếm muộn dưới 40 tuổi, vô sinh

do yếu tố nam giới hoặc không rõ nguyên nhân dược chỉ định TTTON Mỗi bệnh nhân cung cấp đủ hai nhóm mẫu tinh trùng từ:

- Lần xuất tinh thứ nhất- đã kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày (theo WHO 2010);

- Và lần xuất tinh thứ hai- sau lần xuất tinh thứ nhất ít nhất 1 giờ và nhiều nhất 3 giờ

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 05/2023 đến tháng 11/2023

Địa điểm nghiên cứu: Khoa Hỗ Trợ Sinh Sản, Bệnh Viện Sản Nhi Quảng Ninh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu thuần tập

Thiết kế dựa theo nghiên cứu của Scarselli và cộng sự năm 2019 [26]:

- Vợ chồng bệnh nhân sau khi được tư vấn đầy đủ và chấp nhận tham gia nghiên cứu Người chồng sẽ cung cấp đủ hai mẫu tinh trùng từ lần xuất tinh thứ nhất- đã kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày và lần xuất tinh thứ hai - sau lần xuất tinh thứ nhất (ít nhất 1 giờ và nhiều nhất 3 giờ) Trong khi đó, người vợ được kích thích buồng trứng, chọc hút noãn Sau đó, số noãn trưởng thành của người vợ được chia đều và tạo phôi bằng kỹ thuật ICSI từ hai nhóm tinh trùng trên của người chồng; sự phát triển của phôi tạo thành từ 2 nhóm này được theo dõi và phân tích độc lập trong cùng điều kiện nuôi cấy

- Hai nhóm phôi nuôi cấy sẽ được ghi nhận chất lượng phôi vào thời điểm ngày thứ nhất (phôi thụ tinh), ngày thứ ba (phôi phân chia) và ngày thứ năm (phôi nang)

- Đối với các trường hợp bệnh nhân có chỉ định sàng lọc phôi tiền làm tổ, phôi của bệnh nhân sẽ được tiến hành sinh thiết và giải trình tự di truyền các phôi bào

Trang 33

- Đối với các trường hợp bệnh nhân tiến hành chuyển phôi, bệnh nhân sẽ được hẹn làm các xét nghiệm và siêu âm theo dõi thai kì tại các thời điểm thai 7 tuần, 12 tuần và thai sinh sống

= 1,96 nếu xác suất sai lầm loại 1 = 5% và kiểm định 2 phía)

80%)

• P1: Tỷ lệ phôi nang chất lượng tốt trong nhóm kiêng xuất tinh ngắn

• P2: Tỷ lệ phôi nang chất lượng tốt trong nhóm kiêng xuất tinh dài

• 𝑃̅ = (P1+P2)/2: Tỷ lệ trung bình của 2 nhóm

Dự kiến cỡ mẫu:

Trang 34

2.3.3 Các bước tiến hành

Kiêng xuất tinh dài Kiêng xuất tinh ngắn

Thu thập và xử lý số liệu

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thực hiện trong nghiên cứu

Trang 35

Bước 1: Thăm khám và chẩn đoán nguyên nhân hiếm muộn, phân loại nhóm bệnh nhân theo tiêu chuẩn lựa chọn của nghiên cứu

Thực hiện các xét nghiệm cơ bản đánh giá khả năng sinh sản của nguời vợ và chồng

Các thăm dò bắt buộc cho người vợ:

- Siêu âm đếm số nang noãn thứ cấp

- AMH, Prolactin ngày bất kỳ chu kỳ kinh

- FSH cơ bản ngày có kinh thứ 2

- HSG sau sạch kinh 2-4 ngày

Các thăm dò bắt buộc cho người chồng:

- Tinh dịch đồ

Bước 2: Kích thích buồng trứng

- Siêu âm đường âm đạo ghi nhận tình trạng hai buồng trứng, số nang noãn thứ cấp Chỉ định uống hoặc tiêm các liều FSH phù hợp cho đến ngày siêu âm xuất hiện các nang noãn trội >12 mm

- Tiêm thuốc kích thích rụng trứng (trigger) bằng hCG

- Lấy máu xét nghiệm Estradiol, LH, Progesterone tại thời điểm trigger

Bước 3: Chọc hút noãn

- Chọc hút sau trigger 36 giờ tại phòng thủ thuật

- Bệnh nhân nằm tư thế phụ khoa, gây mê đường tĩnh mạch, vệ sinh cơ quan sinh dục Siêu âm đầu dò âm đạo khảo sát hai buồng trứng

- Gắn kim chọc hút noãn, tiến hành chọc hút dịch nang từng nang noãn bằng tay dưới chỉ dẫn siêu âm

- Chuyển ống nghiệm chứa dịch nang noãn cho phòng Labo IVF để tìm noãn

Trang 36

Bước 4: Tách noãn và đánh giá chất lượng noãn

- Labo IVF nhận ống nghiệm chứa dịch nang noãn Bơm dịch nang noãn vào đĩa peptri, tìm và nhặt phức hợp noãn-tế bào hạt (OCC) dưới kính hiển vi soi nổi trong tủ thao tác vô trùng

- Hút chuyển OCC sang đĩa rửa, tiến hành rửa, đánh giá sơ bộ OCC, nuôi cấy OCC

- Sau trigger ít nhất 39 giờ tiến hành tách khối OCC bằng môi trường chứa enzyme Hyaruronidase bằng đầu côn để loại bỏ hết tế bào hạt bao quanh noãn, đánh giá chất lượng noãn và sự trưởng thành noãn

Bước 5: Chuẩn bị tinh trùng

- Hỏi bệnh nhân nam thời gian kiêng xuất tinh và ghi nhận; Phát lọ chứa mẫu và hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu xuất tinh lần thứ nhất

- Sau ít nhất 1 giờ để bệnh nhân được hồi phục tâm lý và thể lực, nhân viên y tế xin

ý kiến và giải thích bệnh nhân về nghiên cứu, nếu bệnh nhân đồng ý thì tiếp tục hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu xuất tinh lần hai Thời gian tối đa cho việc lấy mẫu tinh trùng xuất tinh lần 2 là không quá 5 giờ vì sẽ ảnh hưởng đến thời gian tối ưu cho tạo phôi (39-41 giờ sau trigger)

- Hai nhóm tinh trùng được lấy theo phương pháp tự nhiên, ghi nhận thời gian nhận

Đọc và ghi nhận đặc điểm tinh dịch đồ truớc lọc rửa (mật độ tinh trùng, thể tích tinh dịch, tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới, bất động)

- Thực hiện lọc tinh trùng theo phương pháp thang nồng độ với môi truờng lọc tinh trùng có nồng độ các hạt Silica 90% và 45% Ly tâm lấy tinh trùng, tốc độ và thời gian ly tâm tùy thuộc loại mẫu và chất luợng mẫu tinh trùng, thông thuờng 1200 vòng/phút trong 10 phút Rửa tinh trùng trong môi truờng rửa chuyên dụng Ly tâm lấy tinh trùng, tốc độ và thời gian ly tâm là 1200 vòng/phút trong 10 phút Tiếp tục thực hiện phương pháp swim-up với cặn tinh trùng thu được sau rửa cho đến khi tiến hành tạo phôi

Trang 37

Bước 6: Tạo phôi trong ống nghiệm

- Load hai nhóm tinh trùng vào lần lượt hai đĩa tạo phôi khác nhau của cùng 1 bệnh nhân, có kiểm tra đối chiếu giữa ít nhất hai chuyên viên phôi học

- Đĩa thao tác tạo phôi và đĩa nuôi cấy phôi đã đuợc chuẩn bị truớc đó tối thiểu 6 giờ trong 37ºC, 5% O2, 6% CO2

- Chia đều số lượng noãn trưởng thành làm hai nửa cho tạo phôi với lần lượt hai nhóm tinh trùng

- Quan sát, bất động tinh trùng Hút tinh trùng vào kim vi tiêm

- Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

- Chuyển noãn đã tiêm tinh trùng vào tủ thao tác để rửa và chuyển vào đĩa nuôi cấy phôi đã chuẩn bị sẵn

- Ghi chú vị trí noãn sau tạo phôi với từng nhóm tinh trùng để tiếp tục theo dõi

Bước 7: Theo dõi và ghi nhận sự phát triển của phôi

- Sau tạo phôi khoảng 17-20 giờ, ghi nhận sự thụ tinh

- Sau tạo phôi 3 ngày/ 5 ngày/ 6 ngày, đánh giá phôi theo đồng thuận năm 2011 [11] được thể hiện trong bảng 2.1 và 2.2, ghi nhận chất lượng phôi

Bảng 2.1 Bảng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng hình thái phôi phân chia ngày 3

Trang 38

Hạ 1 bậc xếp loại

Bảng 2.2 Bảng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng hình thái phôi nang ngày 5

Độ 1: khoang <50% thể tích phôi bào

Độ 2: phôi nang sớm, khoang ≥ 50%, ICM và TE thấy rõ

Độ 3: phôi nang hoàn chỉnh, khoang chiếm đầy thể tích phôi

Độ 4: phôi nang nở rộng, màng ZP mỏng dần

Độ 5: phôi nang đang thoát màng <50%

Độ 6: phôi nang thoát màng hoàn toàn

ICM

Độ A: có nhiều tế bào, các tế bào nén chặt

Độ B: nhiều tế bào, các tế bào liên kết lỏng lẻo

Độ C: có ít tế bào

Độ D: rất ít hoặc không thấy

TE

Độ A: nhiều tế bào, hình thành một lớp tế bào dính liền

Độ B: ít tế bào, hình thành một lớp lỏng lẻo

Độ C: rất ít các tế bào lớn

Độ D: rất ít (2-3 tế bào TE) hoặc không thấy

Trang 39

Bước 8: Sinh thiết phôi và xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (nếu có chỉ định)

- Đối với các ca có chỉ định xét nghiệm di truyền tiền làm tổ, thực hiện sinh thiết phôi

- Thông báo chất lượng phôi N5/N6 Cấp mã di truyền và chuẩn bị tất cả các dụng cụ vô khuẩn cho số lượng sinh thiết phôi theo yêu cầu

- Lắp kim giữ phôi và kim sinh thiết vào hệ thống vi thao tác Load phôi vào đĩa sinh thiết

- Sinh thiết: Chỉnh kim giữ phôi cố định, đặt ICM ở vị trí 6 giờ hoặc 12 giờ Sử dụng tia laser để làm thủng 1 lỗ trên màng trong suốt của phôi, rồi dùng kim sinh thiết hút lấy 4-6 tế bào TE Tiếp tục sử dụng laser bắn các điểm yếu và làm đứt phần tế bào

TE

- Rửa tế bào: rửa tế bào trong môi trường rửa tế bào chuyên dụng để rửa bớt DNA tự

do, sau đó cho tế bào vào tube eppendorf 200µl Bảo quản phôi bào trong điều kiện từ 2-8ºC trong 24 giờ, hoặc -25 ºC trên 24 giờ

- Bàn giao tế bào TE cho Labo Di truyền tiến hành xét nghiệm di truyền phôi giai

đoạn tiền làm tổ

Bước 9: Giải trình tự genome

Tại Labo di truyền, các tế bào sinh thiết được khuếch đại toàn hệ gen để tạo ra hàng triệu bản copy từ vài phân tử DNA ban đầu Sau đó sản phẩm sẽ chuyển qua giai đoạn chuẩn bị thư viện bao gồm hàng loạt các kỹ thuật sinh học phân tử với mục đích tạo ra các đoạn DNA được đánh dấu nhận dạng, thuần khiết và đồng đều về nồng

độ Tiếp theo, sản phẩm của bước chuẩn bị thư viện được đưa vào máy giải trình tự gen thế hệ mới Miseq Dx, Illumina, Mỹ Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng Bluefue Multi

2.3.4 Các tham số nghiên cứu

Đặc điểm của mẫu tinh trùng

- Thể tích tinh dịch

- Mật độ tinh trùng

Trang 40

- Tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới

- Tỉ lệ tinh trùng di động không tiến tới

- Tỉ lệ tinh trùng bất động

Đặc điểm của phôi

- Tỉ lệ thụ tinh = số noãn thụ tinh bình thường x100%/ số noãn tham gia ICSI

- Chất lượng phôi phân chia ngày 3 đánh giá qua hình thái: loại tốt, loại khá, loại xấu

- Chất lượng phôi nang đánh giá qua hình thái: loại tốt, loại khá, loại xấu

Số lượng phôi tốt = phôi loại tốt + phôi loại khá

- Tỉ lệ tạo phôi nang = số phôi nang hữu dụng x100%/ tổng số noãn thụ tinh bình thường

Noãn thụ tinh bình thường có chính xác 2 tiền nhân vào thời điểm 17±1 sau ICSI

- Tỉ lệ tạo phôi nang tốt = số phôi nang loại tốt và loại khá x100%/ tổng số noãn thụ tinh bình thường

- Tỉ lệ phôi chỉnh bội = số phôi chỉnh bội x100%/ tổng số phôi tham gia xét nghiệm

di truyền lệch bội tiền làm tổ (PGT)

- Tỉ lệ phôi lệch bội = số phôi lệch bội x100%/ tổng số phôi tham gia PGT

- Tỉ lệ phôi khảm = số phôi khảm x100%/ tổng số phôi tham gia PGT

2.4 Xử lý số liệu

Các số liệu được thu thập và xử lý theo các phương pháp thống kê trong y sinh học bằng phần mềm SPSS 22.0, sử dụng phân tích tương quan Pearson và Chi-square test Tỉ suất chênh OR (CI 95%) đánh giá nguy cơ với p < 0,05 có ý nghĩa thống kê

2.5 Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các quy định, nguyên tắc về đạo đức nghiên cứu y sinh học của Việt Nam

Tiêu đề	Đánh giá mối tương quan giữa thời gian kiêng xuất tinh ngắn và chất lượng phôi người
Tác giả	Vũ Thu Hằng
Người hướng dẫn	TS. Đào Thị Hồng Vân
Trường học	Trường Đại học Mở Hà Nội
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	Luận văn Thạc sĩ
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	83
Dung lượng	11,05 MB